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聚合酶链式反应和点杂交技术用于水样中Leptospira的检测

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DOI：

10.3791/65435

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2024年6月14日

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1Department of Molecular Biology and Histocompatibility, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”, 2Diagnostic Laboratory-Bacteriology, Leptospira Section, Department of Microbiology and Immunology, Veterinary Medicine Faculty, UNAM, 3Department of Ecology of Pathogens, General Hospital “Dr. Manuel Gea González”

本文内容

摘要

本研究设计了一种点印迹法，用于检测水样中三个主要进化枝的Leptospira。该方法可特异性识别地高辛标记探针所靶向的极微量DNA，并通过抗地高辛抗体实现便捷检测。该技术是一种用于筛查的有效且令人满意的工具。

摘要

点印迹（dot-blot）是一种简单、快速、灵敏且用途广泛的检测技术，可在载体DNA存在的情况下，通过探针杂交特异性地鉴定极微量的目标DNA。该技术基于将已知量的DNA直接转移至惰性固相支持物（如尼龙膜）上，使用点印迹装置完成，无需电泳分离。尼龙膜具有高核酸结合能力（400 µg/cm2）、高强度，且可带正电荷或中性电荷。所用探针为一段长度为18至20个碱基、用地高辛（DIG）标记的高度特异性单链DNA（ssDNA）片段，该探针可与Leptospira DNA发生结合。当探针与目标DNA杂交后，通过抗地高辛抗体进行检测，并在X光胶片上显示其发出的信号，从而实现简便检测。出现信号的斑点即对应所关注的DNA片段。本方法采用非同位素标记探针，其半衰期极长。这种标准免疫标记法的缺点是灵敏度低于同位素探针，但通过将聚合酶链式反应（PCR）与点印迹检测联用，可有效弥补这一不足。该联合方法可实现目标序列的富集与检测。此外，在与已知浓度标准品的系列稀释液进行比较时，该方法还可用于定量分析。本文介绍了一种用于检测水样中来自三个主要进化枝的Leptospira的点印迹应用。一旦水样通过离心浓缩，该方法即可用于大量水样的检测，以确认是否存在钩端螺旋体DNA。该技术是一种有效且可靠的通用筛查工具，也可用于检测水中其他不可培养的细菌，有助于加深对水生生态系统的理解。

引言

人类中的钩端螺旋体病主要来源于环境1,2. 存在 钩端螺旋体 在湖泊、河流和溪流中的存在是野生动物以及家养和养殖动物之间传播钩端螺旋体病的指示指标，这些动物可能最终会与这些水体接触1,3,4此外， 钩端螺旋体 已在非天然来源中发现，包括污水、静止水和自来水5,6.

Leptospira 是一种在全球范围内分布的细菌7,8，其在环境中的保存和传播作用已被广泛认识。Leptospira 可在不同 pH 和矿物质条件下存活于饮用水中9，也可存在于自然水体中1。它还能在蒸馏水中长期存活10，在恒定 pH（7.8）条件下可存活长达 152 天11。此外，Leptospira 可通过与其他细菌形成菌群协作，以应对恶劣环境12,13。它可能与 Azospirillum 和 Sphingomonas 共同构成淡水中的生物膜，甚至能够在超过 49 °C 的温度下生长和存活14,15。它也可在积水土壤中增殖，并保持活性长达 379 天16，致病能力可持续达一年之久17,18。然而，关于其在水体内的生态特征及其在其中的分布方式，目前仍知之甚少。

自从发现以来，对Leptospira属的研究一直基于血清学检测。直到本世纪，分子生物学技术才在该螺旋体的研究中变得更为普遍。点印迹法（dot-blot）在该属鉴定中的应用较少，仅见于以下几种情况：(1) 使用基于16S rRNA和简单重复序列间区（ISSR）的同位素探针19,20；(2) 采用基于纳米金的免疫检测法，用于人钩端螺旋体病尿液样本的检测21；或(3) 基于抗体的检测法用于牛尿样本22。该技术之所以逐渐被弃用，是因为最初依赖同位素探针。然而，点印迹法是一种广为人知的技术，若与PCR联用可显著提高检测灵敏度，并且由于使用非同位素探针而更加安全。PCR在富集Leptospira DNA方面起着关键作用，它能够扩增样本中痕量存在的特异性DNA片段。在每一轮PCR循环中，目标DNA片段的数量在反应体系中倍增。反应结束时，扩增产物的数量可增加超过一百万倍23。PCR扩增的产物通常在琼脂糖凝胶电泳中不可见，但通过与DIG标记的探针在点印迹中进行特异性杂交后即可被检测到24,25,26。

点印迹技术操作简便、结果可靠，适用于大量样本，便于资源有限的实验室开展。该技术已广泛应用于多种细菌研究，包括：（1）口腔细菌27；（2）其他样本类型，如食品和粪便28；以及（3）不可培养细菌的鉴定29，其结果通常与其他分子技术一致。点印迹技术的优势包括：（1）膜具有高结合容量，可结合超过 200 μg/cm2 的核酸，最高可达 400 μg/cm2；（2）结果可直接肉眼判读，无需特殊设备；（3）可在室温（RT）下长期保存数年。

钩端螺旋体属（Leptospira）已被分为致病性、中间性和腐生性三个进化分支30,31。这些进化分支之间的区分可通过特定基因（如 lipL41、lipL32 和 16S rRNA）进行。lipL32 存在于致病性进化分支中，在多种血清学和分子检测技术中表现出高敏感性，而在腐生性物种中则缺失21。管家基因 lipL41 因其表达稳定，常用于分子检测技术32，而 16S rRNA 基因则被用于分类学鉴定。

