大豆毛状根转化用于基因功能分析

摘要

本文介绍了一种高效生产转基因大豆毛状根的实验方案。

摘要

大豆（Glycine max）是农业中一种具有重要价值的作物，拥有数千种工业用途。大豆根部是与土壤微生物相互作用的主要部位，这些微生物既包括可固氮的共生菌，也包括致病菌，因此大豆根部遗传学研究对于提高其农业生产具有重要意义。大豆毛状根（HRs）的遗传转化由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株NCPPB2659（K599）介导，是一种研究大豆根中基因功能的高效工具，从开始到完成仅需两个月。本文提供了一项详细的操作方案，阐述了在大豆毛状根中过表达或沉默目标基因的方法。该方法包括大豆种子的灭菌、子叶接种K599菌株、筛选与收获遗传转化的毛状根，并进行RNA提取，必要时还可进行代谢物分析。该方法通量较高，可同时研究多个基因或基因网络，有助于在开展耗时较长的稳定遗传转化之前确定最优的基因工程策略。

引言

大豆（Glycine max）是农业中最具价值的作物之一。它拥有数千种商业和工业用途，例如用于食品、动物饲料、油脂，以及作为制造业原材料的来源¹。大豆能够与固氮土壤微生物（即根瘤菌）形成共生关系，这一特性进一步提升了研究大豆遗传学的重要性²。例如，精确调控大豆根部的固氮特性可减少碳排放，并显著降低对氮肥的需求³。因此，深入了解控制大豆根部生物学特性的遗传机制，在农业和工业领域具有广泛的应用前景。鉴于这些优势，建立一种可靠的分析大豆基因功能的实验方案显得尤为重要。

Agrobacterium tumefaciens 可能是植物遗传转化中最常用的工具，因为它能够将转移DNA（T-DNA）整合到多种植物物种的核基因组中。当Agrobacterium侵染植物时，会将其肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主染色体中，导致侵染部位形成肿瘤。Agrobacterium介导的转化技术已被广泛使用数十年，用于基因功能分析以及改良作物性状⁴。尽管通过A. tumefaciens介导的转化可将任何目的基因轻松转入宿主植物细胞，但该方法存在若干缺点：耗时长、成本高，并且对许多植物物种（如大豆）需要丰富的专业技术。尽管少数大豆品种可通过子叶节途径利用A. tumefaciens进行转化，但该方法效率低下，因此迫切需要一种快速且高效替代的遗传转化技术^4,5。即使是非专业人员，也可使用这种由Agrobacterium rhizogenes介导的毛根（HR）转化方法来克服上述缺点。

发根（HR）转化是一种相对较快的工具，不仅可用于分析基因功能，还可用于生物技术应用，例如生产特化代谢物和精细化学品，以及复杂的生物活性糖蛋白⁶。大豆发根的制备无需 extensive 的专业技术，只需对子叶表面进行创伤处理，随后接种Agrobacterium rhizogenes⁷即可诱导生成。A. rhizogenes 表达由其Ti质粒编码的毒力（Vir）基因，这些基因能够转移、携带并将T-DNA片段整合到植物细胞基因组中，同时刺激异位根的生长⁸。

与其他大豆基因 表达系统（如基因枪法或基于A. tumefaciens的组织、细胞和器官培养转化）相比，毛状根（HR）表达系统具有多项优势。首先，毛状根具有遗传稳定性，且可在不含激素的培养基上快速生成^1,9,10。此外，毛状根产生的特化代谢物含量相当于甚至高于天然根系^11,12。这些优势使毛状根成为一种理想的生物技术工具，适用于那些与A. tumefaciens不相容或需要特殊组织培养条件才能形成相容组织的植物物种。毛状根方法是一种高效的技术手段，可用于分析蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质亚细胞定位、重组蛋白生产、植物修复、诱变以及通过RNA测序研究全基因组效应^13,14,15。该方法还可用于研究具有工业价值的特化代谢物的生产，例如甘草素类物质（glyceollins），这类物质介导大豆对重要微生物病原体Phytophthora sojae的防御反应，并在人类中表现出显著的抗癌和神经保护活性^16,17。

