本研究建立了一种在大鼠模型中高效且可重复的推拿治疗冻结肩的方案。该方法将有助于研究推拿疗法治疗冻结肩的治疗方式。
本文内容
摘要
摘要
冻结肩（FS）是一种常见病症，但尚无明确的最佳治疗方法。推拿疗法作为中医（TCM）技术，在中国医院中用于治疗冻结肩患者，已显示出良好疗效，但其作用机制尚未完全阐明。在既往研究基础上，本研究旨在为冻结肩大鼠模型建立一种推拿治疗方案。将20只SD大鼠随机分为对照组（C；n = 5）、冻结肩模型组（M；n = 5）、冻结肩模型推拿治疗组（MT；n = 5）和冻结肩模型口服药物治疗组（MO；n = 5）。本研究采用石膏固定法建立冻结肩大鼠模型。评估了推拿疗法和口服地塞米松对肩关节盂肱活动范围（ROM）的影响，并进行了组织学分析。研究结果显示，推拿和口服地塞米松均能改善肩关节主动活动范围并维持关节囊结构完整性，其中推拿疗法的效果优于口服地塞米松。综上所述，本研究建立的推拿治疗方案对冻结肩具有显著疗效。
引言
肩周炎（FS），又称粘连性肩关节囊炎，是一种以肩部疼痛和活动受限为特征的自限性疾病。该病通常影响30至70岁人群，平均发病年龄为50岁，在中国人群中的患病率约为5%1。女性发病率比男性高1.6倍2。患有糖尿病、糖脂代谢紊乱或其他相关疾病的人群中，肩周炎的患病率更高，介于10%至36%之间2,3。目前临床上对肩周炎的治疗包括物理治疗、糖皮质激素药物治疗和手术治疗4。
推拿是一种传统中医（TCM）疗法，已被证明能有效缓解粘连性肩关节囊炎（FS）患者的肩痛，改善其生活质量5,6。然而，该疗法的作用机制尚不明确。因此，利用动物模型研究推拿治疗FS的效果及其作用机制至关重要。
大鼠肩关节结构复杂，与人类肩关节相似，常用于冻结肩（FS）的机制研究7。FS大鼠模型的特征表现为盂肱关节活动范围（ROM）下降以及关节囊纤维化8。此外，该模型便于观察肩关节囊的变化，可在修复损伤的同时开展病理学研究9。再者，在冻结肩治疗研究中，口服糖皮质激素常被用作对照组10。本研究旨在为FS大鼠模型建立一套推拿干预方案，并通过比较推拿疗法与口服地塞米松的疗效，验证在推拿研究中开展动物实验的可行性。
方案
本研究经山东中医药大学附属医院伦理委员会批准（编号：AWE-2022-023）。
1. 实验动物
- 20只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（7周龄，250–280 g）饲养于 在标准条件下（室温 [RT] 20–24 °C，湿度 40%–60%，12 小时光照/12 小时黑暗循环）。
2. 分组方法
- 将SD大鼠分为对照组（C）、冻结肩模型对照组（M）、冻结肩模型推拿治疗组（MT）和冻结肩模型口服药物治疗组（MO），每组各5只大鼠。同组大鼠每5只饲养于同一笼中。
- 适应性饲养7天后，使用石膏固定法对M组、MT组和MO组大鼠的一侧肩关节进行固定，持续3周，以模拟冻结肩模型，具体方法见下文。
- 对MT组大鼠实施推拿治疗，持续2周，具体操作见第4节（图1）。
- 根据成人剂量（0.75 mg/天）及大鼠与人体表面积比值（0.018），计算每千克大鼠所需的地塞米松剂量（0.0675 mg/天）。
- 于每日上午7:00对MO组大鼠进行地塞米松溶液灌胃给药，剂量为0.067 mg/kg/天，持续2周。
注意：本研究采用此分组方法以验证推拿干预方案的效果。在不同研究中，应根据实验目的选择相应的分组方法。
3. FS 模型的建立
- 使用三溴乙醇（250 mg/kg，腹腔注射）对大鼠进行麻醉11.
