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方法文章

聚合酶链式反应和点杂交技术用于水样中Leptospira的检测

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DOI：

10.3791/65435

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2024年6月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

本文内容

摘要

本研究设计了一种点印迹法，用于检测水样中三个主要进化枝的Leptospira。该方法可特异性识别地高辛标记探针所靶向的极微量DNA，并通过抗地高辛抗体实现便捷检测。该技术是一种用于筛查的有效且令人满意的工具。

摘要

点印迹（dot-blot）是一种简单、快速、灵敏且用途广泛的检测技术，可在载体DNA存在的情况下，通过探针杂交特异性地鉴定极微量的目标DNA。该技术基于将已知量的DNA直接转移至惰性固相支持物（如尼龙膜）上，使用点印迹装置完成，无需电泳分离。尼龙膜具有高核酸结合能力（400 µg/cm2）、高强度，且可带正电荷或中性电荷。所用探针为一段长度为18至20个碱基、用地高辛（DIG）标记的高度特异性单链DNA（ssDNA）片段，该探针可与Leptospira DNA发生结合。当探针与目标DNA杂交后，通过抗地高辛抗体进行检测，并在X光胶片上显示其发出的信号，从而实现简便检测。出现信号的斑点即对应所关注的DNA片段。本方法采用非同位素标记探针，其半衰期极长。这种标准免疫标记法的缺点是灵敏度低于同位素探针，但通过将聚合酶链式反应（PCR）与点印迹检测联用，可有效弥补这一不足。该联合方法可实现目标序列的富集与检测。此外，在与已知浓度标准品的系列稀释液进行比较时，该方法还可用于定量分析。本文介绍了一种用于检测水样中来自三个主要进化枝的Leptospira的点印迹应用。一旦水样通过离心浓缩，该方法即可用于大量水样的检测，以确认是否存在钩端螺旋体DNA。该技术是一种有效且可靠的通用筛查工具，也可用于检测水中其他不可培养的细菌，有助于加深对水生生态系统的理解。

引言

人类中的钩端螺旋体病主要来源于环境1,2. 存在 钩端螺旋体 在湖泊、河流和溪流中的存在是野生动物以及家养和养殖动物之间传播钩端螺旋体病的指示指标，这些动物可能最终会与这些水体接触1,3,4此外， 钩端螺旋体 已在非天然来源中发现，包括污水、静止水和自来水5,6.

Leptospira 是一种在全球范围内分布的细菌7,8，其在环境中的保存和传播作用已被广泛认识。Leptospira 可在不同 pH 和矿物质条件下存活于饮用水中9，也可存在于自然水体中1。它还能在蒸馏水中长期存活10，在恒定 pH（7.8）条件下可存活长达 152 天11。此外，Leptospira 可通过与其他细菌形成菌群协作，以应对恶劣环境12,13。它可能与 Azospirillum 和 Sphingomonas 共同构成淡水中的生物膜，甚至能够在超过 49 °C 的温度下生长和存活14,15。它也可在积水土壤中增殖，并保持活性长达 379 天16，致病能力可持续达一年之久17,18。然而，关于其在水体内的生态特征及其在其中的分布方式，目前仍知之甚少。

自从发现以来，对Leptospira属的研究一直基于血清学检测。直到本世纪，分子生物学技术才在该螺旋体的研究中变得更为普遍。点印迹法（dot-blot）在该属鉴定中的应用较少，仅见于以下几种情况：(1) 使用基于16S rRNA和简单重复序列间区（ISSR）的同位素探针19,20；(2) 采用基于纳米金的免疫检测法，用于人钩端螺旋体病尿液样本的检测21；或(3) 基于抗体的检测法用于牛尿样本22。该技术之所以逐渐被弃用，是因为最初依赖同位素探针。然而，点印迹法是一种广为人知的技术，若与PCR联用可显著提高检测灵敏度，并且由于使用非同位素探针而更加安全。PCR在富集Leptospira DNA方面起着关键作用，它能够扩增样本中痕量存在的特异性DNA片段。在每一轮PCR循环中，目标DNA片段的数量在反应体系中倍增。反应结束时，扩增产物的数量可增加超过一百万倍23。PCR扩增的产物通常在琼脂糖凝胶电泳中不可见，但通过与DIG标记的探针在点印迹中进行特异性杂交后即可被检测到24,25,26。