该方法适用于经离心浓缩后的大量水样。它可用于检测水体中不同位置和深度的钩端螺旋体DNA及其所属进化分支。该工具在生态学研究和常规筛查中均具有重要价值，也可用于检测水中存在的其他不可培养细菌。

此外，PCR 和点印迹检测在技术上和经济上对大多数实验室而言都是可行的，即使缺乏复杂或昂贵的设备也能开展。本研究旨在应用基于地高辛的点印迹法，对从自然水体采集的水样中三种 Leptospira 进化枝进行鉴定。

细菌菌株
十二 钩端螺旋体 血清型（Autumnalis、Bataviae、Bratislava、Canicola、Celledoni、Grippothyphosa、Hardjoprajitno、Icterohaemorrhagiae、Pomona、Pyrogenes、Tarassovi 和 Wolffi）被纳入本研究。这些血清型保存于墨西哥国立自治大学兽医与动物科学学院微生物学与免疫学系，目前用于显微凝集试验（MAT）。

所有Leptospira血清型均在EMJH培养基中培养，并使用商业DNA提取试剂盒提取其DNA（参见材料表）。将12种血清型的基因组DNA混合物用作致病性Leptospira进化枝的阳性对照。中间型Leptospira进化枝的阳性对照包括Leptospira fainei血清型Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA，而腐生型Leptospira进化枝的阳性对照则包括Leptospira biflexa血清型Patoc菌株Patoc I的基因组DNA。

阴性对照包括空质粒以及非相关细菌的DNA解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、流产布鲁氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、鲍氏志贺菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌 和 大肠杆菌），以及 PCR级水，作为无模板对照。

水样
采用分层随机采样方法，从库埃曼科生物与水产养殖研究中心（CIBAC）（北纬19° 16' 54"，西经99° 6' 11"）采集了12个试验性瞬时水样。这些样品分别在三个深度获取：表层、10 cm和30 cm（图1A，B）。水样采集过程未对任何濒危或受保护物种造成影响。每个样品均采集于无菌的15 mL 微量离心管中。采样时，将每支离心管轻轻浸入水中，在选定深度处灌满后立即密封。样品在22 °C条件下保存，并迅速运送至实验室进行处理。

每个样品均在无菌的1.5 mL微量离心管中，于室温下以8000 × g 离心20分钟进行浓缩。重复此步骤，直至所有样品均浓缩至同一管中，随后用于DNA提取（图1C）。

水样分析；DNA提取方法示意图；离心浓缩过程。
图1：通过离心法浓缩水样。（A）水样采集池塘，以及（B）自然溪流。（C）基于离心的水样处理流程，可根据需要重复进行多次（n）。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA 提取
根据制造商说明书，使用商业基因组 DNA 试剂盒提取总 DNA（参见材料表）。DNA 提取物用 20 µL 洗脱缓冲液洗脱，通过紫外分光光度计在 260–280 nm 处测定 DNA 浓度，并在 4 °C 保存至使用。

PCR 扩增
PCR靶标为16SS rRNA、lipL41 和 lipL32 基因，用于鉴定属水平的 DNA 钩端螺旋体 并能够区分三个进化分支：致病性、腐生性及中间型. 引物和探针的设计均基于Ahmed等、Azali等、Bourhy等以及Weiss等先前的研究工作。.，以及 Branger 等人33,34,35,36,37每种探针、引物及扩增片段的序列均在文中描述。 表1，以及它们与参考序列的比对结果如下所示 补充文件 1, 补充文件 2, 补充文件 3, 补充文件 4，以及 补充文件 5PCR 试剂和热循环条件详见方案部分。

扩增产物通过在TAE（40 mM Tris碱，20 mM乙酸，1 mM EDTA；pH 8.3）缓冲液中进行1%琼脂糖凝胶电泳分离，在60 V条件下电泳45分钟，并用溴化乙锭染色检测，结果如图所示 补充图1. 各血清型获得的基因组DNA使用浓度范围为6 x 106 至 1 × 104 每个PCR反应中的基因组当量拷贝数（GEq），基于该物种的基因组大小 L. interrogans (4,691,184 bp)38 致病性 钩端螺旋体，基因组大小为 L. biflexa (3,956,088 bp)39 用于腐生的 钩端螺旋体，以及基因组大小 L. fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6（4,267,324 bp），登录号 AKWZ00000000.2。

在每次实验中，使用每种致病性血清型、 L. biflexa 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 以及 L. fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 的 DNA 评估探针的灵敏度。为评估 PCR 和点杂交检测的特异性，实验中还包含了非相关细菌的 DNA。

表1：用于扩增产物以鉴定致病性、腐生性和中间型钩端螺旋体属（Leptospira）进化枝的PCR引物和探针。 请点击此处下载该表格。

点印迹杂交实验
该技术被称为点印迹，是因为将DNA样本加入的孔呈点状，当通过真空抽吸使其固定在膜上时，样本即形成点状。该技术由Kafatos等人40建立。该方法可用于对每个PCR阳性样本中的Leptospira进行半定量分析。实验步骤包括使用0.4 M NaOH在室温下进行变性处理，将含有30 ng至0.05 ng Leptospira DNA的样本（相当于6 × 106至1 × 104个钩端螺旋体）通过96孔点印迹装置点样至尼龙膜上。DNA经固定后，通过120 mJ的紫外光照射使其共价结合于膜上。每条DNA探针均在3'端通过末端转移酶催化反应连接上地高辛-11-dUTP（地高辛是一种从Digitalis purpurea中提取的植物类固醇，用作报告分子41）。标记后的DNA探针（50 pmol）在特异性温度下与目标DNA进行严格杂交后，利用抗地高辛碱性磷酸酶抗体与其底物CSPD共价结合，通过化学发光反应检测DNA杂交产物。发光信号通过X射线胶片记录（图2）。

