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方法文章

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

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DOI：

10.3791/65515

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2023年9月22日

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型

摘要

三维（3D）包封类球体对于充分模拟肿瘤微环境以实现细胞的最佳生长至关重要。在此，我们设计了一种 体外 用于模拟肿瘤细胞外微环境的胶质母细胞瘤三维球体包封模型。首先，我们采用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）制备方形锥形微孔模具。利用这些微孔模具可形成尺寸精确可控（50–500 μm）的肿瘤球体。球体形成后，将其收集并包封于聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）基水凝胶中。PEG水凝胶是一种适用于球体包封的多功能平台，因其水凝胶特性（如刚度、可降解性和细胞黏附性）可独立调控。本研究中，我们采用一种典型的软性水凝胶（~8 kPa）对胶质母细胞瘤球体进行包封。最后，建立了一种对球体进行染色和成像的方法，以通过共聚焦显微镜获取高质量图像。由于球体核心致密而外围相对稀疏，成像可能存在困难，但使用透明化溶液结合共聚焦光学切片可有效缓解此类成像难题。综上所述，我们展示了一种制备均一球体、将其包封于PEG水凝胶中，并对包封后的球体进行共聚焦显微成像的方法，用于研究球体生长行为及多种细胞-基质相互作用。

引言

肿瘤球体已成为研究癌症病因、病理学及药物反应性的有用体外工具1。传统上，肿瘤球体在低黏附培养板或生物反应器等条件下培养，以促进细胞-细胞黏附而非细胞-表面黏附2。然而，目前人们认识到，为了更真实地模拟肿瘤微环境，体外肿瘤球体模型应同时包含细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这促使多个研究团队设计出如水凝胶等支架材料，用于包载肿瘤球体3,4。此类基于水凝胶的肿瘤球体模型有助于阐明细胞-细胞和细胞-基质相互作用对多种细胞行为的影响，例如细胞活力、增殖、干性或治疗反应性3。

在此，我们描述了一种将胶质母细胞瘤类球体包埋于聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案。已有大量文献报道了将胶质母细胞瘤细胞类球体包埋于水凝胶中的方法。例如，通过将U87细胞包埋于修饰有RGDS黏附配体并以酶可降解肽交联的PEG水凝胶中形成类球体，以研究水凝胶刚度对细胞行为的影响。5U87细胞还已在其他基于聚乙二醇或透明质酸的水凝胶中形成，以扩增肿瘤干细胞群体6 或探索基质介导的化疗耐药机制7,8,9胶质母细胞瘤类球体还被包埋于明胶水凝胶中，以研究小胶质细胞与癌细胞之间的相互作用及其对细胞侵袭的影响10总体而言，这些研究已证明了基于水凝胶的 体外 在理解胶质母细胞瘤病理及制定治疗方案中的模型应用。

此外，肿瘤球体的制备和水凝胶包封存在多种不同的方法11。例如，可将分散的细胞接种到水凝胶中，并使其随时间逐渐形成球体5,12。此类方法的一个缺点是所形成的球体具有多分散性，可能导致细胞反应的差异。为了生成均一的球体，可将细胞包封于微凝胶中并进行长期培养，直至细胞侵入并重塑凝胶13；或者将细胞接种至具有球形“孔洞”的模板化凝胶中，使其自发聚集形成球体14。这些方法的不足之处在于操作相对复杂，需要使用液滴发生器或其他手段来制备微凝胶或凝胶中的“孔洞”，且球体生长和成熟所需时间较长。另一种方法是先在微孔板9,15,16或悬滴培养板17,18中预先形成球体，再将其包封入水凝胶中，类似于本文所述的技术。这些方法更为简便，且可实现较高通量的操作。有趣的是，已有研究表明，球体的形成方法本身可能影响球体中细胞的行为，例如基因表达、细胞增殖或对药物的响应性19,20。