点印迹技术操作简便、结果可靠，适用于大量样本，便于资源有限的实验室开展。该技术已广泛应用于多种细菌研究，包括：（1）口腔细菌27；（2）其他样本类型，如食品和粪便28；以及（3）不可培养细菌的鉴定29，其结果通常与其他分子技术一致。点印迹技术的优势包括：（1）膜具有高结合容量，可结合超过 200 μg/cm2 的核酸，最高可达 400 μg/cm2；（2）结果可直接肉眼判读，无需特殊设备；（3）可在室温（RT）下长期保存数年。

钩端螺旋体属（Leptospira）已被分为致病性、中间性和腐生性三个进化分支30,31。这些进化分支之间的区分可通过特定基因（如 lipL41、lipL32 和 16S rRNA）进行。lipL32 存在于致病性进化分支中，在多种血清学和分子检测技术中表现出高敏感性，而在腐生性物种中则缺失21。管家基因 lipL41 因其表达稳定，常用于分子检测技术32，而 16S rRNA 基因则被用于分类学鉴定。

该方法适用于经离心浓缩后的大量水样。它可用于检测水体中不同位置和深度的钩端螺旋体DNA及其所属进化分支。该工具在生态学研究和常规筛查中均具有重要价值，也可用于检测水中存在的其他不可培养细菌。

此外，PCR 和点印迹检测在技术上和经济上对大多数实验室而言都是可行的，即使缺乏复杂或昂贵的设备也能开展。本研究旨在应用基于地高辛的点印迹法，对从自然水体采集的水样中三种 Leptospira 进化枝进行鉴定。

细菌菌株
十二 钩端螺旋体 血清型（Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi 和 Wolffi）被纳入本研究。这些血清型保存于墨西哥国立自治大学兽医与动物科学学院微生物学与免疫学系，目前用于显微凝集试验（MAT）。

所有Leptospira血清型均在EMJH培养基中培养，并使用商业DNA提取试剂盒提取其DNA（参见材料表）。将12种血清型的基因组DNA混合物用作致病性Leptospira进化枝的阳性对照。中间型Leptospira进化枝的阳性对照包括Leptospira fainei血清型Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA，而腐生型Leptospira进化枝的阳性对照则包括Leptospira biflexa血清型Patoc菌株Patoc I的基因组DNA。

阴性对照包括空质粒以及非相关细菌的DNA解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、流产布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 和 大肠杆菌），以及 PCR级水，作为无模板对照。

水样
采用分层随机采样方法，从库埃曼科生物与水产养殖研究中心（CIBAC）（北纬19° 16' 54"，西经99° 6' 11"）采集了12个试验性瞬时水样。这些样品分别在三个深度获取：表层、10 cm和30 cm（图1A，B）。水样采集过程未对任何濒危或受保护物种造成影响。每个样品均采集于无菌的15 mL 微量离心管中。采样时，将每支离心管轻轻浸入水中，在选定深度处灌满后立即密封。样品在22 °C条件下保存，并迅速运送至实验室进行处理。

每个样品均在无菌的1.5 mL微量离心管中，于室温下以8000 × g 离心20分钟进行浓缩。重复此步骤，直至所有样品均浓缩至同一管中，随后用于DNA提取（图1C）。

