在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型
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摘要
摘要
三维（3D）包封类球体对于充分模拟肿瘤微环境以实现细胞的最佳生长至关重要。在此，我们设计了一种 体外 用于模拟肿瘤细胞外微环境的胶质母细胞瘤三维球体包封模型。首先，我们采用聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane）制备方形锥形微孔模具。利用这些微孔模具可形成尺寸精确可控（50–500 μm）的肿瘤球体。球体形成后，将其收集并包封于聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）基水凝胶中。PEG水凝胶是一种适用于球体包封的多功能平台，因其水凝胶特性（如刚度、可降解性和细胞黏附性）可独立调控。本研究中，我们采用一种典型的软性水凝胶（~8 kPa）对胶质母细胞瘤球体进行包封。最后，建立了一种对球体进行染色和成像的方法，以通过共聚焦显微镜获取高质量图像。由于球体核心致密而外围相对稀疏，成像可能存在困难，但使用透明化溶液结合共聚焦光学切片可有效缓解此类成像难题。综上所述，我们展示了一种制备均一球体、将其包封于PEG水凝胶中，并对包封后的球体进行共聚焦显微成像的方法，用于研究球体生长行为及多种细胞-基质相互作用。
引言
肿瘤球体已成为研究癌症病因、病理学及药物反应性的有用体外工具1。传统上，肿瘤球体在低黏附培养板或生物反应器等条件下培养，以促进细胞-细胞黏附而非细胞-表面黏附2。然而，目前人们认识到，为了更真实地模拟肿瘤微环境，体外肿瘤球体模型应同时包含细胞-细胞和细胞-基质相互作用。这促使多个研究团队设计出如水凝胶等支架材料，用于包载肿瘤球体3,4。此类基于水凝胶的肿瘤球体模型有助于阐明细胞-细胞和细胞-基质相互作用对多种细胞行为的影响，例如细胞活力、增殖、干性或治疗反应性3。
在此，我们描述了一种将胶质母细胞瘤类球体包埋于聚乙二醇（PEG）水凝胶中的实验方案。已有大量文献报道了将胶质母细胞瘤细胞类球体包埋于水凝胶中的方法。例如，通过将U87细胞包埋于修饰有RGDS黏附配体并以酶可降解肽交联的PEG水凝胶中形成类球体，以研究水凝胶刚度对细胞行为的影响。5U87细胞还已在其他基于聚乙二醇或透明质酸的水凝胶中形成，以扩增肿瘤干细胞群体6 或探索基质介导的化疗耐药机制7
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方案
1. 溶液配制
- 聚二甲基硅氧烷（PDMS）前体溶液的制备
- 制备负相PDMS前体溶液（也用于胶粘剂前体溶液）。使用刮刀将弹性体材料舀入称量皿中并称重。按照1:10的比例将固化剂加入弹性体基质中。在塑料称量皿中使用刮刀轻轻而充分地混合PDMS与固化剂。
注意：此PDMS预聚体溶液将倒入6孔方形锥形微孔板中，以形成负模。该溶液与用于胶粘剂预聚体溶液的相同。 - 制备阳性的PDMS前体溶液。使用刮刀将弹性体基质转移至称量舟中并称重。按照1:9的比例将固化剂加入弹性体基质中。使用刮刀在塑料称量舟中轻轻而充分地混合PDMS与固化剂。
注意：此PDMS预聚体溶液随后将被倒入负模中，以形成正模。
- 制备负相PDMS前体溶液（也用于胶粘剂前体溶液）。使用刮刀将弹性体材料舀入称量皿中并称重。按照1:10的比例将固化剂加入弹性体基质中。在塑料称量皿中使用刮刀轻轻而充分地混合PDMS与固化剂。
- 0.3 M 三乙醇胺（TEA）缓冲液（pH 8）的配制
- 使用移液器辅助装置，将1 mL TEA和9 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）加入50 mL锥形管中，配制0.75 M TEA溶液。用1 N HCl或1 N NaOH将溶液滴定至pH 8。然后加入适量1×PBS，定容至终体积25 mL，得到终浓度为0.3 M、pH为8的TEA溶液。
注意：将盐酸（HCl）和氢氧化钠（NaOH）溶液储存于室温（RT）下的易燃物柜中。操作时需佩戴个人防护装备。
- 使用移液器辅助装置，将1 mL TEA和9 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）加入50 mL锥形管中，配制0.75 M TEA溶液。用1 N HCl或1 N NaOH将溶液滴定至pH 8。然后加入适量1×PBS，定容至终体积25 mL，得到终浓度为0.3 M、pH为8的TEA溶液。
- 完全培养基的制备
- 在500 mL R....