本文以胶质母细胞瘤为研究重点，因为这是一种实体瘤，其天然微环境是柔软且具有纳米孔结构的脑基质21，而这一环境可通过柔软的纳米孔水凝胶进行模拟。胶质母细胞瘤也是目前尚无有效治愈手段的最致命脑癌22。然而，本文所述方案也可用于包封代表任何实体瘤的类球体。我们选择使用通过迈克尔加成反应形成的聚乙二醇（PEG）水凝胶23。PEG是一种合成的、不可降解且生物相容性良好的水凝胶，具有化学惰性，可作为支架和细胞的物理支撑，但本身不支持细胞黏附23。细胞黏附性可通过共价连接完整蛋白或黏附性配体单独引入24，而可降解性则可通过化学修饰PEG聚合物链，或引入可水解或酶解的交联剂来实现25,26。这种方法使得水凝胶的生化特性可独立于其力学或物理特性进行调控，从而在研究细胞-基质相互作用时具有优势。迈克尔型凝胶化反应具有选择性，并可在生理条件下发生，因此只需将类球体与水凝胶前体溶液混合，即可实现类球体的包封。

总体而言，本文介绍的方法具有多个显著特点。首先，在多孔板装置中制备肿瘤类球体效率高、速度快，且所需材料成本较低。其次，该方法能够大规模生产多种尺寸、低多分散性的类球体。最后，仅需使用 commercially available 的材料即可完成。通过研究基底特性对类球体细胞活力、圆形度及细胞干性的影响，展示了该方法的应用价值。