水样分析；DNA提取方法示意图；离心浓缩过程。
图1：通过离心法浓缩水样。（A）水样采集池塘，以及（B）自然溪流。（C）基于离心的水样处理流程，可根据需要重复进行多次（n）。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA 提取
根据制造商说明书，使用商业基因组 DNA 试剂盒提取总 DNA（参见材料表）。DNA 提取物用 20 µL 洗脱缓冲液洗脱，通过紫外分光光度计在 260–280 nm 处测定 DNA 浓度，并在 4 °C 保存至使用。

PCR 扩增
PCR靶标为16SS rRNA、lipL41 和 lipL32 基因，用于鉴定属水平的 DNA 钩端螺旋体 并能够区分三个进化分支：致病性、腐生性及中间型. 引物和探针的设计均基于Ahmed等、Azali等、Bourhy等以及Weiss等先前的研究工作。.，以及 Branger 等人33,34,35,36,37每种探针、引物及扩增片段的序列均在文中描述。 表1，以及它们与参考序列的比对结果如下所示 补充文件 1, 补充文件 2, 补充文件 3, 补充文件 4，以及 补充文件 5PCR 试剂和热循环条件详见方案部分。

扩增产物通过在TAE（40 mM Tris碱，20 mM乙酸，1 mM EDTA；pH 8.3）缓冲液中进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，在60 V条件下电泳45分钟，并用溴化乙锭染色检测，结果如图所示 补充图1. 各血清型获得的基因组DNA使用浓度范围为6 x 106 至 1 × 104 每个PCR反应中的基因组当量拷贝数（GEq），基于该物种的基因组大小 L. interrogans (4,691,184 bp)38 致病性 钩端螺旋体，基因组大小为 L. biflexa (3,956,088 bp)39 用于腐生的 钩端螺旋体，以及基因组大小 L. fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6（4,267,324 bp），登录号 AKWZ00000000.2。

在每次实验中，使用每种致病性血清型、 L. biflexa 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 以及 L. fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 的 DNA 评估探针的灵敏度。为评估 PCR 和点杂交检测的特异性，实验中还包含了非相关细菌的 DNA。

表1：用于扩增产物以鉴定致病性、腐生性和中间型钩端螺旋体属（Leptospira）进化枝的PCR引物和探针。 请点击此处下载该表格。

点印迹杂交实验
该技术被称为点印迹，是因为将DNA样本加入的孔呈点状，当通过真空抽吸使其固定在膜上时，样本即形成点状。该技术由Kafatos等人40建立。该方法可用于对每个PCR阳性样本中的Leptospira进行半定量分析。实验步骤包括使用0.4 M NaOH在室温下进行变性处理，将含有30 ng至0.05 ng Leptospira DNA的样本（相当于6 × 106至1 × 104个钩端螺旋体）通过96孔点印迹装置点样至尼龙膜上。DNA经固定后，通过120 mJ的紫外光照射使其共价结合于膜上。每条DNA探针均在3'端通过末端转移酶催化反应连接上地高辛-11-dUTP（地高辛是一种从Digitalis purpurea中提取的植物类固醇，用作报告分子41）。标记后的DNA探针（50 pmol）在特异性温度下与目标DNA进行严格杂交后，利用抗地高辛碱性磷酸酶抗体与其底物CSPD共价结合，通过化学发光反应检测DNA杂交产物。发光信号通过X射线胶片记录（图2）。

DNA提取和PCR流程图；过程：浓度测定、杂交、化学发光检测。
图2：PCR-点杂交检测实验步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 样品制备

  1. 在4 °C条件下，以8,000 × g离心10分钟，将每份水样在1.5 mL微量离心管中浓缩。根据需要重复此步骤，直至样品体积浓缩至250 µL。
  2. 按照制造商说明书使用DNA提取试剂盒（见材料表）。
  3. 根据将使用的点杂交探针进行特异性PCR（表1）。
    1. 在PCR管中进行扩增，总体积为25 µL，包含1×缓冲液、2.5单位Taq DNA聚合酶、每种引物1 µM、每种dNTP 0.2 mM、MgCl2 1.5 mM，以及来自每份水样或参考基因组DNA的100 ng目标DNA。
    2. 根据热循环条件（表2）在热循环仪中设置PCR程序。
    3. 将反应产物储存于4 °C，待用。
  4. 将每份待杂交的PCR产物各取10 µL，分别加入96孔板的不同孔中。
  5. 向每个孔中加入40 µL TE缓冲液，并用移液器吹打混匀。
    注意：96孔板可密封后在4 °C保存过夜。请参照补充文件6中的说明配制本方案所需的缓冲液和溶液。图3展示了样品制备的步骤。