注意：根据机构伦理委员会的要求，一种储备液由 三溴乙醇（10 g）和 叔戊醇（10 mL） 在4 °C下保存。 使用前 用蒸馏水稀释至2%。 - 将浸有石膏的绷带应用于大鼠的右侧肩部和胸部，使右前肢肩关节保持90°内旋，持续3周（图2)12.
注意：监测大鼠以确保其能够进行行走、进食和饮水等正常生理活动。如果大鼠无法进行正常生理活动，需重新固定石膏绷带。 - 通过观察大鼠是否出现右肩关节僵硬、右前肢收缩、肌肉萎缩和跛行等症状，确认FS模型是否成功建立13.
4. 推拿手法
注意：在整个操作过程中，研究人员必须佩戴个人防护装备。所有操作均由一名专业的推拿医生完成（图3、图4 和 图5）。
- 使用智能推拿手法参数测定系统进行操作，该系统包括一个机械感受器和一台计算机（图3A）。
- 通过软件显示的三个方向上的机械感受器及力参数进行操作（图3B）。
- 用拇指实施旋转揉捏法，以0.5 kg的力度和100–120次/分钟的频率进行旋转运动（图3C）。
- 用拇指指尖实施点按法，力度为0.5 kg（图3D）。
- 对大鼠进行推拿操作，按照步骤4.1.2和4.1.3中所述的机械参数持续操作1分钟。
- 握住大鼠直至其安静（约2分钟），然后开始操作。将大鼠置于侧卧位，但可根据不同的操作方法调整体位。
- 用右手的食指和中指夹住大鼠右前肢，反复屈伸数次，以确定大鼠肩关节、肘关节及肱骨的位置。
- 用拇指指腹以0.5 kg的力度和100–120次/分钟的频率顺时针方向揉动大鼠右侧肩部、前肢及背部，持续3分钟（图4A–C）。
- 在侧卧位下操作前肢肌肉。
- 在俯卧位下操作肩部和背部肌肉。
- 用拇指指尖垂直按压穴位LI15（肩髃）、SI11（天宗）、HT01（极泉）和LI11（曲池），每个穴位按压30次，力度为0.5 kg（图4D–G）。
- 参考大鼠穴位图谱确定各穴位位置（图5）14，15。
- 在俯卧位下按压位于肩峰端前下方凹陷处的LI15穴。
- 在俯卧位下按压位于肩胛冈中点下方冈下窝凹陷处的SI11穴。
- 在仰卧位下按压位于腋窝中心的HT01穴。
- 在侧卧位下按压位于肘横纹外侧、桡侧腕伸肌内侧凹陷处的LI11穴。
- 用左手拇指和中指固定肩关节，将前肢分别置于内收、外展、前伸和后伸位置并拉伸，每个位置保持10秒（图4H–K）。
注意：该拉伸操作必须在大鼠无抵抗状态下进行。 - 若大鼠出现躁动，应暂停推拿操作，轻抚大鼠10秒使其安静，然后继续实验。
- 每日操作一次，连续进行2周。
5. 肩盂肱关节活动范围的测量
注意：应尽快完成测量过程，以防止关节囊组织退化。
- 使用三溴乙醇过量剂量（初始剂量的3倍，腹腔注射）处死大鼠后，整体切除肩胛骨及肱骨近端三分之二，暴露肩胛骨下缘。
- 将注射针头（1.2 cm × 0.45 mm）沿肱骨干插入肱骨头。
- 将两根注射针头垂直插入包裹无菌手术单的泡沫塑料上的肩胛骨上角和下角。
- 在肱骨干的注射针头上系一根细线，另一端以5 g的力牵拉，使其与肱骨干平行。测量肩胛骨下缘与肱骨干之间的角度（图6）。
注意：为确保结果可靠，应由另一位独立的研究人员进行测量。 - 使用统计分析软件以均值±标准差（SD）形式报告数据。
注意：此处使用的是SPSS软件（SPSS，版本25.0）。 - 采用单因素方差分析（ANOVA）分析组间差异。
- 使用适当的软件生成柱状图。
注意：此处使用的是GraphPad Prism 8。 - 测量完成后，通过H&E染色和Masson染色评估关节囊病理变化。
6. 切片制备
- 评估盂肱关节活动范围（ROM）后，将完整样本在4%多聚甲醛中固定3天，随后在EDTA（pH 7.2）溶液中脱钙2个月。