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方案

1. 溶液配制

  1. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）前体溶液的制备
    1. 制备负相PDMS前体溶液（也用于胶粘剂前体溶液）。使用刮刀将弹性体材料舀入称量皿中并称重。按照1:10的比例将固化剂加入弹性体基质中。在塑料称量皿中使用刮刀轻轻而充分地混合PDMS与固化剂。
      注意：此PDMS预聚体溶液将倒入6孔方形锥形微孔板中，以形成负模。该溶液与用于胶粘剂预聚体溶液的相同。
    2. 制备阳性的PDMS前体溶液。使用刮刀将弹性体基质转移至称量舟中并称重。按照1:9的比例将固化剂加入弹性体基质中。使用刮刀在塑料称量舟中轻轻而充分地混合PDMS与固化剂。
      注意：此PDMS预聚体溶液随后将被倒入负模中，以形成正模。
  2. 0.3 M 三乙醇胺（TEA）缓冲液（pH 8）的配制
    1. 使用移液器辅助装置，将1 mL TEA和9 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）加入50 mL锥形管中，配制0.75 M TEA溶液。用1 N HCl或1 N NaOH将溶液滴定至pH 8。然后加入适量1×PBS，定容至终体积25 mL，得到终浓度为0.3 M、pH为8的TEA溶液。
      注意：将盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）溶液储存于室温（RT）下的易燃物柜中。操作时需佩戴个人防护装备。
  3. 完全培养基的制备
    1. 在500 mL RPMI培养基中加入10%（w/v）或56 mL胎牛血清以及1%（w/v）或5.6 mL青霉素-链霉素，以制备完全培养基。
    2. 将溶液置于 37 °C 10–20 分钟，或直至溶液变暖后使用。
    3. 将溶液储存在 0-4 °C 长达6个月。
  4. 20% (w/v) 聚乙二醇 (PEG) 储存溶液的制备
    注意：计算基于 100 µL 可根据需要按比例放大或缩小的溶液。
    1. 制备 100 µL 20% w/v 4臂PEG-丙烯酸酯（4-arm PEG-Ac）储备溶液的配制：称取20 mg 4臂PEG-Ac粉末于微量离心管中，加入 70 µL 0.3 M TEA 缓冲液，然后涡旋振荡约 30 秒，直至完全溶解。由于粉末溶解会引起体积变化，需通过添加足够的 TEA 缓冲液（约27 µL) 以达到最终溶液体积 100 µL.
    2. 准备一个 100 µL 20% w/v PEG-diSH 储存液：在微量离心管中称取 20 mg PEG-diSH 粉末，加入 70 µL TEA缓冲液，然后涡旋振荡约30秒或直至完全溶解。由于粉末溶解会引起体积变化，需通过添加足够的TEA缓冲液（约27 µL) 以达到最终溶液体积 100 µL.
      注意：PEG 粉末具有强吸湿性，需在 -20 °C 干燥容器中保存20 °C从冷冻箱中取出PEG粉末后，打开瓶盖称量粉末前，应先让其在室温下解冻10分钟。在将瓶子放回冷冻箱之前，需用惰性气体（如氮气或氩气）吹扫瓶内，以置换潮湿空气。4臂PEG-Ac的储备液可保存于 4 °C 使用前最多可保存2周。PEG-diSH的储存液需在使用前立即配制，不能储存，因为巯基会相互反应形成二硫键。
  5. 2% v/v 基底膜基质溶液的制备
    1. 要配制2% v/v的基底膜基质工作液，加入 20 µL 无基底膜基质（不含LDEV）与9.98 mL完全培养基混合，通过上下吹打约10次充分混匀。在使用前配制该溶液 4 °C （置于冰上），然后将其升温至 37 °C （在烘箱或培养箱中）并立即使用。
      注意：基底膜基质将在以下条件下开始形成凝胶 >10 °C，因此务必在2-6 °C完整的培养基成分见步骤1.3。
  6. 细胞固定液的配制
    1. 配制1 mL含4% w/v多聚甲醛和0.1% v/v非离子型表面活性剂的细胞固定液，首先混合 891 µL 1× PBS 溶液 108 µL 37%（w/v）的多聚甲醛，然后加入 1 µL 非离子型表面活性剂（100%浓度）。充分混匀溶液。
      注意：每次进行固定时，固定液应新鲜配制。
      警告：多聚甲醛具有可燃性，可能在空气中形成可燃性粉尘浓度。会引起皮肤刺激和严重眼损伤。避免吸入，因其可能造成呼吸道刺激。操作多聚甲醛时应在化学通风橱中进行，并穿戴个人防护装备。操作后应彻底洗手。非离子型表面活性剂会引起皮肤刺激和严重眼损伤。操作时应佩戴防护手套和眼部防护具或面部防护具。为避免向环境中释放，应在化学通风橱中打开瓶装试剂。操作后应彻底洗手。
  7. 染色溶液的配制
    1. 配制3 mM的3,3'-二己基氧杂羰花青碘化物（DiOC）溶液，将2.65 mg DiOC溶于1 mL DMSO中。
    2. 配制1.5 mM碘化丙啶溶液（PI），将1 mg PI溶于1 mL去离子水中。
  8. 类球体透明化溶液的制备
    1. 为类球体透明化制备体积分数分别为20%、40%和80%的甲酰胺PBS溶液（1x PBS）。
      1. 配制10 mL 20% (v/v) 甲酰胺溶液：先加入8 mL 1x PBS，再加入2 mL 甲酰胺。 配制10 mL 40% (v/v) 甲酰胺溶液：先加入6 mL 1x PBS，再加入4 mL 甲酰胺。 配制10 mL 80% (v/v) 甲酰胺溶液：先加入2 mL 1x PBS，再加入8 mL 甲酰胺。
      2. 将甲酰胺与1x PBS混合后，涡旋振荡约30秒以混匀溶液。