表2：16S、lipL41 和 lipL32 基因的PCR扩增循环条件。 请点击此处下载该表格。

PCR样品制备示意图；PCR反应产物转移至孔板；移液、TE缓冲液添加。
图3：PCR及样品制备。 根据特定的PCR方案，将PCR产物转移至微孔板中，并向每个孔中加入40 µL的TE缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 组装点印迹装置

注意：点印迹装置的组装过程如图4所示。操作过程中需佩戴手套以接触碱性溶液，并防止尼龙膜受到污染。

点印迹装置示意图，显示尼龙膜、10X SSPE 浸泡、PCR 准备及 TE 洗涤步骤。
图 4：点印迹装置的组装。 滤纸和尼龙膜（预先用 10× SSPE 湿润）必须按正确顺序放置。在施加真空前，需用螺丝将装置紧密固定。每个孔需用 TE 缓冲液洗涤，然后将 PCR 产物加入相应的孔中。PCR 产物通过膜转移后，每个孔再次用 TE 缓冲液洗涤，并让其自然干燥。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将尼龙膜（参见材料表）和滤纸裁剪成 12 × 8.5 cm 大小的片状。
  2. 用永久性记号笔在膜上做标记。
  3. 用剪刀在膜的一侧边缘剪出一个缺口，以指示正确的方向。使用标记记录样品顺序。
  4. 用 10 × 盐-磷酸钠-EDTA 缓冲液（SSPE；3 M NaCl、0.2 M NaH2PO4 和 0.02 M EDTA，pH 7.4）（补充文件 6）润湿膜和滤纸。使用洁净的钝头镊子操作膜。
  5. 组装点印迹装置：先放置滤纸，再将膜覆盖在塑料密封圈上。以对角方式拧紧螺丝固定盖子。
  6. 将装置连接至真空泵，在每个孔中加入 100 µL TE 缓冲液，维持真空 1 分钟，然后关闭真空。
  7. 开启低速真空，将每份样品 50 µL 加入点印迹装置膜上对应的孔中（按照预先确定的膜分布顺序）。
    注意：在将样品加入点印迹装置前，需先在血凝试验 96 孔板中将各样品充分混匀。
  8. 保持真空使膜干燥。如有必要，可轻轻敲击装置以释放样品中的气泡。
  9. 在持续抽真空条件下，向每个孔中加入 100 µL TE 缓冲液进行洗涤，并使其干燥。
    注意：完成转移后，必须先关闭泵并将其断开。否则可能导致回流进入装置。若使用带正电荷的尼龙膜，则DNA无需变性步骤；但若使用其他惰性支持膜，可能需要进行预变性处理及碱性变性41。

