本文介绍了两种无需外加液相即可将无细胞蛋白合成反应嵌入宏观水凝胶基质中的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
合成基因网络为科学家和工程师提供了一个平台，用于设计和构建在基因水平上编码功能的新型系统。尽管基因网络的主要应用模式是在细胞底盘内实现，但合成基因网络也可部署于无细胞环境中。无细胞基因网络具有广阔的应用前景，例如作为生物传感器，已成功用于检测生物性目标物（如埃博拉病毒、寨卡病毒和SARS-CoV-2病毒）以及非生物性目标物（如重金属、硫化物、农药及其他有机污染物）。无细胞系统通常以液态形式在反应容器中使用。然而，若能将此类反应嵌入物理基质中，则可能促进其在更广泛环境中的应用。为此，研究人员已开发出将无细胞蛋白合成（CFPS）反应嵌入多种水凝胶基质中的方法。水凝胶材料的一个关键特性是其高含水量及良好的水化重构能力。此外，水凝胶还具备多种功能上有利的物理和化学特性。水凝胶可经冷冻干燥后储存，并在使用时重新水化。本文提供了两种将CFPS反应包埋于水凝胶中并进行检测的分步操作方案。首先，可将一个CFPS系统嵌入水凝胶中 通过 通过细胞裂解物复水。随后，水凝胶内的系统可被诱导或组成型表达，从而实现水凝胶中完整蛋白质的表达。其次，可在水凝胶聚合时将细胞裂解物引入其中，整个系统随后可进行冷冻干燥，并在后续使用含有诱导剂的水溶液进行复水，该诱导剂用于激活水凝胶内编码的表达系统。这些方法有望实现无细胞基因网络，赋予水凝胶材料感知能力，并具备在实验室以外环境中应用的潜力。
引言
合成生物学融合了多种工程学科，旨在设计和构建具有自然界中不存在功能的生物部件、装置和系统。目前大多数合成生物学方法仍局限于活细胞内进行。相比之下，无细胞合成生物学系统在设计上提供了前所未有的控制性和自由度，能够在摆脱传统基于细胞的基因表达方法诸多限制的同时，提高灵活性并缩短生物系统构建周期1,2,3。无细胞蛋白表达系统（CFPS）正被越来越多地应用于多个学科领域，包括构建人工细胞、原型化遗传回路、开发生物传感器以及代谢物生产4,5,6。此外，CFPS在表达难以在活细胞中有效产生的重组蛋白方面尤其有用，例如易聚集蛋白、跨膜蛋白和毒性蛋白6,7,8。
CFPS 通常在液相反应中进行。然而，这种方法可能限制其在某些情况下的应用，因为任何液相无细胞装置都必须置于反应容器中。本文所述方法的开发 rationale 在于提供将无细胞合....
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方案
1. 细胞裂解缓冲液和培养基的制备
- 2x YT+P 琼脂和培养基的制备
- 通过称取 16 g/L 胰蛋白胨、10 g/L 酵母提取物、5 g/L NaCl、40 mL/L 1 M K2HPO4、22 mL/L 1 M KH2PO4 和 15 g/L 琼脂来制备 2x YT+P 琼脂。对于 2x YT+P 液体培养基，采用上述相同成分但不加琼脂。
- 将 2x YT+P 培养基或琼脂通过高压灭菌进行灭菌。
- S30A 缓冲液的制备
- 使用 5.88 g/L 谷氨酸镁、12.195 g/L 谷氨酸钾和 25 mL/L 2 M Tris 配制 S30A 缓冲液，并用乙酸调节 pH 至 7.7。
- S30A 缓冲液可在 4 °C 下保存最多 1 周。
- S30B 缓冲液的制备
- 使用 5.88 g/L 谷氨酸镁和 12.195 g/L 谷氨酸钾配制 S30B 缓冲液，并用 2 M Tris 调节 pH 至 8.2。
- S30B 缓冲液可在 4 °C 下保存最多 1 周。
2.....
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结果
本方案详细介绍了将CFPS反应嵌入水凝胶基质的两种方法，图1展示了这两种方法的示意图。两种方法均可进行冷冻干燥并实现长期保存。方法A因以下两个原因被最广泛使用：首先，该方法已被证明适用于多种水凝胶材料11；其次，方法A支持对多个遗传构建体进行并行测试。方法B则更适用于优化系统的构建及现场应用。两种方案均可一次性制备大量样品，有助于提高实验的可重复性。这一特点对于该技术的长期发展也十分有利，因为冻干后的装置可以干燥状态运输，并在需要时于现场重新溶解使用。
本方案及图1中所述方法可用于单个基因构建体的表达，也可用于多个基因的共表达。在图2中展示的数据表明，eGFP和mCherry均能在0.75%琼脂糖凝胶中表达。通过共聚焦显微镜确认，蛋白质表达在水凝胶内部（包括深层平面）分布均匀。具体而言，蛋白质合成并未局限于水凝胶的外缘，内部荧光并非由蛋白质扩散所致。为验证这.......