2. 方形锥形微孔的制备

  1. 制备如图1所示的方形锥形微孔阵列的PDMS负模。
    1. 准备2 g（约1 mL）PDMS负模前体溶液，并将其倒入6孔方形锥形主模的一个孔中。注意1 mL溶液可完全覆盖一个孔。将PDMS覆盖主模后，将6孔方形锥形板放入真空干燥器中脱气30分钟。然后将该板置于60 °C烘箱中固化24小时。
      注：脱气时需取下培养板盖，固化时重新盖上。可在真空干燥器中脱气，或通过通入氮气、氩气等惰性气体进行吹扫脱气。若30分钟后负模前体溶液中仍有气泡，表明脱气不充分，需再放入真空干燥器中继续脱气30分钟。可同时使用一个或多个孔制备一个或多个PDMS负模。可使用不同尺寸的方形锥形微孔，例如边长为400和800 µm的微孔，如表1所示。无论方形锥形尺寸如何，均使用相同量的PDMS。
    2. PDMS在仍温热时完成固化后，用刮刀小心地从主模上取下PDMS负模，并使用活检打孔器将其切割成直径为35 mm的片状。放入培养皿中，盖上盖子，并在室温下继续固化24小时。
      注：取下负模时，用刮刀插入培养板与PDMS模之间，轻轻将负模从主模上剥离。将模具切割成直径35 mm的片状，以便适配35 mm培养皿。也可根据需要制备其他尺寸的模具以适配不同直径的培养板。35 mm的PDMS负模片可在室温下避尘保存，可重复使用长达6个月。
  2. 制备方形锥形微孔阵列的PDMS正模。
    1. 将直径35 mm的PDMS负模片放入35 mm培养皿中，使带有微结构的一面朝上。
    2. 按上述方法准备2.5 g（约1.2 mL）PDMS正模前体溶液，并将其倒入35 mm培养皿中的负模上，完全覆盖负模。然后按上述方法脱气30分钟，并放入60 °C烘箱中固化3–4小时。
      注：由于PDMS具有黏性，负模下方可能困住空气形成气泡。若负模下方出现气泡，可用刮刀轻轻按压模具以释放气泡。若仍有气泡，可继续脱气30分钟，或用刮刀轻轻搅拌正模溶液直至气泡破裂。
    3. PDMS正模固化后，从35 mm培养皿中取出模具，并立即从负模上剥离正模。
      注：剥离正模的时机至关重要。最佳方法是使用刀片轻微切入正模边缘，暴露正模与负模之间的界面，然后将两者相互剥离。接着从圆形模具的边缘开始剥离，轻轻将负模从正模上分离。
  3. 将模具粘附至48孔板各孔底部。
    注：此处使用48孔板，但也可使用其他规格的培养板，只要将模具片切割成相应直径即可（例如，96孔板使用直径6 mm的模具片）。
    1. 使用10 mm活检打孔器将正模切割成片状。
      注：一个直径35 mm的正模可切割出约4个直径10 mm的模具片。
    2. 为将模具粘附至48孔板底部，按前述方法准备PDMS胶黏剂前体溶液（约0.5 mL或1 g）27。用镊子轻轻夹住10 mm正模的平面侧（非微孔图案侧），浸入PDMS前体溶液中。将每个模具小心放入48孔板的一个孔中，并用镊子轻轻按压使其贴合孔底。将组装好的培养板放入60 °C烘箱中固化4–24小时，使PDMS胶完全固化。
      注：若PDMS胶黏剂沾到正模的微孔上，可用柔软的纸巾轻轻擦拭去除，并可重复此步骤。粘附时应确保胶黏剂不覆盖微孔区域。
    3. 使用1000 µL移液器向48孔板的每个孔中加入300 µL 70%乙醇进行灭菌。吸除70%乙醇后，将48孔板敞口置于组织培养超净台中，用紫外线（302 nm）照射2小时。
      注：模具可使用长达6个月，必要时可重复灭菌。

