小鼠胰腺活体成像的稳定窗口技术

摘要

我们介绍一种用于小鼠胰腺亚细胞分辨率成像的稳定植入式光学窗口的外科手术植入方案，可实现对健康和病变胰腺的连续性及纵向研究。

摘要

胰腺的生理学与病理生理学十分复杂。胰腺疾病（如胰腺炎和胰腺导管腺癌（PDAC））具有较高的发病率和死亡率。活体成像（IVI）是一种强大的技术，能够在健康和疾病状态下对组织进行高分辨率成像，实现对细胞动态的实时观察。由于小鼠胰腺位于腹腔深处且组织柔软，极易受到损伤并产生运动伪影，因此对其进行活体成像面临重大挑战。

本文描述了用于小鼠胰腺活体成像的稳定窗植入技术（Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas, SWIP）的操作流程。SWIP 可实现对小鼠胰腺在正常健康状态、由胆囊收缩素诱导从健康胰腺向急性胰腺炎转变的过程，以及胰腺肿瘤等恶性状态下的活体成像。结合遗传标记细胞或荧光染料注射，SWIP 能够检测单细胞及亚细胞水平的动态过程（包括单个细胞和集体迁移行为），并支持对同一感兴趣区域进行连续多日的重复成像。

捕获肿瘤细胞迁移能力具有重要意义，因为胰腺导管腺癌（PDAC）相关死亡的主要原因是严重的转移负担。了解PDAC中转移的生理动态是目前尚未满足的关键需求，对于改善患者预后至关重要。总体而言，SWIP提供了更优的成像稳定性，拓展了活体成像技术（IVI）在健康胰腺及恶性胰腺疾病中的应用范围。

引言

良性和恶性胰腺疾病均可能危及生命，目前对其病理生理学的理解仍存在显著空白。胰腺炎（即胰腺的炎症）是美国因胃肠道疾病导致住院和再入院的第三大主要原因，与较高的发病率、死亡率以及社会经济负担密切相关¹。胰腺导管腺癌（PDAC）是癌症相关死亡的第三大主要原因²，占绝大多数胰腺恶性肿瘤病例³，其5年生存率仅为11%²。PDAC患者癌症相关死亡的主要原因是严重的转移性负担。遗憾的是，大多数患者在初诊时已处于转移阶段。因此，深入理解PDAC中转移的动态过程，是当前癌症研究领域亟待解决的关键科学问题。

胰腺炎性反应及转移级联过程的机制目前尚不明确。造成这一知识空白的主要原因是无法在活体（in vivo）条件下观察胰腺细胞的动态变化。对这些细胞动态进行直接观察，有望揭示关键的干预靶点，从而提升胰腺疾病患者的诊断与治疗水平。

活体成像（IVI）是一种显微技术，可使研究人员实时观察和研究活体动物中的生物学过程。IVI 能够在生物过程所处的天然环境中，以高分辨率直接可视化细胞内和微环境动态的 in vivo 过程。因此，IVI 实现了对生理和病理过程的 in vivo 观察。

方案

本方案中描述的所有操作均遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 窗口钝化

注意：不锈钢的钝化处理可清除金属表面的污染物，并形成一层薄氧化层，从而显著提高金属与软组织的生物相容性，甚至超过钛的生物相容性¹⁶。

1. 通过使用1%（w/v）具有酶活性的洗涤剂溶液清洗光学窗口框，开始钝化过程。
2. 将框体浸入玻璃瓶中的5%（w/v）氢氧化钠溶液，在70 °C下处理30分钟。
3. 取出框体，并用去离子水冲洗。
4. 将框体浸入新玻璃瓶中的7%（w/v）柠檬酸溶液，在55 °C下处理10分钟。
5. 取出框体，并再次用去离子水冲洗。
6. 重复步骤1.2，最后再用去离子水对窗口框进行一次彻底冲洗。

2. 肿瘤移植或窗口手术的准备工作

注意：对于胰腺肿瘤的研究，必须先将肿瘤细胞植入并使其生长形成明显的肿瘤。为了在活体中可视化肿瘤细胞，建议使用经过基因改造、可表达荧光蛋白（如 Dendra2）的细胞。 ....

结果

图1 改编自 Du 等人的研究¹⁵，展示了小鼠胰腺时间推移体内成像（IVI）视频中的图像帧。在初始稳定期（成像的前一小时，图1A）内可观察到一定程度的组织运动。然而，在此稳定期之后继续成像（>75 分钟），我们观察到横向和轴向稳定性有所提高（图1B）。将 SWIP 与先前的 AIW 和 PIW 成像窗口的稳定性进行比较后发现，所有窗口均需要一段初始稳定时间。但总体而言，SWIP 表现出最低的漂移水平，最适合长期成像（图1C-K）。图像采集使用自行搭建的双光子显微镜²⁴，激发波长为 880 nm，以每帧间隔 1.7 分钟获取 z 轴堆栈时间序列（视野 [FOV] 大小 = 340 × 340 µm，像素大小 0.67 µm），共 11 层切片.......