3. DNA 变性与固定

注意：图5 展示了DNA膜固定步骤。

DNA膜固定过程；示意图包含步骤：NaOH、SSPE浸泡、干燥、预杂交、UV。
图5：DNA-膜固定程序。 DNA在碱性溶液中变性，随后用10 X SSPE中和，并将膜干燥。接着，对膜进行透射紫外照射。然后用2 X SSPE重新水化膜，并在4°C下过夜预杂交。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将膜在 0.4 M NaOH 中室温孵育 10 分钟。
  2. 用 10 × SSPE 将膜在室温下平衡 10 分钟。
  3. 将膜在 80 °C 下干燥 2 小时。
  4. 用 120 mJ 紫外光透射照射 3 分钟。确保样品朝下紧贴紫外光源。若使用紫外交联仪，需确认样品朝上，并重复此步骤两次。
    注意：紫外交联前膜必须完全干燥。DNA 将通过共价键固定在尼龙膜上。每次交联时间约为 18 秒至 1 分钟，大多数杂交实验的最佳紫外照射剂量约为 0.6–0.8 kJ/m2。
    紫外照射对眼睛和皮肤有害。请佩戴适当的防护装备，避免皮肤直接暴露。
  5. 用 2 × SSPE 洗涤膜 10 分钟。
  6. 小心折叠膜并将其插入杂交管中（使用 15 mL 微离心管）。
  7. 向管中加入 10 mL 预杂交溶液（补充文件 6），在 42 °C 下孵育过夜。确保管子已妥善密封，防止泄漏。

4. 杂交

  1. 从杂交管中移除 5 mL 预杂交溶液。若需再次使用这 5 mL 溶液，请将其保存在另一管中，并于 -4 °C 储存。
  2. 向杂交管中加入 15 µL 标记探针（表 1）。用溶液冲洗枪头，以确保标记探针已完全加入稀释液中。
    注意：DNA 探针的结合强度不如抗原-抗体结合。因此，探针或样品中 DNA 浓度的变化可能影响荧光信号的强度。DNA 探针具有化学计量特性，即结合到 DNA 上的探针分子数量与溶液中 DNA 分子的数量相等。图 6 展示了探针杂交过程。
  3. 在 42 °C 下孵育过夜。
  4. 进行 DNA 探针 DIG 标记。按照 表 3 中指定的说明混合试剂，然后在 37 °C 下孵育 1 小时。随后加入 80 µL 蒸馏水，并将尾部标记的探针于 4 °C 保存。

探针杂交示意图，显示预杂交溶液的去除及地高辛标记探针的添加过程。
图6：探针杂交。 调整杂交缓冲液体积后，加入地高辛标记的探针，于4°C孵育过夜以实现探针杂交。 请点击此处查看该图的放大版本。

表3：探针的地高辛（DIG）标记试剂。 请点击此处下载该表格。

5. 化学发光（抗DIG标记）

  1. 在室温下用 2 × SSPE/0.1% SDS 溶液洗涤膜两次，每次 10 分钟。
  2. 在探针的退火温度下，用 5 × SSPE/0.1% SDS 溶液孵育膜 15 分钟。
    注意：此步骤中，请使用带盖容器以尽可能维持温度恒定，确保膜表面温度均匀且稳定。每次洗涤所用溶液体积约为 100 mL。
  3. 在室温下用缓冲液 1（补充文件 6）洗涤膜一次，持续 5 分钟。
  4. 在室温下用缓冲液 2（补充文件 6）洗涤膜一次，持续 30 分钟。
  5. 用缓冲液 2 洗涤膜，然后加入抗地高辛抗体（15 µL）（见 材料表），孵育 45 分钟（孵育时间可在 30–60 分钟之间调整）。该二抗用于标记探针以便检测。
    注意：膜可在含抗地高辛抗体的缓冲液 2 中于 4–8 °C 过夜保存。化学发光过程中抗 DIG 标记的示意图见 图 7。

化学发光过程中去除非结合核酸、探针与目标DNA结合、膜封闭及抗体结合的Anti-DIG标记过程示意图。
图7：化学发光过程的Anti-DIG标记。 使用缓冲液溶液去除未结合的核酸。探针与目标DNA序列配对后，洗去多余探针。用1×封闭缓冲液封闭膜，然后加入Anti-DIG抗体（1:10000）。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 化学发光（底物应用）