3. 多细胞肿瘤球体的形成、收获及在水凝胶中的包封

注意：本节所述方案适用于U87人胶质母细胞瘤细胞系（见图1和图2），但类似方案也可用于其他类型的癌细胞。

  1. 多细胞肿瘤球体形成
    1. 首先用抗黏附冲洗液冲洗微孔模具，加入 300 µL 使用移液器将溶液加入每个孔中 1000 µL 移液。然后，在1620 x g 3 分钟后使用真空泵和巴斯德吸管吸出溶液。
      注意：此步骤需在细胞接种前立即进行。
    2. 将细胞暴露于约~80 µL 每平方厘米使用0.25%胰蛋白酶/EDTA2 培养瓶表面积的5分钟 37 °C例如，T-25 细胞培养瓶使用 1 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液较为合适。加入等体积的完全细胞培养基以中和胰蛋白酶活性，例如向含胰蛋白酶的 T-25 细胞培养瓶中加入 1 mL 完全培养基。从组织培养瓶中收集细胞。
    3. 转移 10 µL 将细胞悬液加入血细胞计数板的每个计数室中进行细胞计数。使用倒置显微镜计数至少8个大方格内的细胞总数，并取平均值，确保每个大方格内的细胞数量为20–50，以获得准确的计数结果。将所得平均值乘以104 以确定最终的细胞浓度。
    4. 将收集的细胞重悬于完全 RPMI 细胞培养基中，该培养基需添加 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素，并根据所需类球体大小调整至目标终浓度，如图所示 表1.
      注意： 800 µm 微孔将产生约75个类球体，位于48孔板的一个孔中，且 400 µm 微孔将在一个48孔板的单孔中产生约300个球状体。
    5. 放置 500 µL 将细胞悬液以所需浓度加入微孔板中，然后以1620 x g离心微孔板 g 3 分钟。将培养板置于湿润的培养箱中 37 °C 和5% CO2 孵育24小时以使球状体形成。
      注意：如果类球体未形成，可使用含2% v/v基底膜基质的完全培养基重悬细胞（更多细节见步骤1.5）。
  2. 类球体收获
    1. 使用一个 1000 µL 移液器，牢固的移液器 500 µL 将完全培养基加入孔中。使用 500 µL 从孔中吸出培养基，通过移液枪在孔的四个象限（即上、下、左、右象限）反复吹打三至四次，以使类球体脱离。轻柔地吸出含有类球体的培养基（约1000 µL 总量）加入到微量离心管中，使用 1000 µL 用移液器吸取并让球体沉降到底部。
    2. 移去上清液，并将类球体重悬至所需的最终浓度。例如，为获得约8个类球体于 20 µL 包封后凝胶，将类球体重悬于 100 µL 培养基，获得约75个类球体/毫升的浓度100 µL 在球状体悬浮液中。
  3. 水凝胶中类球体的包封，如图所示 图2.
    1. 创建 100 µL 10% w/v PEG水凝胶前体溶液的配制，混合 50 µL 类球体悬液的后续处理，接着是 30 µL 20% w/v 4臂 PEG-Ac 的最终产物 20 µL 20% w/v PEG-diSH 加入微量离心管中。这将提供丙烯酸酯基团（Ac）与巯基（SH）之间的化学计量摩尔比，以确保最佳交联效果。通过移液枪上下吹打约10次，充分混匀凝胶前体溶液。
      注意：可根据需要调整水凝胶的成分、体积和聚合物浓度。所得水凝胶将缓慢降解且不具有细胞黏附性。若需使水凝胶具有细胞黏附性，可添加RGDS等黏附配体。若需使水凝胶具有酶可降解性，可添加两端均含有半胱氨酸残基的酶可降解肽交联剂。转移类球体时，轻柔吹吸溶液两次，以使类球体脱离并充分悬浮，确保类球体分布均匀。
    2. 移液器 20 µL 在两片经帕拉菲膜（parafilm）包被的玻璃载片之间加入凝胶前体溶液，中间用1 mm硅胶间隔物隔开，然后将含有凝胶前体溶液的载片置于 37 °C，5% CO₂2 孵育15分钟以使凝胶化完成。
      注意：确保两张载玻片均覆盖 Parafilm，以形成疏水表面，便于凝胶化后轻松剥离。也可使用疏水涂层溶液替代 Parafilm。A 20 µL 水凝胶前体溶液的体积将形成一个在溶胀前直径约6 mm、高度1 mm的水凝胶片。可使用任意类型和厚度的间隔片，但建议凝胶厚度保持在1 mm或以下（较厚的水凝胶可能限制氧气扩散及营养物质向细胞的传输），同时应大于类球体的直径（以确保类球体完全包埋于凝胶中）。水凝胶前体溶液的体积可任意选择。20-30 µL 凝胶适用于24孔板。
    3. 水凝胶完成凝胶化后，将两片玻璃载片分开，并用刮铲轻轻将凝胶从玻璃板上剥离。将凝胶转移至24孔板中，每孔放置一个，确保含有类球体的一侧朝上。
      注意：在凝胶化过程中，类球体会沉降至凝胶底部，因此将凝胶翻转进行培养可确保类球体位于水凝胶表面附近，以更利于获取营养物质和氧气。可通过将未用于制备凝胶片的水凝胶前体溶液保留在微量离心管中并倒置管体，观察凝胶停止流动的时间，以此监测凝胶化过程。
    4. 加入完全培养基（约500 µL) 加入每个孔中，并确保水凝胶完全浸没。将多孔板置于湿润的培养箱中，在 37 °C 和5% CO2 每隔2-3天更换培养基，并继续培养细胞。
      注意：水凝胶可培养长达4周，或直至水凝胶降解，在此期间每隔一天更换一次培养基。