本报告展示了一种简便高效的制备大豆毛状根（HR）的实验方案。与以往的毛状根转化方法相比，该方案通过在接种大豆子叶前对根瘤农杆菌（A. rhizogenes）转化子进行Ti质粒存在的预筛选，使毛状根形成率显著提高了33%至50%。我们通过转化多个过表达或沉默大豆转录因子基因的双元载体，验证了该方案的适用性。

方案

注意：建议所有后续步骤均在无菌条件下进行。

1. 大豆种子灭菌

1. 在生物安全柜中，将16-20粒处于原始状态的威廉姆斯82号大豆种子（即无裂纹或瑕疵）放入50 mL离心管中。
2. 加入30 mL 70%异丙醇，轻轻摇晃30秒，然后倾倒出酒精。
3. 轻轻摇动种子，用30 mL 10%次氯酸钠溶液处理10秒，然后将种子在室温（RT，25 °C）下静置5分钟。5分钟后，倒掉次氯酸钠溶液。
4. 重复振荡三次，每次使用30 mL无菌超纯水₂每次冲洗1分钟，弃去H₂每次洗涤之间留出 O。
5. 将灭菌后的种子置于无菌培养皿中，培养皿内铺有经5 mL萌发与共培养（GC）培养基浸润的滤纸（GC培养基为含1%蔗糖[pH = 5.8]的半倍浓度液体MS培养基[Murashige and Skoog]，经高压灭菌后添加2.5 mL/L维生素）。
6. 将培养皿置于暗处室温（25 °C）下培养3天，随后将培养皿转移至22 °C、16小时冷白T5荧光灯（100 µE m⁻² s⁻¹）光照条件下培养^-2·s^-1）培养4天，以使种子萌发。
   ​注意：丢弃皱缩或开裂的种子。最佳种子应较大且呈均匀黄色。为确保种子质量，需对至少两倍于实验所需数量的种子进行灭菌，因为部分种子可能因损伤、病害或无法萌发而不适合使用。

2. 使用K599感染子叶

注意：使用 pGWB 系列载体，因为其双重筛选可确保整个 T-DNA 盒的基因组整合。采用电穿孔法将含有目的基因的双元载体转化至 A. rhizogenes pRi2659¹⁸ 中。

1. 根据序列的 A. rhizogenes pRi2659 质粒¹⁸，设计引物以检测Ti质粒基因 VirD2 (VirD2 正向：5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3'； VirD2 反向引物：5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'；预期扩增片段大小：221 bp。转化后，进行检测 农杆菌 保留菌落的 VirD2 通过聚合酶链式反应（PCR）使用PCR试剂盒（参见 材料表）PCR循环：94 °C 预变性3 min；35个循环（94 °C 变性1 min，58 °C 退火30 sec，72 °C 延伸1 min）；最后72 °C 延伸10 min。
2. 在完成选择后 A. rhizogenes 含有两者的菌落 VirD2 以及目的基因（GOI），划线接种一些 接种至含有相应抗生素（50 mg/L）的Luria-Bertani（LB）培养基平板上，针对目标质粒进行培养，并于30 °C过夜培养。若使用壮观霉素，则添加浓度为100 mg/L。
3. 使用 P200 移液器吸头刮取约 1.5 cm 长的 K599 农杆菌 从LB平板上挑取菌落，用1 mL磷酸盐缓冲液（PB；0.01 M Na₂HPO₄，0.15 M NaCl，pH 7.5）
4. 稀释 农杆菌 在无菌的超纯H₂O（体积比 v/v = 1:1）和乙酰丁香酮（AS；二甲基亚砜[DMSO]中100 mM储备液，v/v = 1:1000）。使用比色皿在600 nm波长处测定光密度（OD600），预期最佳范围为0.5至0.8。
5. 在生物安全柜中，将已灭菌的手术刀浸入 K599 农杆菌 溶液，并在子叶内表面（近轴面，扁平侧）进行数道深约1 mm的切口。接种过程中，使用灭菌镊子固定子叶。
6. 将约6-8片子叶切面朝下放置于含有经GC培养基和乙酰丁香酮（AS）饱和的滤纸的培养皿中。
   注意：制备6块平板时，使用50 mL GC培养基和50 µL 100 mM的AS溶液即可，终浓度为100 µM。
7. 将培养板置于室温（25 °C）下，16小时光照周期（约65 µE）条件下孵育3天。
8. 将感染的子叶转移至毛状根生长培养基（HRG）平板（含半倍浓度MS、3%蔗糖［pH = 5.8］和2.6 g/L Gelzan，经高压灭菌后，加入2.5 mL/L维生素混合液和500 mg/L替门汀）。
   注意：某些替代供应商提供的替门汀存在一些问题，其中K599未被排除。建议在HRG培养基中使用较高的培养皿（100 mm × 25 mm）。
9. 在22 °C的培养室中，以100 µE光照、16小时光周期的条件培养HRG平板，直至观察到具有2-3 cm长侧根的主根（约3-4周）。