DNA提取和PCR流程图；过程：浓度测定、杂交、化学发光检测。
图2：PCR-点杂交检测实验步骤。 请点击此处查看该图的放大版本。

方案

1. 样品制备

  1. 在4 °C条件下，以8,000 × g离心10分钟，将每份水样在1.5 mL微量离心管中浓缩。根据需要重复此步骤，直至样品体积浓缩至250 µL。
  2. 按照制造商说明书使用DNA提取试剂盒（见材料表）。
  3. 根据将使用的点杂交探针进行特异性PCR（表1）。
    1. 在PCR管中进行扩增，总体积为25 µL，包含1×缓冲液、2.5单位Taq DNA聚合酶、每种引物1 µM、每种dNTP 0.2 mM、MgCl2 1.5 mM，以及来自每份水样或参考基因组DNA的100 ng目标DNA。
    2. 根据热循环条件（表2）在热循环仪中设置PCR程序。
    3. 将反应产物储存于4 °C，待用。
  4. 将每份待杂交的PCR产物各取10 µL，分别加入96孔板的不同孔中。
  5. 向每个孔中加入40 µL TE缓冲液，并用移液器吹打混匀。
    注意：96孔板可密封后在4 °C保存过夜。请参照补充文件6中的说明配制本方案所需的缓冲液和溶液。图3展示了样品制备的步骤。

表2：16S、lipL41 和 lipL32 基因的PCR扩增循环条件。 请点击此处下载该表格。

PCR样品制备示意图；PCR反应产物转移至孔板；移液、TE缓冲液添加。
图3：PCR及样品制备。 根据特定的PCR方案，将PCR产物转移至微孔板中，并向每个孔中加入40 µL的TE缓冲液。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 组装点印迹装置

注意：点印迹装置的组装过程如图4所示。操作过程中需佩戴手套以接触碱性溶液，并防止尼龙膜受到污染。

点印迹装置示意图，显示尼龙膜、10X SSPE 浸泡、PCR 准备及 TE 洗涤步骤。
图 4：点印迹装置的组装。 滤纸和尼龙膜（预先用 10× SSPE 湿润）必须按正确顺序放置。在施加真空前，需用螺丝将装置紧密固定。每个孔需用 TE 缓冲液洗涤，然后将 PCR 产物加入相应的孔中。PCR 产物通过膜转移后，每个孔再次用 TE 缓冲液洗涤，并让其自然干燥。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将尼龙膜（参见材料表）和滤纸裁剪成 12 × 8.5 cm 大小的片状。
  2. 用永久性记号笔在膜上做标记。
  3. 用剪刀在膜的一侧边缘剪出一个缺口，以指示正确的方向。使用标记记录样品顺序。
  4. 用 10 × 盐-磷酸钠-EDTA 缓冲液（SSPE；3 M NaCl、0.2 M NaH2PO4 和 0.02 M EDTA，pH 7.4）（补充文件 6）润湿膜和滤纸。使用洁净的钝头镊子操作膜。
  5. 组装点印迹装置：先放置滤纸，再将膜覆盖在塑料密封圈上。以对角方式拧紧螺丝固定盖子。
  6. 将装置连接至真空泵，在每个孔中加入 100 µL TE 缓冲液，维持真空 1 分钟，然后关闭真空。
  7. 开启低速真空，将每份样品 50 µL 加入点印迹装置膜上对应的孔中（按照预先确定的膜分布顺序）。
    注意：在将样品加入点印迹装置前，需先在血凝试验 96 孔板中将各样品充分混匀。
  8. 保持真空使膜干燥。如有必要，可轻轻敲击装置以释放样品中的气泡。
  9. 在持续抽真空条件下，向每个孔中加入 100 µL TE 缓冲液进行洗涤，并使其干燥。
    注意：完成转移后，必须先关闭泵并将其断开。否则可能导致回流进入装置。若使用带正电荷的尼龙膜，则DNA无需变性步骤；但若使用其他惰性支持膜，可能需要进行预变性处理及碱性变性41。

3. DNA 变性与固定

注意：图5 展示了DNA膜固定步骤。

DNA膜固定过程；示意图包含步骤：NaOH、SSPE浸泡、干燥、预杂交、UV。
图5：DNA-膜固定程序。 DNA在碱性溶液中变性，随后用10 X SSPE中和，并将膜干燥。接着，对膜进行透射紫外照射。然后用2 X SSPE重新水化膜，并在4°C下过夜预杂交。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将膜在 0.4 M NaOH 中室温孵育 10 分钟。
  2. 用 10 × SSPE 将膜在室温下平衡 10 分钟。
  3. 将膜在 80 °C 下干燥 2 小时。
  4. 用 120 mJ 紫外光透射照射 3 分钟。确保样品朝下紧贴紫外光源。若使用紫外交联仪，需确认样品朝上，并重复此步骤两次。
    注意：紫外交联前膜必须完全干燥。DNA 将通过共价键固定在尼龙膜上。每次交联时间约为 18 秒至 1 分钟，大多数杂交实验的最佳紫外照射剂量约为 0.6–0.8 kJ/m2。
    紫外照射对眼睛和皮肤有害。请佩戴适当的防护装备，避免皮肤直接暴露。
  5. 用 2 × SSPE 洗涤膜 10 分钟。
  6. 小心折叠膜并将其插入杂交管中（使用 15 mL 微离心管）。
  7. 向管中加入 10 mL 预杂交溶液（补充文件 6），在 42 °C 下孵育过夜。确保管子已妥善密封，防止泄漏。