4. 荧光染色

  1. 细胞活力
    1. 使用染料3,3'-二己基氧杂羰花青碘化物（DiOC），该染料可对所有细胞的线粒体和内质网进行染色，以测定细胞活力。使用浓度为0.02 µg/mL的DiOC（3 mM）。具体操作：使用20 µL移液器，每1000 µL培养基中加入2 µL DiOC，加入至培养解离细胞的培养瓶中（至少在第3节类球体形成过程前24小时进行）。让DiOC染色细胞24小时。
    2. 使用仅能进入死细胞的细胞核和染色体染料碘化丙啶（PI，1.50 mM）对细胞进行染色。染色前，首先吸除所有培养基，并使用1000 µL移液器加入500 µL 1×PBS冲洗凝胶，确保凝胶完全浸没。
    3. 吸除PBS，向每个孔中加入500 µL新鲜培养基，随后加入30 µL PI溶液（即每100 µL培养基中加入6 µL）。用铝箔覆盖孔板以避光。将孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中，孵育30分钟，使PI对死细胞完成染色。
    4. 移除铝箔，吸除孔中的培养基。使用1000 µL移液器向每个孔中加入500 µL 1×PBS，使水凝胶完全浸没。吸除1×PBS，并重复冲洗两次。向每个孔中加入500 µL培养基，并在倒置荧光显微镜或共聚焦显微镜下进行成像。
    5. 通过比较DiOC（所有细胞）与PI（死细胞）的信号面积来计算细胞活力，如公式1所示，使用共聚焦显微镜或倒置荧光显微镜获取的z轴层扫图像进行分析。
      细胞活力公式示意图；基于荧光染料测量值计算%细胞活力的公式。 公式 1。