3. HRs 的筛选与收获

1. 使用无菌手术刀和镊子采集从愈伤组织生长出的主根（长度为 5–7 cm），主根上应带有侧根（长度为 2–3 cm）。将采集的材料转移至含有适当抗生素的选择性 HRG 平板上。让毛状根在选择性 HRG 平板上继续生长 5 天。
   注：通常使用卡那霉素（50 mg/L）、潮霉素（50 mg/L）或草铵膦（10 mg/L）进行筛选。对于表达载体，pGWB2 用于过表达，pANDA35HK 用于 RNAi 沉默，pGWB6 用于亚细胞定位，pMDC7 用于诱导型表达。
2. 第 5 天时，采集带有长度为 3–6 cm 侧根的转基因毛状根。若需观察荧光蛋白，应选择侧根自身荧光较弱的样本。若进行诱导子或化学处理，将侧根切成 1 cm 长的小段，取约 100 mg 堆放于 HRG 琼脂上，然后用 80 µL 相应处理液充分浸润样本堆，并将平板置于室温（25 °C）下培养。
3. 在完成所需处理时间后，进行 RNA 或代谢物提取。
4. 提取 RNA 时，先用无菌纸巾迅速吸干根部表面水分，然后直接将根转入 2 mL 微量离心管中。
5. 立即用封口膜密封管口，用尖头镊子在封口膜上刺两个小孔，随后将离心管浸入液氮中。冷冻干燥 3 天后，将样品储存于 -80 °C。
   注：必须选择呈白色的毛状根。在选择性平板上生长 5 天后，转基因毛状根仍保持白色，而非转基因根则会变为褐色。

结果

代表性结果来自已发表的数据^19,20转化菌株K599的菌落PCR（cPCR）结果 农杆菌 如图所示 图1。如阳性菌落所示 图1，通过巢式PCR检测目的基因（图1A）。然而，有三分之一到一半的菌落对该检测呈阴性 VirD2 基因筛选图1B），表明Ti质粒已丢失，无法形成愈伤组织或毛状根。 图2 展示了大豆毛状根的总体制备流程及基因表达分析。 图3 展示GFP-GmJAZ1-6的亚细胞定位。 图4 是一种基因表达分析，显示甘草素转录因子的过表达 GmHSF6-1

讨论

在过去的十年中，大豆高通量转化（HR）方法已被开发为一种强大的工具，用于研究参与固氮^22,23、生物和非生物胁迫耐受性^24,25以及代谢物生物合成途径^26,27的基因。了解植物如何产生代谢物对农业生产及制药行业具有广泛的应用价值，因为该知识可用于研究参与介导针对病原体生化防御的基因网络²⁸。

为提高生产效率并降低成本，本方案对实验流程进行了简化。例如，不再使用成本较高的含凝固剂的固体培养基，而是采用工业级纸巾浸润液体培养基并在无菌条件下萌发大豆种子。由于多种微生物（如真菌和酵母）可能造成污染，因此无菌操作技术和无菌工作环境的维持对于发根（HR）转化实验至关重要。 体外 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮	Cayman	23224
漂白剂	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
琼脂糖凝胶	Phytotech	HYY3251089A
潮霉素	Phytotech	HHA0397050B
异丙醇	Fisher chemical	206462
卡那霉素	Phytotech	SQS0378007G
LB 粉末	Fisher bioreagents	200318
MS 粉末	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
培养皿	Fisherbrand	08-757-11	100 mm × 25 mm
草铵膦	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR 试剂盒	Sigma	R4775
蔗糖	Bioshop	2D76475
特美汀	Caisson labs	12222002
维生素	Caisson labs	2211010