  1. 在室温下用缓冲液1洗涤膜两次，每次15分钟。
  2. 在室温下用缓冲液3（见补充文件6）洗涤一次，持续5分钟，使膜尽量沥干缓冲液，保持几乎干燥状态。
  3. 加入即用型CSPD（二钠 3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸盐，见材料表），静置5分钟（用戴手套的手指从一侧到另一侧轻轻按压，使CSPD均匀分布）。
  4. 将膜放入一个尺寸匹配的透明塑料袋（12.5 × 9 cm）中，小心去除气泡，使CSPD均匀分布，然后热封封口。
  5. 将膜置于37 °C水浴中孵育15分钟（最长可延长至30分钟），确保带有样品的一面朝下，完全浸没于液体中。保证温度恒定且在整个膜上分布均匀。
  6. 擦干塑料袋，并用透明胶带将其固定在一张已使用过的X光片上，以便在曝光过程中便于操作。
    注意：图8展示了化学发光过程中底物的应用情况。

用于膜孵育、缓冲液1和3洗涤、CSPD反应及X射线胶片成像的底物应用示意图。
图8：化学发光过程中底物的应用。 去除游离抗体后，向膜中加入底物CSPD（1:250）。通过在37 °C孵育激活反应，并将膜置于X射线胶片上以记录化学发光信号。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 化学发光（检测）

  1. 进行曝光操作。在暗室中，将显影液和定影液（见材料表）分别倒入对应的显影盘中。
  2. 在黑暗条件下，小心地将已固定的膜与一张新的X光胶片相对贴合，并放入X光片暗盒中（见材料表）。
  3. 记录曝光时间。曝光时间可能从1分钟到30分钟甚至更长。建议起始时间为5分钟，并根据结果调整曝光时间。
  4. 将X光胶片浸入显影液中1-3分钟，然后用自来水轻轻冲洗（15-45秒）。
  5. 将X光胶片浸入定影液中1-3分钟，然后用自来水轻轻冲洗（45秒）。
  6. 让X光胶片自然晾干，并在可见光灯箱中记录实验结果。
    注意：在X光曝光期间，避免晃动膜。检测过程如图9所示。
  7. 进行结果判读。在曝光后的X光胶片上，可观察到发光的斑点，这些斑点对应于与探针发生杂交的DNA片段。信号强度取决于发光水平和曝光时间。
    注意：膜可在滤纸之间干燥保存，在室温下可存放数月。

X射线胶片检测过程；暗室示意图；显影、漂洗、定影、干燥顺序；膜结构设置。
图9：化学发光检测过程。 在避光条件下，将膜置于X射线胶片暗盒内进行曝光。随后静置一定曝光时间，然后对X射线胶片进行显影和定影处理。最后，胶片经空气干燥后进行结果判读。 请点击此处查看该图的放大版本。

8. 膜去杂交步骤

  1. 用蒸馏水将膜清洗两次，每次 10 分钟。
  2. 用 0.4 M NaOH 在 53 °C 下清洗膜 20 分钟（重复两次）。
  3. 用 2 × SSPE 将膜清洗两次，每次 10 分钟。
  4. 将膜在室温下晾干。
  5. 保存膜并返回到方案的第 3.5 步。
    注意：膜可在预杂交缓冲液中于 4–8 °C 过夜保存。次日，从 42 °C 孵育 1 小时开始，使预杂交缓冲液达到该温度，然后继续进行方案的第 3.5 步。

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结果

为评估该技术的有效性，从每种纯培养物中提取基因组DNA 钩端螺旋体 血清型被使用，并结合了特定进化枝的探针。每种血清型的PCR反应中使用100 ng基因组DNA制备膜，随后包括八种非相关细菌的基因组DNA以及不同浓度的目标基因组DNA 临时性钩端螺旋体 血清型。每个检测均包含阳性对照、阴性对照和无模板对照。这些非相关基因组DNA未显示出对点印迹探针的亲和性。膜分布及点印迹膜结果如图所示。 补充图 2， 补充图3， 补充图4， 补充图5， 补充图6， 补充图 7关于腐生菌分支，使用DB_Saproprobe探针，针对用引物D...