- 脱水后，将包含样本的包埋组织块切成5 µm厚的切片16。
- 在65 °C下烘干切片60分钟。
- 脱蜡切片。
- 将切片依次浸入二甲苯I、二甲苯II和二甲苯III中各7分钟，然后依次通过梯度乙醇溶液（无水乙醇5分钟、95%乙醇2分钟、80%乙醇2分钟、70%乙醇2分钟），最后浸入超纯水中2分钟。
7. H&E 染色
- 用苏木精染色切片5分钟，用1%盐酸乙醇溶液冲洗3秒，再用流水洗涤5分钟。
- 用伊红染色切片3分钟，然后用自来水洗涤。
- 将切片依次浸入乙醇梯度溶液中（95%乙醇I，3秒；95%乙醇II，3秒；无水乙醇I，3秒；无水乙醇II，1分钟），然后浸入二甲苯溶液系列中（二甲苯I，1分钟；二甲苯II，1分钟）。
- 在每个样本上滴加一滴中性树胶封片剂，盖上盖玻片进行封片。
- 使用倒置荧光显微镜采集图像（比例尺 = 100 µm）。
8. 马松染色
- 使用免疫组化笔在切片周围画圈，然后将切片在37 °C条件下孵育于苦味酸溶液中2小时以进行媒染。随后用清水洗涤切片，直至黄色消失。
- 用群青蓝染液处理样本3分钟，然后用蒸馏水洗涤。
- 用 Mayer 苏木精染色切片2分钟，随后在酸性乙醇分化液中处理3秒。然后用流水冲洗切片10分钟。
- 用丽春红品红染液对切片染色10分钟，随后用水洗涤。
- 将切片浸入磷钼酸溶液中10分钟。
- 向切片加入苯胺蓝染色液染色5分钟，然后用弱酸工作液洗涤2分钟。
- 按照步骤7.3所述方法进行脱水并使切片透明。
- 在每张切片上滴加一滴中性树胶封片剂，并加盖盖玻片。将切片置于通风橱中干燥。
- 按照步骤7.5所述方法采集图像。
结果
通过观察大鼠的活动能力来评估固定肩（FS）模型建立的成功与否。既往研究表明，与正常大鼠相比，石膏固定显著减少了大鼠的行走距离和行走速度17。另一项研究则指出，FS 并未影响大鼠的行走距离，跛行是最常见的表现症状13。本研究显示，建模后大鼠出现右侧肩关节僵硬、右前肢收缩、肌肉萎缩及跛行等症状。在 MT 组和 MO 组中，这些病变经 2 周干预后完全消失，但 M 组未见明显改善。
评估推拿治疗冻结肩（FS）有效性的主要标准是测量盂肱关节的活动范围（ROM）18。我们观察到，C组大鼠的盂肱关节ROM平均值为149.3° ± 5.9°，M组为111.1° ± 3.9°，MT组为128.5° ± 2.8°，MO组为119.56° ± 2.9°。如图7所示，M组大鼠的盂肱关节ROM显著低于C组（P < 0.0001）。此外，MT组和MO组的ROM均显著高于M组（P < 0.05，P < 0.0001）。然而，MO组的ROM显著低于MT组（P < 0.0001）。该结果表明，推拿可显著改善冻结肩大鼠肩关节功能。
此外，H&E 染色和 Masson 染色可进一步证明推拿在维持关节囊结构完整性及减轻纤维化方面的作用。为便于观察，采用盂肱关节的关节囊进行组织学分析。肩关节囊由滑膜层和纤维层组成19。H&E 染色显示，模型组（M 组）出现滑膜细胞增生、滑膜皱襞变扁平、红细胞淤滞及血管增生，这些是冻结肩（FS）的典型特征（图 8A、B）。在接受推拿和口服地塞米松治疗后，这些病理特征在一定程度上有所减轻（图 8C、D）。与推拿治疗组（MT 组）相比，口服药物组（MO 组）仍可见较多的滑膜细胞。Masson 染色显示各组纤维束的排列情况（黄色箭头）。正常关节囊由疏松的网状纤维构成，纤维束排列方向整齐（图 8E）。在模型组中，纤维束排列紊乱，提示存在关节囊纤维化（图 8F）。推拿治疗组大鼠的关节囊显示纤维束排列整齐且分层清晰，而口服药物组的纤维束仍存在轻微紊乱（图 8G、H）。