5. 包封类球体的免疫荧光固定、染色、透明化及成像

  1. 固定与染色
    1. 吸除培养水凝胶的孔中培养基，用移液器将500 µL的1× PBS直接加到水凝胶上进行冲洗。轻轻吸除1× PBS。
    2. 使用1000 µL移液器向24孔板每孔加入500 µL固定液，对类球体进行固定。室温下孵育30分钟使固定液充分渗透凝胶。使用1000 µL移液器移除固定液，并弃入指定的废液容器中。
    3. 向每孔加入500 µL的1× PBS冲洗水凝胶。使用1000 µL移液器吸除PBS，重复PBS冲洗共三次。将孔板每孔加入500 µL 1× PBS，于4 °C保存最多1周，或立即使用。
      注意：吸除PBS和固定液时需小心，避免将水凝胶吸入移液器。可通过将孔板倾斜至约45度角，以便观察水凝胶位置，防止误吸。
      警告：甲醛吸入或接触有毒。请在通风橱内佩戴手套操作。
    4. 对细胞进行染色时，将包埋于水凝胶中的类球体与Nestin（200 µg/mL）和SOX2（200 µg/mL）一抗在抗体与PBS 1:200稀释比例下孵育。使用1000 µL移液器吸除孔中1× PBS，每孔加入50 µL稀释后的一抗溶液。染色孵育24小时。随后使用1000 µL移液器移除染色液，并妥善处理废液。
    5. 使用1000 µL移液器向每孔加入500 µL 1× PBS，确保水凝胶完全浸没。吸除PBS并重复冲洗两次。将染色后的水凝胶浸没于1× PBS中，4 °C保存最多2周用于后续成像，或立即成像。
      注意：根据所用抗体不同，可能需要进行微小优化以确保染色效果。此处使用的浓度（1:200）和时间（24小时）显著高于常规二维单层细胞培养，因为三维染色需要抗体通过水凝胶及类球体扩散。
  2. 类球体染色后，可通过逐步提高甲酰胺浓度替代PBS以实现透明化处理，从而提升成像透明度（可选步骤）。
    1. 吸除每孔中的1× PBS。向每孔加入500 µL 20%（v/v）甲酰胺，孵育90分钟。使用1000 µL移液器吸除甲酰胺，并将废液收集至废液容器中。
    2. 向每孔加入500 µL 40%（v/v）甲酰胺，继续孵育90分钟。吸除甲酰胺并收集至废液容器。
    3. 向每孔加入500 µL 80%（v/v）甲酰胺，孵育90分钟。吸除甲酰胺并弃入废液容器。随后每孔加入500 µL 100%（v/v）甲酰胺，成像前继续孵育24小时。透明化完成后，应通过实验室废液管理系统妥善处理甲酰胺废液。
      注意：透明化处理可实现共聚焦显微镜对类球体核心区域的成像；若仅需观察类球体边缘区域，则此步骤可省略。
  3. 使用共聚焦显微镜对包埋于水凝胶中的类球体进行成像。
    注意：可用于细胞成像的显微镜类型包括倒置显微镜、荧光显微镜或共聚焦显微镜；但共聚焦显微镜可实现单一层平面的分离成像。
    1. 将水凝胶置于底部为玻璃盖玻片的腔室孔板中，并将类球体尽可能靠近盖玻片放置。
      注意：可使用玻璃盖玻片或底部为玻璃的腔室孔板。保持水凝胶湿润至关重要，干燥样本将导致成像质量下降。
    2. 使用长工作距离物镜（10x–20x）对样本进行成像，结合Z轴层扫实现类球体内部的三维重建。
      注意：更高倍数的物镜可提供更详细的成像和更精细的光学切片，但会牺牲成像深度。
    3. 使用公式2，对透明化与未透明化样本的光学切片中信号量相对于类球体总面积进行定量分析。
      类球体成像区域公式，光学切片分析，显微成像数据定量公式。 公式 2

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结果

基于类球体的药物筛选平台因强调在模拟天然组织的生物材料中包封类球体以调控肿瘤微环境，正受到越来越多关注。本文中，我们开发了一种多细胞肿瘤类球体的制备方法，并进一步实现其在三维水凝胶中的包封与成像。类球体在微孔模具中制备（图 3A,B），可形成球形且多分散性严格可控的球状体。例如，对于每个微孔中含有 3,300 个细胞的球状体，其平均大小约为250 µm，以及圆形度 >0.8，其中1为完美球形（图3C,D）。类球体直径的变异系数（%CV）为19.3%，圆度的变异系数（%CV）为4.5%。类球体直径取决于每个微孔中的细胞数量，如图所示。 表1请注意，微孔中的一些细胞可能未被纳入球状体，在球状体收获步骤中会被洗去。

可通过不同Z轴层析深度对类球体进行成像，从而获得Z轴各位置的细胞活力信息（图4）。需要注意...

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讨论

基于水凝胶的多细胞肿瘤球模型正被越来越多地用于推动癌症治疗研究11,13,29。这类模型的优势在于能够以受控方式模拟肿瘤微环境的关键参数，尽管结构较为复杂，但相比体内模型更简单、成本更低，且许多体系适用于高通量筛选技术。水凝胶生物材料可被调控以模拟肿瘤的细胞外基质，并促进细胞与基质之间的相互作用；而肿瘤球（相对于分散的单细胞）则可模拟原发肿瘤中的细胞间相互作用。如本研究所示，合成水凝胶具有尤为突出的优势：水凝胶可提供所需的结构支撑以及理想的物理和力学特性，同时可通过引入黏附性配体或可降解序列独立调节其生化材料特性。此外，合成水凝胶还具有更小的批间差异性，并能实现更广泛的材料性能调控范围，可覆盖人体大多数软组织的特性。