讨论

本文所述的SWIP技术通过采用十字缝合篮式方法，改进了胰腺组织的稳定方式。早期的腹部成像窗口（AIW）虽实现了腹腔内器官的活体成像（IVI），但未能有效限制胰腺等软组织的移动。为此，Park等人开发了一种胰腺成像窗口（PIW），该窗口包含一个水平金属支架，可在保持与玻璃盖玻片接触的同时，更好地稳定胰腺组织。尽管该方法改善了侧向稳定性，但由于实体胰腺肿瘤的尺寸通常超过支架与盖玻片之间的狭窄空间，因而限制了对这类肿瘤的成像。SWIP技术通过使用十字缝合篮式结构固定胰腺，有效限制了组织的轴向和侧向移动，同时能够容纳较大尺寸（≤10 mm）的实体肿瘤，从而解决了这一问题。

此前已对SWIP与先前的成像窗（如AIW和PIW）进行了直接比较¹⁵。这一点在图1中有所展示，该图改编自Du等人的研究¹⁵，其中通过追踪细胞解剖特征（如细胞核或血管）来量化横向和轴向位移。所有成像窗在成像开始后的约第一个小时内均表现出一定的稳定期需求。在此期间，AIW.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% (w/v) 酶活性去垢剂溶液	Alconox Inc	NA	浓缩型阴离子去垢剂，含蛋白酶，适用于手工和超声波清洗
5% (w/v) 氢氧化钠溶液	Sigma-Aldrich	S8045	钝化试剂
5 mm 盖玻片	Electron Microscopy Sciences	72296-05	圆形玻璃盖玻片
7% (w/v) 柠檬酸溶液	Sigma-Aldrich	251275	钝化试剂
28G 1 mL BD 胰岛素注射器	BD	329410	用于细胞注射的注射器
Baytril 100 (enrofloxacin)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	抗生素
台式加热灯	McMaster-Carr	3349K51	加热灯
布托啡诺 0.3 mg/mL	Covetrus North America	059122	布托啡诺镇痛剂
Castroviejo 弯头剪刀	World Precision Instruments	WP2220	用于组织切割的剪刀
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	000664	C57BL/6J 小鼠
氯己定溶液	Durvet	7-45801-10258-3	氯己定消毒液
压缩空气罐	Falcon	DPSJB-12	用于干燥组织的压缩空气
氰基丙烯酸酯 - 凝胶型超级胶水	Staples	234790-6	皮肤粘合胶
氰基丙烯酸酯 - 液体型超级胶水	Staples	LOC1647358	盖玻片粘合胶
DPBS 1x	Corning	21-031-CV	用于cerulein/细胞注射的DPBS
Gemini 电凝套装	Harvard Apparatus	726067	电凝笔
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	珠式灭菌器
Graefe 微型解剖镊；带齿；轻微弯曲；0.8 mm 尖端宽度；4" 长度	Roboz Surgical	RS-5135	Graefe 微型解剖镊
成像显微镜	NA	NA	参见 Entenberg 等，2011 [27]
成像软件	NA	NA	参见 Entenberg 等，2011 [27]
Isoethesia (异氟烷)	Henry Schein Animal Health	50033	异氟烷麻醉剂
Kim Wipes 擦拭纸	Fisher Scientific	06-666-A	Kim Wipes 擦拭纸
实验室胶带	Fisher Scientific	159015R	实验室胶带
小鼠解剖工具包	World Precision Instruments	MOUSEKIT	外科器械
小鼠足垫脉搏血氧传感器	Kent Scientific Corpo	MSTAT Sensor-MSE	脉搏血氧仪
Mouse Surgisuite	Kent Scientific	SURGI-M04	加热平台
Nair 脱毛乳液	Amazon	B001RVMR7K	脱毛剂乳液
氧气	TechAir	OX TM	氧气
PERMA-HAND 黑色编织丝线缝合线，ETHICON 5-0 规格	VWR	95056-872	丝线缝合线
1× 磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-023	PBS
PhysioSuite 系统	Kent Scientific	PhysioSuite	加热平台控制器
Puralube	Henry Schein Animal Health	008897	眼用润滑剂
Puritan 非无菌棉签	Fisher Scientific	867WCNOGLUE	棉签
SHARP 精密屏障吸头，适用于 P-100，100 µL	Denville Scientific Inc.	P1125	100 µL 移液吸头
四甲基罗丹明异硫氰酸酯–葡聚糖	Sigma-Aldrich	T1287-500MG	血管标记物
窗式固定板	NA	NA	专用于将观察窗固定在显微镜载物台上的定制板。该板由厚度为 0.008 英寸的不锈钢薄片制成。具体尺寸参见 Entenberg 等，2018 [8]。
窗式框架	NA	NA	观察窗由一个带中央开口的钢制框架构成，可容纳一个 5 mm 盖玻片。框架周围绕有一圈 1.75 mm 的凹槽，为腹膜肌肉和皮肤层提供附着空间。参见 Entenberg 等，2018 [8]。