图 1：FS模型建立及推拿干预方案。 大鼠适应性饲养7天，FS模型建立持续21天，推拿治疗每日进行，共14天。第36天，所有大鼠被处死。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：用于建立大鼠FS模型的石膏固定。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：操作的定量控制。（A）智能按摩手法参数测定系统。（B）可测量三个方向的力：沿X方向的平行力、沿Y方向的纵向力以及沿Z方向的垂直力。（C）揉捻法的力度。红色曲线表示稳定的垂直力（0.5 kg），橙色曲线表示规律的平行力，白色曲线表示规律的纵向力。（D）点压法的力度。红色曲线表示垂直力（0.5 kg），橙色和白色曲线分别表示非平行力和纵向力。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：推拿治疗中使用的手法。（A-C）揉捏右侧肩部、前肢和背部的肌肉。（D-G）点压LI15、SI11、HT01和LI11穴位。（H-K）将前肢分别置于内收、外展、前伸和后伸位置进行牵拉。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：大鼠体内 LI15、SI11、HT01 和 LI11 穴位的解剖位置。● 侧面，○ 内侧面。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：肩盂肱关节活动范围（ROM）的测量。 将一根细线系在插入肱骨骨干的注射针头上，并在另一端施加5 g的力，使其与肱骨骨干平行。测量肩胛骨下缘与肱骨骨干之间的角度，作为肩盂肱关节活动范围（ROM）。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：三组大鼠肩肱关节活动度（ROM）比较。 数据以均值 ± 标准差表示，n = 5。显著性差异由单因素方差分析（ANOVA）确定（aP < 0.001 和 bP < 0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。
图8：肩关节囊的组织学结果。（A，E）对照组显示关节囊结构正常（H&E 染色和 Masson 染色）。（B，F）冻结肩（FS）模型组显示关节囊结构发生如下改变：滑膜皱襞变平、关节囊纤维化以及纤维束排列紊乱（H&E 染色和 Masson 染色）。（C，G）冻结肩模型联合推拿治疗组显示关节囊结构接近正常，纤维化不明显（H&E 染色和 Masson 染色）。（D，H）冻结肩模型联合口服地塞米松组显示关节囊结构接近正常，但纤维化明显（H&E 染色和 Masson 染色）。比例尺 = 100 µm。HH：肱骨头；黑箭头：滑膜皱襞；红箭头：红细胞淤滞和血管增生；黄箭头：纤维束。请点击此处查看该图的高清版本。
讨论
第一个关键步骤是模型选择。由于实施原发性冻结肩（FS）模型存在困难，通常采用石膏固定和手术内固定方法来建立FS大鼠模型9,12。在通过石膏固定3周建立的FS模型中，观察到肩关节活动受限最严重，并伴有囊膜纤维化12,20。本研究中，FS模型的建模成功率极高，达到100%。
第二个关键步骤是本方案中所采用的手法操作。本研究使用了三种手法：揉捏、按压和牵伸。软组织揉捏手法作用于肩部、肩胛骨及上臂，以放松肌肉。按压手法通过在临床实践中常用于冻结肩（FS）治疗的穴位施加压力来实现，这些穴位包括LI15、SI11、HT01和LI115,21。LI15、SI11和HT01位于肩关节囊周围区域，有助于改善关节活动范围（ROM）和肩关节功能22。LI11常用于上肢运动功能障碍的治疗，且与LI15位于同一条经络上。这种配穴方法有助于增强LI15的疗效23。在充分放松之后，采用牵伸技术以恢复功能性活动能力。