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讨论
本文概述了两种将基于大肠杆菌（E. coli）细胞裂解液的无细胞蛋白表达系统（CFPS）反应整合到琼脂糖水凝胶中的实验方案。这些方法可实现基因在材料内部的同步表达。该方案可适用于其他CFPS系统，并已成功结合市售CFPS试剂盒以及本文详述的实验室制备细胞裂解液进行操作。重要的是，该方案可在无需外源液相的条件下实现基因表达，这意味着系统为自包含式，无需额外的无细胞反应浴。与以往在水凝胶内进行CFPS反应的方法不同，本方法无需外部缓冲液和反应容器。预计这些方法将帮助研究人员探索利用水凝胶材料作为无细胞合成生物学装置的底盘，最终推动此类装置走出实验室并实现实际应用。
两种方法成功的关键在于使用高质量的细胞裂解液。高质量的细胞裂解液应具有高蛋白浓度（>40 mg/mL），在整个制备过程中需保持低温，且不应经历多次冻融循环。此外，DNA模板的高纯度也至关重要。为实现这一点，应使用高纯度、高得率的质粒提取试剂盒从细胞中提取质粒，以确保转录反应能在无细胞蛋白合成（CFPS）环境中顺利进行。这些关键步骤适用于所有CFPS应用，并非本方法所独有。然而，CFPS组分的制备对实.......
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致谢
作者非常感谢生物技术和生物科学研究理事会资助项目 BB/V017551/1（S.K.、T.P.H.）和 BB/W01095X/1（A.L.、T.P.H.），以及工程与物理科学研究理事会—国防科学技术实验室资助项目 EP/N026683/1（C.J.W.、A.M.B.、T.P.H.）的支持。支持本出版物的数据在以下网址公开提供：10.25405/data.ncl.22232452。为了实现开放获取，作者已对由此产生的任何作者接受稿版本应用了知识共享署名（CC BY）许可。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 材料 | |||
| 3-PGA | Santa Cruz Biotechnology | sc-214793B | |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 琼脂 | Thermo Fisher Scientific | A10752.22 | |
| 琼脂糖 | Severn Biotech | 30-15-50 | |
| 氨基酸混合物试剂盒 | VWR | BTRABR1401801 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A8937-1G | |
| cAMP | Sigma-Aldrich | A9501-1G | |
| 辅酶A（CoA） | Sigma-Aldrich | C4282-100MG | |
| CTP | Alfa Aesar | J14121.MC | |
| DTT | Thermo Fisher Scientific | R0862 | |
| 亚叶酸 | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
| GTP | Carbosynth | NG01208 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | |
| K-谷氨酸盐 | Sigma-Aldrich | G1149-100G | |
| 溶菌酶 | Sigma-Aldrich | L6876-1G | |
| Mg-谷氨酸盐 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N6522-250MG | |
| PEG-8000 | Promega | V3011 | |
| 氢氧化钾（KOH） | Sigma-Aldrich | 757551-5G | |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | Sigma-Aldrich | P3786-500G | |
| 磷酸二氢钾（KH2PO4） | Sigma-Aldrich | RDD037-500G | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P2714-1BTL | |
| Qubit 蛋白浓度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A50668 | |
| Rossetta 2 DE 3 大肠杆菌 | Sigma-Aldrich | 71397-3 | |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S9888-500G | |
| 亚精胺 | Sigma-Aldrich | 85558-1G | |
| 胰蛋白胨 | Thermo Fisher Scientific | 211705 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | GE17-1321-01 | |
| tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
| UTP | Alfa Aesar | J23160.MC | |
| 酵母提取物 | Sigma-Aldrich | Y1625-1KG | |
| 设备 | |||
| 1.5 mL 微量离心管 | Sigma-Aldrich | HS4323-500EA | |
| 10K MWCO 透析盒 | Thermo Fisher Scientific | 66381 | |
| 15 mL 离心管 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL 离心瓶 | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 500 mL 离心瓶 | Thermo Fisher Scientific | 3120-9500 | |
| Alpha 1-2 LD Plus 冷冻干燥机 | Christ | 货号 101521, 101522, 101527 | |
| 台式离心机 | Thermo Fisher Scientific | H-X3R | |
| 黑色 384 孔微孔板 | Fischer Scientific | 66 | |
| 比色皿 | Thermo Fisher Scientific | 222S | |
| Elga Purelab Chorus 超纯水系统 | Elga | ##### | |
| Eppendorf 微量离心机 5425R | Eppendorf | EP00532 | |
| 高速离心机 | Beckman Coulter | B34183 | |
| JMP 许可证 | SAS Institute | 15 | |
| 磁力搅拌器 | Fischer Scientific | 15353518 | |
| Parafilm 封口膜 | Amcor | PM-966 | |
| 分光光度计（生物分光光度计） | Eppendorf | 16713 | |
| 移液器及吸头 | Gilson | ##### | |
| 精密天平 | Sartorius | 16384738 | |
| Qubit 2.0 荧光计 | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| 摇床培养箱 | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| 超声破碎仪（超声波发生器） | Thermo Fisher Scientific | 12893543 | |
| 恒温培养箱 | Sanyo | MIR-162 | |
| 注射器及针头 | Thermo Fisher Scientific | 66490 | |
| Thermo max Q8000（摇床培养箱） | Thermo Fisher Scientific | SHKE8000 | |
| Varioskan Lux 多功能酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | VLBL00GD1 | |
| Vortex Genie 2 涡旋振荡器 | Cole-parmer | OU-04724-05 | |
| VWR PHenomenal pH 1100 L，pH/mV/°C 测量仪 | VWR | 662-1657 |
参考文献
- Lu, Y. Cell-free synthetic biology: Engineering in an open world. Synthetic and System Biotechnology. 2 (1), 23-27 (2017).
- Perez, J. G., Stark, J. C., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Engineering beyond the cell. Cold Spring Harbo....
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