4. 杂交

  1. 从杂交管中移除 5 mL 预杂交溶液。若需再次使用这 5 mL 溶液，请将其保存在另一管中，并于 -4 °C 储存。
  2. 向杂交管中加入 15 µL 标记探针（表 1）。用溶液冲洗枪头，以确保标记探针已完全加入稀释液中。
    注意：DNA 探针的结合强度不如抗原-抗体结合。因此，探针或样品中 DNA 浓度的变化可能影响荧光信号的强度。DNA 探针具有化学计量特性，即结合到 DNA 上的探针分子数量与溶液中 DNA 分子的数量相等。图 6 展示了探针杂交过程。
  3. 在 42 °C 下孵育过夜。
  4. 进行 DNA 探针 DIG 标记。按照 表 3 中指定的说明混合试剂，然后在 37 °C 下孵育 1 小时。随后加入 80 µL 蒸馏水，并将尾部标记的探针于 4 °C 保存。

探针杂交示意图，显示预杂交溶液的去除及地高辛标记探针的添加过程。
图6：探针杂交。 调整杂交缓冲液体积后，加入地高辛标记的探针，于4°C孵育过夜以实现探针杂交。 请点击此处查看该图的放大版本。

表3：探针的地高辛（DIG）标记试剂。 请点击此处下载该表格。

5. 化学发光（抗DIG标记）

  1. 在室温下用 2 × SSPE/0.1% SDS 溶液洗涤膜两次，每次 10 分钟。
  2. 在探针的退火温度下，用 5 × SSPE/0.1% SDS 溶液孵育膜 15 分钟。
    注意：此步骤中，请使用带盖容器以尽可能维持温度恒定，确保膜表面温度均匀且稳定。每次洗涤所用溶液体积约为 100 mL。
  3. 在室温下用缓冲液 1（补充文件 6）洗涤膜一次，持续 5 分钟。
  4. 在室温下用缓冲液 2（补充文件 6）洗涤膜一次，持续 30 分钟。
  5. 用缓冲液 2 洗涤膜，然后加入抗地高辛抗体（15 µL）（见 材料表），孵育 45 分钟（孵育时间可在 30–60 分钟之间调整）。该二抗用于标记探针以便检测。
    注意：膜可在含抗地高辛抗体的缓冲液 2 中于 4–8 °C 过夜保存。化学发光过程中抗 DIG 标记的示意图见 图 7。

化学发光过程中去除非结合核酸、探针与目标DNA结合、膜封闭及抗体结合的Anti-DIG标记过程示意图。
图7：化学发光过程的Anti-DIG标记。 使用缓冲液溶液去除未结合的核酸。探针与目标DNA序列配对后，洗去多余探针。用1×封闭缓冲液封闭膜，然后加入Anti-DIG抗体（1:10000）。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 化学发光（底物应用）

  1. 在室温下用缓冲液1洗涤膜两次，每次15分钟。
  2. 在室温下用缓冲液3（见补充文件6）洗涤一次，持续5分钟，使膜尽量沥干缓冲液，保持几乎干燥状态。
  3. 加入即用型CSPD（二钠 3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)苯基磷酸盐，见材料表），静置5分钟（用戴手套的手指从一侧到另一侧轻轻按压，使CSPD均匀分布）。
  4. 将膜放入一个尺寸匹配的透明塑料袋（12.5 × 9 cm）中，小心去除气泡，使CSPD均匀分布，然后热封封口。
  5. 将膜置于37 °C水浴中孵育15分钟（最长可延长至30分钟），确保带有样品的一面朝下，完全浸没于液体中。保证温度恒定且在整个膜上分布均匀。
  6. 擦干塑料袋，并用透明胶带将其固定在一张已使用过的X光片上，以便在曝光过程中便于操作。
    注意：图8展示了化学发光过程中底物的应用情况。

用于膜孵育、缓冲液1和3洗涤、CSPD反应及X射线胶片成像的底物应用示意图。
图8：化学发光过程中底物的应用。 去除游离抗体后，向膜中加入底物CSPD（1:250）。通过在37 °C孵育激活反应，并将膜置于X射线胶片上以记录化学发光信号。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 化学发光（检测）

  1. 进行曝光操作。在暗室中，将显影液和定影液（见材料表）分别倒入对应的显影盘中。
  2. 在黑暗条件下，小心地将已固定的膜与一张新的X光胶片相对贴合，并放入X光片暗盒中（见材料表）。
  3. 记录曝光时间。曝光时间可能从1分钟到30分钟甚至更长。建议起始时间为5分钟，并根据结果调整曝光时间。
  4. 将X光胶片浸入显影液中1-3分钟，然后用自来水轻轻冲洗（15-45秒）。
  5. 将X光胶片浸入定影液中1-3分钟，然后用自来水轻轻冲洗（45秒）。
  6. 让X光胶片自然晾干，并在可见光灯箱中记录实验结果。
    注意：在X光曝光期间，避免晃动膜。检测过程如图9所示。
  7. 进行结果判读。在曝光后的X光胶片上，可观察到发光的斑点，这些斑点对应于与探针发生杂交的DNA片段。信号强度取决于发光水平和曝光时间。
    注意：膜可在滤纸之间干燥保存，在室温下可存放数月。