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结果
基于类球体的药物筛选平台因强调在模拟天然组织的生物材料中包封类球体以调控肿瘤微环境，正受到越来越多关注。本文中，我们开发了一种多细胞肿瘤类球体的制备方法，并进一步实现其在三维水凝胶中的包封与成像。类球体在微孔模具中制备（图 3A,B），可形成球形且多分散性严格可控的球状体。例如，对于每个微孔中含有 3,300 个细胞的球状体，其平均大小约为250 µm，以及圆形度 >0.8，其中1为完美球形（图3C,D）。类球体直径的变异系数（%CV）为19.3%，圆度的变异系数（%CV）为4.5%。类球体直径取决于每个微孔中的细胞数量，如图所示。 表1请注意，微孔中的一些细胞可能未被纳入球状体，在球状体收获步骤中会被洗去。
可通过不同Z轴层析深度对类球体进行成像，从而获得Z轴各位置的细胞活力信息（图4）。需要注意.......
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讨论
基于水凝胶的多细胞肿瘤球模型正被越来越多地用于推动癌症治疗研究11,13,29。这类模型的优势在于能够以受控方式模拟肿瘤微环境的关键参数，尽管结构较为复杂，但相比体内模型更简单、成本更低，且许多体系适用于高通量筛选技术。水凝胶生物材料可被调控以模拟肿瘤的细胞外基质，并促进细胞与基质之间的相互作用；而肿瘤球（相对于分散的单细胞）则可模拟原发肿瘤中的细胞间相互作用。如本研究所示，合成水凝胶具有尤为突出的优势：水凝胶可提供所需的结构支撑以及理想的物理和力学特性，同时可通过引入黏附性配体或可降解序列独立调节其生化材料特性。此外，合成水凝胶还具有更小的批间差异性，并能实现更广泛的材料性能调控范围，可覆盖人体大多数软组织的特性。
本文详细描述了一种基于惰性聚乙二醇（PEG）的水凝胶的使用方法，该水凝胶通过迈克尔加成反应形成，如先前研究所述25,
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由圣路易斯大学为 Silviya P Zustiak 博士提供的启动资金，以及由圣路易斯大学 Henry 和 Amelia Nasrallah 神经科学中心授予 Silviya P Zustiak 博士的种子基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70% 乙醇 | Fisher Scientific | LC22210-4 | |
| 15 mL 离心管 | FALCON | 352097 | |
| 24 孔超低吸附培养板 | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35 mm 培养皿 | Amazon | 706011 | |
| 四臂聚乙二醇-丙烯酸酯（4-arm PEG-Ac；10 kDa） | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL 离心管 | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 6 孔 AggreWell 400 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 34421 | 方形锥形微孔 |
| 抗黏附冲洗液 | StemCell Technologies, Vancouver, Canada | 货号：07010 | |
| 天冬氨酸-精氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-丝氨酸-甲硫氨酸-精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸-精氨酸-天冬氨酸（DRCG-VPMSMR-GCRD）多肽 | Genic Bio, 上海, 中国 | n/a | 定制合成 |
| 化学通风橱 | KEWAUNEE | 99151 | |
| Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV | Corning | 356234 | 基底膜基质 |
| 去垢剂 - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | 非离子型表面活性剂 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| 一次性移液管（1 mL、2 mL、5 mL、10 mL、25 mL、50 mL） | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2 mL: 05214038, 5 mL (FALCON): 357529, 10 mL: 13-678-11E, 25 mL: 13-678-11, 50 mL: 13-678-11F | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30073-03 | |
| 甲醛 37% 溶液 | Sigma Aldrich | F1635 | |
| 玻璃板 | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 玻璃转移移液管 | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| 甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸-天冬氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸（GRCD-RGDS）多肽 | Genic Bio, 上海, 中国 | n/a | 定制合成 |
| 血细胞计数板 | Bright-Line | 383684 | |
| 疏水溶液 - Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| 培养箱 | NUAIRE | NU-8500 | |
| 倒置显微镜（Axiovert 25） | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3)（3,3'-二己基氧杂羰花青高氯酸盐） | Fisher Scientific | D1125 | |
| Leica 共聚焦 SP8 | Leica Microsystems Inc. | ||
| 明场与荧光显微镜（Axiovert 200M） | Zeiss | 3820005619 | |
| 微量离心管 | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| 显微镜软件 | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927 | |
| Parafilm 封口膜 | PARAFILM | PM992 | |
| PBS（1×），pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| 青霉素-链霉素 | MP Biomedicals | 1670046 | |
| 移液器辅助器 | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| 移液器吸头（1–200 µL，101–1000 µL） | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| 标准一次性塑料转移移液管 | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| 塑料称量舟（100 mL） | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| 聚乙二醇-二硫醇（PEG-diSH；3.4 kDa） | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Slygard 182 弹性体试剂盒] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | 聚二甲基硅氧烷 |
| 无粉检查手套 | Quest | 92897 | |
| 碘化丙啶，1 mg/mL 水溶液 | Fisher Scientific | AAJ66584AB | |
| RPMI-1640 培养基（1×） | HyClone | SH30027-02 | |
| 硅胶垫片 - 硅胶片，0.5 mm 厚，13 cm × 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365823 | |
| 组织培养操作台 | NUAIRE | NU-425-600 | |
| 三乙醇胺，≥99.0%（GC） | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG 人胶质母细胞瘤细胞 | American Type Culture Collection | HTB-14 |
参考文献
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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