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讨论

点印迹技术的关键步骤包括：(1) DNA 固定，(2) 用非同源 DNA 封闭膜上的游离结合位点，(3) 在退火条件下探针与目标片段之间的互补配对，(4) 去除未杂交的探针，以及 (5) 报告分子的检测41。

PCR点印迹法存在某些局限性，例如该技术无法提供有关杂交片段大小的信息37，在使用第二种或第三种探针重新杂交之前需要对同一膜进行去杂交处理，且获得最终结果需要耗费较多的时间和精力。

该技术与其他分子技术42,43及其应用具有一致性。反向点杂交、纳米金点杂交21和点印迹酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）42已被用于检测Treponema44、...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 钩端螺旋体 样品的收集 墨西哥国立自治大学兽医与动物科学学院微生物学与免疫学系我们感谢慷慨捐赠的参考品 钩端螺旋体 菌株； Leptospira fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 和 钩端螺旋体双曲种 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 致谢 Alejandro de la Peña Moctezuma 博士。感谢 José Antonio Ocampo Cervantes 博士、CIBAC 协调员及其团队提供的后勤支持。EDT 参与了本科学生终端项目计划 墨西哥自治都市大学-夸希马尔帕校区我们感谢使用 Biorender.com 软件绘制图 1 和图 3 至 9

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Purelink DNA 提取试剂盒InvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA 聚合酶（终点 PCR Taq 聚合酶试剂盒）PromegaM3001
Whatman 滤纸，1 号级MerkWHA1001325
尼龙膜，正电荷，30 cm × 3 m 卷装Roche11417240001
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab 片段，羊多克隆一抗Roche11093274910
EMJH 中等基础培养基DifcoS1368JAA
钩端螺旋体 EMJH 增菌液DifcoBD 279510
封闭试剂Roche11096176001
CSPD 即用型 二钠 3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}8-4-基)苯基磷酸酯Merk11755633001
鲱鱼精子来源的脱氧核糖核酸Sigma AldrichD3159
Carestream 显影剂Carestream Health IncGBX5158621
地高辛-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA，二钠盐（二水合物）PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Carestream 定影剂Carestream Health IncGBX 5158605
月桂基硫酸钠（十二烷基硫酸钠；SDS）C12H25O4SNaSigma AldrichL5750
N-月桂酰肌氨酸钠盐 CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COONaSigma AldrichL-9150它是一种阴离子表面活性剂
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）Sigma AldrichPVP40
聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）Sigma Aldrich9005-64-5
氯化钠（NaCl）Sigma Aldrich7647-14-5
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma Aldrich151-21-3
氢氧化钠（NaOH）Sigma Aldrich1310-73-2
磷酸氢二钠（NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
末端转移酶，重组型Roche3289869103
Tris 盐酸盐（Tris HCl）Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1L可按照补充文件 6 自行配制
引物Sigma-Aldrich按需订购参见表 1
探针Sigma-Aldrich按需订购参见表 1
设备
Nanodrop™ One 分光光度计Thermo-ScientificND-ONE-W
可制冷微量离心机 Sigma 1-14K，适用于 1.5 ml 微量离心管在 14,000 rpm 条件下离心Sigma-Aldrich1-14K
已消毒可调移液器，量程 2–20 µl，20–200 µlGilsonSKU:F167360
一次性 1.5 ml 微量离心管（已高压灭菌）AxygenMCT-150-SP
一次性 600 µl 微量离心管（已高压灭菌）Axygen3208
一次性移液器吸头 1–10 µlAxygenT-300
一次性移液器吸头 1–200 µlAxygenTR-222-Y
点印迹装置 Bio-DotBIORAD1706545
便携式 Hergom 抽滤泵Hergom7E-A
科学光源箱（可见光 PH90-115V）HoeferPH90-115V
紫外交联仪HoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express 梯度 PCR 仪HybaidHBPX110
带 IP 板的放射自显影暗盒，14 × 17 英寸Fuji

参考文献

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