X射线胶片检测过程；暗室示意图；显影、漂洗、定影、干燥顺序；膜结构设置。
图9：化学发光检测过程。 在避光条件下，将膜置于X射线胶片暗盒内进行曝光。随后静置一定曝光时间，然后对X射线胶片进行显影和定影处理。最后，胶片经空气干燥后进行结果判读。 请点击此处查看该图的放大版本。

8. 膜去杂交步骤

  1. 用蒸馏水将膜清洗两次，每次 10 分钟。
  2. 用 0.4 M NaOH 在 53 °C 下清洗膜 20 分钟（重复两次）。
  3. 用 2 × SSPE 将膜清洗两次，每次 10 分钟。
  4. 将膜在室温下晾干。
  5. 保存膜并返回到方案的第 3.5 步。
    注意：膜可在预杂交缓冲液中于 4–8 °C 过夜保存。次日，从 42 °C 孵育 1 小时开始，使预杂交缓冲液达到该温度，然后继续进行方案的第 3.5 步。

结果

为评估该技术的有效性，从每种纯培养物中提取基因组DNA 钩端螺旋体 血清型被使用，并结合了特定进化枝的探针。每种血清型的PCR反应中使用100 ng基因组DNA制备膜，随后包括八种非相关细菌的基因组DNA以及不同浓度的目标基因组DNA 临时性钩端螺旋体 血清型。每个检测均包含阳性对照、阴性对照和无模板对照。这些非相关基因组DNA未显示出对点印迹探针的亲和性。膜分布及点印迹膜结果如图所示。 补充图 2， 补充图3， 补充图4， 补充图5， 补充图6， 补充图 7关于腐生菌分支，使用DB_Saproprobe探针，针对用引物DB_16扩增得到的1059 bp PCR产物SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD，以及使用引物DB_16扩增得到的517 bp PCR产物SSapREV 和 DB_16SSapFWD 与基因组 DNA Leptospira biflexa 血清型 Patoc 菌株 Patoc I，可检测到 0.05–0.1 ng 的腐生螺旋体 DNA补充图2 和 补充图3）。同样，对于中间进化枝的检测，使用DB_Interprobe与利用引物DB_16扩增得到的1059 bp PCR产物进行检测SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD，以及使用引物 DB_16 扩增得到的 299-301 bp 的 PCR 产物SInterREV 和 DB_16SInterFWD 与基因组 DNA Leptospira fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 (补充图4 和 补充图5），可检测到约 0.1 ng 的中间体 DNA。同样，对于使用 DB_16 的致病进化枝S使用引物DB_16扩增得到的1059 bp PCR产物进行Pathoprobe检测SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD，或DBlipL41探针，是由致病性基因组DNA混合物通过引物DB_lipL41REV和DB_lipL41FWD扩增得到的479 bp PCR产物 钩端螺旋体 血清型，能够检测到0.3–0.6 ng的致病性DNA浓度（补充图6 和 补充图7).

用于鉴定这三个进化枝的检测方法可分别针对每个进化枝单独使用。然而，在样本珍贵且稀少的情况下，可制备单张膜，使用引物 DB_16SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD 扩增出一个长度为 1058–1069 bp 的产物。随后，该产物可依次与 DB_Interprobe、DB_Saproprobe 和 DB_16SPathoprobe 进行杂交，每次杂交前均需进行去杂交步骤（步骤 8）。该方法可在同一张膜上实现对所有进化枝的鉴定。

在野外水样检测中，采用lipL32探针检测方案。每个水样的DNA在每轮PCR反应中的使用浓度为100 ng。此外，设置DNA提取流程的对照，即向15 mL蒸馏水样品中加入100 ng Leptospira 基因组DNA。同时包括阴性对照和阳性对照（图10）。

表4：水样描述及采样深度。 请点击此处下载该表格。

ELISA 结果；网格布局；阳性与阴性对照；池塘水样分析。
图 10：各水样的点印迹检测结果。（A）膜上样品分布情况，以及（B）野外水样中 DB_lipL32 探针与引物 DB_lipL32REV 和 DB_lipL32FWD 扩增产物（262 bp）的点印迹结果。3 号池塘表面样品呈阳性，且提取流程对照与阳性对照均显示强信号。请点击此处查看该图的放大版本。

水样描述见表4，点印迹膜分布及图像见图9。A7点显示池塘3表面存在钩端螺旋体DNA。为了确定池塘3中DNA的浓度，使用已知浓度的多种Leptospira血清型混合DNA与lipL32探针进行点印迹实验（图11）。膜上每一点分布的基因组DNA浓度范围为100 ng至1 × 10-13 ng。可明确检测到的最低浓度约为0.3 ng，相当于水样中6 × 105 GEq。

点印迹分析；表格和印迹结果；钩端螺旋体DNA检测；分子生物学实验。
图11：使用不同已知浓度的Leptospira血清型混合DNA及lipL32探针进行的点印迹分析。（A）膜上点样分布图；（B）DB_lipL32探针与引物DB_lipL32REV和DB_lipL32FWD扩增产物（262 bp）对致病性Leptospira血清型基因组DNA混合液进行系列稀释（1:2）后的点印迹结果。该探针信号可灵敏检测至3.91 × 10-1 ng的Leptospira DNA混合物。请点击此处查看该图的高清版本。

