大豆毛状根转化用于基因功能分析

摘要

本文介绍了一种高效生产转基因大豆毛状根的实验方案。

摘要

大豆（Glycine max）是农业中一种具有重要价值的作物，拥有数千种工业用途。大豆根部是与土壤微生物相互作用的主要部位，这些微生物既包括可固氮的共生菌，也包括致病菌，因此大豆根部遗传学研究对于提高其农业生产具有重要意义。大豆毛状根（HRs）的遗传转化由根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）菌株NCPPB2659（K599）介导，是一种研究大豆根中基因功能的高效工具，从开始到完成仅需两个月。本文提供了一项详细的操作方案，阐述了在大豆毛状根中过表达或沉默目标基因的方法。该方法包括大豆种子的灭菌、子叶接种K599菌株、筛选与收获遗传转化的毛状根，并进行RNA提取，必要时还可进行代谢物分析。该方法通量较高，可同时研究多个基因或基因网络，有助于在开展耗时较长的稳定遗传转化之前确定最优的基因工程策略。

引言

大豆（Glycine max）是农业中最具价值的作物之一。它拥有数千种商业和工业用途，例如用于食品、动物饲料、油脂，以及作为制造业原材料的来源¹。大豆能够与固氮土壤微生物（即根瘤菌）形成共生关系，这一特性进一步提升了研究大豆遗传学的重要性²。例如，精确调控大豆根部的固氮特性可减少碳排放，并显著降低对氮肥的需求³。因此，深入了解控制大豆根部生物学特性的遗传机制，在农业和工业领域具有广泛的应用前景。鉴于这些优势，建立一种可靠的分析大豆基因功能的实验方案显得尤为重要。

Agrobacterium tumefaciens 可能是植物遗传转化中最常用的工具，因为它能够将转移DNA（T-DNA）整合到多种植物物种的核基因组中。当Agrobacterium侵染植物时，会将其肿瘤诱导（Ti）质粒转移到宿主染色体中，导致侵染部位形成肿瘤。Agrobacterium介导的转化技术已被广泛使用数十年，用于基因功能分析以及改良作物性状⁴。尽管通过A. tumefaciens介导的转化可将任何目的基因轻松转入宿主植物细胞，但该方法存在若干缺点：耗时长、成本高，并且对许多植物物种（如大豆）需要丰富的专业技术。尽管少数大豆品种可....

方案

注意：建议所有后续步骤均在无菌条件下进行。

1. 大豆种子灭菌

1. 在生物安全柜中，将16-20粒处于原始状态的威廉姆斯82号大豆种子（即无裂纹或瑕疵）放入50 mL离心管中。
2. 加入30 mL 70%异丙醇，轻轻摇晃30秒，然后倾倒出酒精。
3. 轻轻摇动种子，用30 mL 10%次氯酸钠溶液处理10秒，然后将种子在室温（RT，25 °C）下静置5分钟。5分钟后，倒掉次氯酸钠溶液。
4. 重复振荡三次，每次使用30 mL无菌超纯水₂每次冲洗1分钟，弃去H₂每次洗涤之间留出 O。
5. 将灭菌后的种子置于无菌培养皿中，培养皿内铺有经5 mL萌发与共培养（GC）培养基浸润的滤纸（GC培养基为含1%蔗糖[pH = 5.8]的半倍浓度液体MS培养基[Murashige and Skoog]，经高压灭菌后添加2.5 mL/L维生素）。
6. 将培养皿置于暗处室温（25 °C）下培养3天，随后将培养皿转移至22 °C、16小时冷白T5荧光灯（100 µE m⁻² s⁻¹）光照条件下培养^-2·s^-1）培养4天，以使种子萌发。
   ​注意：丢弃皱缩或开裂的种子。最佳种子应较大且呈均匀黄色。为确保种子质量，需对至少两倍于实验所需数量的种子进行灭菌，因为部分种....

结果

代表性结果来自已发表的数据^19,20转化菌株K599的菌落PCR（cPCR）结果 农杆菌 如图所示 图1。如阳性菌落所示 图1，通过巢式PCR检测目的基因（图1A）。然而，有三分之一到一半的菌落对该检测呈阴性 VirD2 基因筛选图1B），表明Ti质粒已丢失，无法形成愈伤组织或毛状根。 图2 展示了大豆毛状根的总体制备流程及基因表达分析。 图3 展示GFP-GmJAZ1-6的亚细胞定位。 图4 是一种基因表达分析，显示甘草素转录因子的过表达 GmHSF6-1

讨论

在过去的十年中，大豆高通量转化（HR）方法已被开发为一种强大的工具，用于研究参与固氮^22,23、生物和非生物胁迫耐受性^24,25以及代谢物生物合成途径^26,27的基因。了解植物如何产生代谢物对农业生产及制药行业具有广泛的应用价值，因为该知识可用于研究参与介导针对病原体生化防御的基因网络²⁸。

为提高生产效率并降低成本，本方案对实验流程进行了简化。例如，不再使用成本较高的含凝固剂的固体培养基，而是采用工业级纸巾浸润液体培养基并在无菌条件下萌发大豆种子。由于多种微生物（如真菌和酵母）可能造成污染，因此无菌操作技术和无菌工作环境的维持对于发根（HR）转化实验至关重要。 体外 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酰丁香酮	Cayman	23224
漂白剂	lavo	21124
DMSO	Fisher bioreagents	195679
琼脂糖凝胶	Phytotech	HYY3251089A
潮霉素	Phytotech	HHA0397050B
异丙醇	Fisher chemical	206462
卡那霉素	Phytotech	SQS0378007G
LB 粉末	Fisher bioreagents	200318
MS 粉末	Caisson labs	2210001
Na2HPO4	Fisher bioreagents	194171
NaCl	Fisher chemical	192946
培养皿	Fisherbrand	08-757-11	100 mm × 25 mm
草铵膦	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp PCR 试剂盒	Sigma	R4775
蔗糖	Bioshop	2D76475
特美汀	Caisson labs	12222002
维生素	Caisson labs	2211010