本方案中可能存在的问题是，大鼠在接受推拿时表现出强烈的抗拒，这可能是由于恐惧所致，而非超出了大鼠的耐受限度。此时应暂停操作，直至大鼠恢复平静（轻抚10秒可使大鼠安静下来）。此外，拉伸的程度应根据大鼠的症状进行调整。初期，大鼠肩关节活动受限明显，拉伸幅度应较小；随着干预的进行，大鼠肩关节功能逐渐恢复，拉伸幅度可逐步增加。判断标准为大鼠能够无抗拒地接受拉伸操作。最后，由于大鼠具有一定攻击性，而推拿需要与大鼠长时间接触，因此佩戴个人防护装备非常重要。
在推拿实验中，手法操作的量化控制最为困难。虽然可以使用按摩手法模拟器来控制单一手法的力度和频率，但当涉及多种手法和治疗部位时，这种方法存在局限性24,25。在临床实践中，推拿通常由操作者直接实施，而在本研究中，难以通过医疗设备进行干预。为了控制刺激量，可采用智能按摩技术参数测定系统来规范推拿训练。经过培训后，研究人员可在一定程度上对每只大鼠施加相同的力。本方案的主要局限性在于手法操作无法被完全控制。
推拿疗法在中国有着悠久的应用历史，不同医院的医生采用的手法和治疗部位组合各不相同。因此，建立可重复且有效的实验方案，对于动物实验和临床研究都具有重要意义。本研究中所采用的手法和穴位基于我们团队先前的一项研究，并结合了临床经验以及冻结肩动物模型的特点21。本研究证实了所建立的推拿方案在改善冻结肩大鼠肩关节功能和减轻关节囊纤维化方面的有效性。这些发现为进一步探究推拿治疗作用机制奠定了基础。此外，该方案也可为致力于研究替代医学疗法对冻结肩疗效的研究人员提供参考。
既往研究发现，推拿干预纤维化的机制可能与下调TGF-β和CTGF，同时调节MMP-1/TIMP-1的平衡有关，从而减轻细胞外基质（ECM）的生成26。推拿对肩关节囊纤维化的作用可能通过多种机制的调控实现，但仍需进一步研究以全面阐明其改善作用所涉及的具体机制。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到济南市2020年科学技术发展计划（项目编号202019059）、山东省中医药科学技术项目（项目编号2021Q080）以及齐鲁中医药传承项目（项目编号[2022]93）的资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Solarbio | P1110 | |
| 包埋机 | 常州帕斯杰医疗设备有限公司 | BM450A | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Solarbio | E1171 | |
| 苏木精-伊红（HE）染色试剂盒 | Sparkjade | EE0012 | |
| 智能按摩技术参数测定系统 | 上海杜康仪器设备有限公司 | ZTC- | |
| 切片机 | Leica | 531CM-Y43 | |
改良马松三色染色液 | 上海源叶生物科技有限公司 | R20381-8 | 波因氏液 50 mL; 天青石蓝染液 50 mL; 伊红（Mayer）染液 50 mL; 酸性乙醇分化液 50 mL; 丽春红品红染液 50 mL; 磷钼酸溶液 50 mL; 苯胺蓝染色液 50 mL; 弱酸液 50 mL |
| 三溴乙醇 | Macklin | T903147-5 |
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