补充图1：通过电泳分离可视化PCR扩增产物。 第1道：分子量标记物100 bp DNA Ladder。第2道：以致病性Leptospira DNA混合物为模板，针对lipL32基因进行的PCR；第3道：以致病性Leptospira DNA混合物为模板，针对lipL41基因进行的PCR；第4道：以致病性Leptospira DNA混合物为模板，针对16S rRNA基因进行的PCR；第5道：使用引物DB_16SSapREV和DB_16SSapFWD，以Leptospira biflexa血清型Patoc菌株Patoc I DNA为模板，针对16S rRNA基因进行的PCR；第6道：使用引物DB_16SPathoREV和DB_16SPathoFWD，以Leptospira biflexa血清型Patoc菌株Patoc I DNA为模板，针对16S rRNA基因进行的PCR；第7道：使用引物DB_16SInterREV和DB_16SInterFWD，以Leptospira fainei血清型Hurstbridge菌株BUT6 DNA为模板，针对16S rRNA基因进行的PCR；第8道：使用引物DB_16SPathoREV和DB_16SPathoFWD，以Leptospira fainei血清型Hurstbridge菌株BUT6 DNA为模板，针对16S rRNA基因进行的PCR。请点击此处下载该文件。

补充图2：（A）膜分布图和（B）Leptospira biflexa 血清型 Patoc（Patoc I）基因组DNA的DB_Saproprobe探针及其引物DB_16SPathoREV与DB_16SPathoFWD扩增产物（1059 bp）的点印迹结果。请点击此处下载该文件。

补充图3：（A）DB_Saproprobe的膜分布图与（B）使用DB_16引物扩增产物（517 bp）的点杂交结果SSapREV 和 DB_16S基因组DNA的SapFWD Leptospira biflexa 血清型 Patoc，Patoc I. 请点击此处下载此文件。

补充图4：（A）DB_Interprobe与引物DB_16扩增产物（1059 bp）的膜分布图；（B）点杂交结果SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD 和基因组 DNA Leptospira fainei 血清型赫斯特布里奇 BUT6 菌株 请点击此处下载此文件。

补充图5：（A）膜分布图和（B）使用Leptospira fainei血清型Hurstbridge菌株BUT6的基因组DNA，通过引物DB_16SInterREV和DB_16SInterFWD扩增产物（299-301 bp）与DB_Interprobe进行的点印迹杂交结果。请点击此处下载该文件。

补充图6：（A）DB_16的膜分布和（B）点印迹分析SPathoprobe 及引物 DB_16 的扩增产物（1059 bp）SPathoREV 和 DB_16SPathoFWD 与致病性基因组DNA混合物 钩端螺旋体 血清型 请点击此处下载此文件。

补充图7：（A）膜分布图和（B）使用DB_lipL41探针进行点印迹杂交，检测致病性Leptospira血清型基因组DNA混合物经引物DB_lipL41REV与DB_lipL41FWD扩增的产物（479 bp）。请点击此处下载该文件。

补充文件1：基于16S核糖体RNA序列的腐生型Leptospira物种与引物及探针的比对。 引物以粗体黑色标出以便识别，并用黑色箭头指示其方向。探针以粗体灰色高亮显示，其位置由灰色线条标示。比对的序列以浅灰色高亮显示，未比对上的序列则以黑白形式呈现。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：基于 16S 核糖体 RNA 序列的中间型Leptospira物种与引物和探针的比对。 引物以粗体黑色标出以便识别，并用黑色箭头指示其方向。探针以粗体显示并用灰色高亮，其位置由灰色线条标示。比对的序列以浅灰色显示，未比对上的序列以黑白显示。请点击此处下载该文件。

补充文件 3：基于 lipL32 基因序列的引物和探针对致病性Leptospira物种的比对。 引物以粗体黑色标出以便识别，并用黑色箭头指示其方向。探针以粗体灰色高亮显示，其位置由灰色线条标记。比对的序列以浅灰色显示，未对应序列以黑白形式显示。请点击此处下载该文件。

补充文件 4：基于 lipL41 基因序列的致病性Leptospira物种与引物及探针的比对。 用于鉴别的引物以粗体显示并用黑色高亮，其方向由黑色箭头指示。探针以粗体显示并用深灰色高亮，其位置由灰色线条标出。比对的序列以浅灰色显示，未比对上的序列以黑白显示。请点击此处下载该文件。

补充文件 5：Leptospira 物种与靶向 16S 核糖体 RNA 序列的引物以及针对腐生型、中间型和致病型物种探针的比对结果。 为便于鉴定，引物以粗体显示并用黑色高亮，其方向由黑色箭头标示。探针以粗体显示并用灰色高亮，其位置由灰色线条表示。比对的序列显示为浅灰色，未匹配的序列显示为白色和黑色。请点击此处下载该文件。

补充文件6：点印迹实验的缓冲液和溶液。请点击此处下载该文件。

讨论

点印迹技术的关键步骤包括：(1) DNA 固定，(2) 用非同源 DNA 封闭膜上的游离结合位点，(3) 在退火条件下探针与目标片段之间的互补配对，(4) 去除未杂交的探针，以及 (5) 报告分子的检测41。