本文详细描述了一种基于惰性聚乙二醇（PEG）的水凝胶的使用方法，该水凝胶通过迈克尔加成反应形成，如先前研究所述25,

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由圣路易斯大学为 Silviya P Zustiak 博士提供的启动资金，以及由圣路易斯大学 Henry 和 Amelia Nasrallah 神经科学中心授予 Silviya P Zustiak 博士的种子基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
70% 乙醇Fisher Scientific LC22210-4
15 mL 离心管FALCON352097
24 孔超低吸附培养板Fisher Scientific07-200-602
35 mm 培养皿Amazon706011
四臂聚乙二醇-丙烯酸酯（4-arm PEG-Ac；10 kDa）Laysan BioACRL-PEG-ACRL-10K-5g
50 mL 离心管Fisher Scinetific3181345107
6 孔 AggreWell 400 StemCell Technologies, Vancouver, Canada34421方形锥形微孔 
抗黏附冲洗液StemCell Technologies, Vancouver, Canada货号：07010
天冬氨酸-精氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-精氨酸-天冬氨酸（DRCG-VPMSMR-GCRD）多肽Genic Bio, 上海, 中国n/a定制合成
化学通风橱KEWAUNEE99151
Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV Corning356234基底膜基质
去垢剂 - Triton-XSigma AldrichT8787非离子型表面活性剂
二甲基亚砜（DMSO）Fisher Scientific BP231-100
一次性移液管（1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL）Fisher Scinetific1 mL: 13-678-11B, 2 mL: 05214038, 5 mL (FALCON): 357529, 10 mL: 13-678-11E, 25 mL: 13-678-11, 50 mL: 13-678-11F
胎牛血清HyCloneSH30073-03
甲醛 37% 溶液Sigma AldrichF1635
玻璃板SlumpysGBS4100SFSL
玻璃转移移液管Fisher Scinetific5 3/4": 1367820A, 9":136786B
甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（GRCD-RGDS）多肽Genic Bio, 上海, 中国n/a定制合成
血细胞计数板Bright-Line383684
疏水溶液 - Repel Silane GE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
培养箱NUAIRENU-8500
倒置显微镜（Axiovert 25）Zeiss663526
Invitrogen DiOC16(3)（3,3'-二己基氧杂羰花青高氯酸盐）Fisher Scientific D1125
Leica 共聚焦 SP8Leica Microsystems Inc.
明场与荧光显微镜（Axiovert 200M）Zeiss3820005619
微量离心管Fisher Scientific2 mL: 02681258
显微镜软件ZeissAxioVision Rel. 4.8.2
Nestin Alexa Fluor 594 Santa Cruz Biotechnologysc-23927
Parafilm 封口膜PARAFILM PM992
PBS（1×），pH 7.4HyCloneSH30256.01
青霉素-链霉素MP Biomedicals1670046
移液器辅助器Drummond Scientific Co.P-76864
移液器吸头（1–200 µL，101–1000 µL）Fisher Scinetific2707509
标准一次性塑料转移移液管Fisher Scientific13-711-9D
塑料称量舟（100 mL）Amazon mdo-azoc-1030
聚乙二醇-二硫醇（PEG-diSH；3.4 kDa）Laysan BioSH-PEG-SH-3400-5g
聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Slygard 182 弹性体试剂盒]Elsworth Adhesives3097358-1004聚二甲基硅氧烷
无粉检查手套Quest92897
碘化丙啶，1 mg/mL 水溶液 Fisher Scientific AAJ66584AB
RPMI-1640 培养基（1×）HyCloneSH30027-02
硅胶垫片 - 硅胶片，0.5 mm 厚，13 cm × 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
SOX2 Alexa Fluor 488 Santa Cruz Biotechnologysc-365823
组织培养操作台NUAIRENU-425-600
三乙醇胺，≥99.0%（GC） Sigma Aldrich90279
U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞American Type Culture Collection HTB-14

参考文献

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