PCR点印迹法存在某些局限性，例如该技术无法提供有关杂交片段大小的信息37，在使用第二种或第三种探针重新杂交之前需要对同一膜进行去杂交处理，且获得最终结果需要耗费较多的时间和精力。

该技术与其他分子技术42,43及其应用具有一致性。反向点杂交、纳米金点杂交21和点印迹酶联免疫吸附试验（dot-ELISA）42已被用于检测Treponema44、Borrelia burgdorferi45、E. coli46、Helicobacter pylori47和Mycobacterium tuberculosis48,49等生物体中的特定基因，其依据为16S rRNA29,43，也可用于检测植物病毒的DNA或RNA41。 检测限（LOD）定义为该技术能够持续且可靠检测到的微生物最低浓度50，其范围从H. pylori的100 pg（5 × 104个细菌）47，到临床样本中单个B. burgdorferi细胞45，以及低于一个细胞量的fg级M. tuberculosis48,49。

这种联合方法的一个重要优势在于能够将检测限降低一个数量级，从而克服因两种可能导致结果不一致的样本状况所引起的假阴性结果：（1）DNA含量不足的样本，或（2）样本污染，从而实现对阳性样本100%的检出率25,45,47,48,49。PCR-点杂交法能够检测到比琼脂糖凝胶电泳更低含量的扩增产物，并且避免了因二次扩增步骤（如巢式PCR和半巢式PCR）所导致的污染风险。当处理含有较低细菌载量的环境样本时，这些优势尤为关键，因为此类样本可能含有更广泛的抑制物以及来自非目标来源的DNA，从而干扰分子检测技术的准确性。

先前的研究表明，可通过光生物素标记的DNA探针鉴定钩端螺旋体，检测下限可达5 pg（5 × 103 钩端螺旋体51. DIG标记的探针可检测0.1-1 pg（102 钩端螺旋体），而 32P标记的探针可检测1-5 pg（750至1000个钩端螺旋体）51，生物素标记的探针可检测5 pg（2500个钩端螺旋体）52此外， 32P标记的探针用于腐生生物 钩端螺旋体 达到 1.95 ng 的检测限，适用于致病性 钩端螺旋体，3.9 ng53. 在本研究中，针对三个进化枝建立了相似的检测限。对于致病性物种，检测限约为0.3 ng基因组DNA（6-8 x 104 GEq) (图11），而对于腐生菌和中间型物种，检测下限降至0.1 ng（2 × 104 GEq）。值得注意的是，先前的研究均采用纯 钩端螺旋体 培养物51 以及来自实验感染的金黄地鼠的血清，旨在检测致病性 钩端螺旋体54,55，并应用DNA杂交技术与 32P标记作为识别与分类的工具 钩端螺旋体56这些探针具有高特异性，不会与其他微生物的非同源DNA发生交叉杂交。19,51,54,55,56,57，甚至能够区分亲缘关系很近的物种，例如 细螺旋体属57同样，在本研究中未观察到与非同源DNA的杂交信号。尽管非放射性探针的灵敏度不及放射性探针58 或其他技术43可以预期，与其它基于PCR的技术相比，PCR-点杂交联用技术的灵敏度可提高至十倍，这一点在检测中已得到证实 利什曼原虫 以及牛疱疹病毒4型（BHV4）24,26.

另一方面，用于点印迹分析的 钩端螺旋体 鉴定已更频繁地采用抗体进行， 最近 使用单克隆抗体作为检测人和动物尿液样本的替代诊断方法59,60,61,62在这些研究中，样本未经预处理而直接在膜上进行处理，抗体则靶向特定的 钩端螺旋体 与致病性相关的表面蛋白。例如，单克隆抗体点印迹ELISA具有高灵敏度和特异性，可检测低至1 µg的细菌匀浆物62Mab-Dot-blot 检测获得的结果可与 PCR 检测相媲美，后者的检测限通常在 10 左右3 尿液中每毫升钩端螺旋体数或 9.3 纳克 钩端螺旋体 匀浆液63通过PCR可扩增的基因组DNA量相当于100个细胞（500飞克DNA）61这些先前的研究采用纯培养物或未经富集处理的临床样本，主要侧重于提高诊断效果。鉴于感染的大鼠可排出多达107 leptospires/mL 尿液64，且狗的排泄量可在10之间2 至 106 leptospires/mL 尿液65，作为水体污染的来源，环境样本需要进行钩端螺旋体增菌培养。 体外 印迹前对目标DNA进行PCR扩增可使实验灵敏度提高达十倍52,55通常，终点PCR扩增的产物在琼脂糖凝胶电泳中无法观察到；然而，通过DIG标记探针在点杂交中的特异性杂交，结果变得清晰可见。

尽管关于Leptospira和钩端螺旋体病的大量研究集中于疾病诊断，但其在水体中的生态学特征及分布情况仍知之甚少。PCR-点印迹技术为研究Leptospira和钩端螺旋体病提供了新的工具，具有可高通量筛查样本、加快结果获取与解读的优势。PCR-点印迹是一种成本相对较低、操作简便且无需放射性标记的技术，可在同一膜上同时使用多种探针。此外，该技术无需昂贵仪器和复杂的操作流程，因而在资源有限的环境中具有显著应用优势。

本研究的意义在于未来可应用于不同深度的大型水体，以及其他生态位和样本类型的研究，包括土壤、静止水体、粪便、血液和组织。

综上所述，本研究展示了基于地高辛标记DNA探针的PCR-点杂交技术在鉴定属内三个进化分支中的应用 钩端螺旋体该方法通过将检测过程简化为单次扩增步骤，实现了鉴定流程的优化，并允许在同一膜上进行三次同时杂交或连续杂交。该技术达到的检测灵敏度与放射性探针相当。53，使其成为识别的有力工具 钩端螺旋体 来自自然水源的水样中。因此，该技术在检测细菌DNA含量极低的样本时，具有更高的灵敏度，并能提供准确且一致的结果。它为研究微生物群落动态变化提供了一种替代方法。 钩端螺旋体 在水体中，可能有助于更广泛环境样本的评估与监测，从而协助实施预防该微生物传播的措施。

如果该技术操作遇到困难，请参考以下故障排除要点：（1）若斑点形状不规则，请检查真空系统是否已牢固地交叉密封，然后重新进行转印。（2）若杂交管在过夜孵育过程中破裂，导致膜失去杂交缓冲液，请参阅“"去杂交程序"”部分并重新开始实验。（3）若未观察到任何斑点，请勿丢弃膜；请进入“"去杂交程序"”部分，重复杂交步骤。（4）若在显影后的X光片上发现不均匀的白色区域，请确保封袋过程中未残留气泡。（5）若在显影后的X光片上观察到不均匀的黑色区域，请确认已使用湿润的手指将CSPD充分铺匀。（6）若X光片上出现斑点的阴影，请确保在曝光期间胶片未发生移动。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢 钩端螺旋体 样品的收集 墨西哥国立自治大学兽医与动物科学学院微生物学与免疫学系我们感谢慷慨捐赠的参考品 钩端螺旋体 菌株； Leptospira fainei 血清型 Hurstbridge 菌株 BUT6 和 钩端螺旋体双曲种 血清型 Patoc 菌株 Patoc I 致谢 Alejandro de la Peña Moctezuma 博士。感谢 José Antonio Ocampo Cervantes 博士、CIBAC 协调员及其团队提供的后勤支持。EDT 参与了本科学生终端项目计划 墨西哥自治都市大学-夸希马尔帕校区我们感谢使用 Biorender.com 软件绘制图 1 和图 3 至 9

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Purelink DNA 提取试剂盒InvitrogenK182002
Gotaq Flexi DNA 聚合酶（终点 PCR Taq 聚合酶试剂盒）PromegaM3001
Whatman 滤纸，1 号级MerkWHA1001325
尼龙膜，正电荷，30 cm × 3 m 卷装Roche11417240001
抗地高辛-碱性磷酸酶，Fab 片段，羊多克隆一抗Roche11093274910
EMJH 中等基础培养基DifcoS1368JAA
钩端螺旋体 EMJH 增菌液DifcoBD 279510
封闭试剂Roche11096176001
CSPD 即用型 二钠 3-(4-甲氧基螺{1,2-二氧杂环丁烷-3,2′-(5′-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}8-4-基)苯基磷酸酯Merk11755633001
鲱鱼精子来源的脱氧核糖核酸Sigma AldrichD3159
Carestream 显影剂Carestream Health IncGBX5158621
地高辛-11-ddUTPRoche11363905910
EDTA，二钠盐（二水合物）PromegaH5032
Ficoll 400Sigma AldrichF8016
Carestream 定影剂Carestream Health IncGBX 5158605
月桂基硫酸钠（十二烷基硫酸钠；SDS）C12H25O4SNaSigma AldrichL5750
N-月桂酰肌氨酸钠盐 CH3(CH2)10CON(CH3)CH2COONaSigma AldrichL-9150它是一种阴离子表面活性剂
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40）Sigma AldrichPVP40
聚乙二醇失水山梨醇单月桂酸酯（Tween 20）Sigma Aldrich9005-64-5
氯化钠（NaCl）Sigma Aldrich7647-14-5
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma Aldrich151-21-3
氢氧化钠（NaOH）Sigma Aldrich1310-73-2
磷酸氢二钠（NaH2PO4)Sigma-Aldrich7558-79-4
末端转移酶，重组型Roche3289869103
Tris 盐酸盐（Tris HCl）Sigma-Aldrich1185-53-1
SSPE 20XSigma-AldrichS2015-1L可按照补充文件 6 自行配制
引物Sigma-Aldrich按需订购参见表 1
探针Sigma-Aldrich按需订购参见表 1
设备
Nanodrop™ One 分光光度计Thermo-ScientificND-ONE-W
可制冷微量离心机 Sigma 1-14K，适用于 1.5 ml 微量离心管在 14,000 rpm 条件下离心Sigma-Aldrich1-14K
已消毒可调移液器，量程 2–20 µl，20–200 µlGilsonSKU:F167360
一次性 1.5 ml 微量离心管（已高压灭菌）AxygenMCT-150-SP
一次性 600 µl 微量离心管（已高压灭菌）Axygen3208
一次性移液器吸头 1–10 µlAxygenT-300
一次性移液器吸头 1–200 µlAxygenTR-222-Y
点印迹装置 Bio-DotBIORAD1706545
便携式 Hergom 抽滤泵Hergom7E-A
科学光源箱（可见光 PH90-115V）HoeferPH90-115V
紫外交联仪HoeferUVC-500
Thermo Hybaid PCR Express 梯度 PCR 仪HybaidHBPX110
带 IP 板的放射自显影暗盒，14 × 17 英寸Fuji

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聚合酶链式反应和点杂交技术用于水样中Leptospira的检测
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