本文旨在介绍一种利用血管夹进行静脉结扎以评估小鼠癌症模型中静脉血栓形成的方法，并对该方法进行了优化。优化后的方案可减少血栓相关测量指标的变异性，并提高其在人类癌症相关静脉血栓研究中的适用性。
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摘要
摘要
本方法学论文重点阐述了一种啮齿类动物静脉血栓形成模型的手术技术细节，特别是在癌症相关性血栓（CAT）背景下的应用。深静脉血栓是癌症幸存者中常见的并发症，可能危及生命。目前的小鼠静脉血栓模型通常采用缝线对下腔静脉（IVC）进行完全或部分机械性阻塞。该操作可诱导血液完全或部分淤滞，并造成内皮损伤，从而触发血栓形成。现有模型存在一些局限性，例如血栓重量变异较大、死亡率较高以及学习曲线较长。本报告介绍了一种使用血管夹进行手术改进的新方法，以克服上述部分局限。在同基因型结肠癌异种移植小鼠模型中，我们采用定制的血管夹对肾下下腔静脉进行结扎。这些血管夹在IVC结扎后所保留的残余缝隙空间与5-0聚丙烯缝线相当。采用缝线法的小鼠作为对照组。与缝线法相比，血管夹法实现了更稳定、可重复的部分性血管阻塞，并产生更大且变异更小的血栓重量。由于血管夹相较于6-0聚丙烯缝线具有更高的压力特征，因此可预期其产生更大的血栓重量、更高的血栓质量以及更大的血栓与IVC管腔表面积比。该方法通过灰阶超声成像进行了验证，结果显示使用血管夹组在肾下下腔静脉中形成的血栓质量始终显著高于缝线组。免疫荧光染色结果进一步证实了这些观察结果。本研究提供了一种改进的小鼠静脉血栓模型构建方法，可用于深入理解CAT的机制，并应用于药物发现等转化医学研究。
引言
癌症相关静脉血栓栓塞症（VTE）
与普通人群相比，癌症幸存者的静脉血栓栓塞症（VTE）风险高出4至7倍1,2,3。该病症在每七名癌症患者中即导致一人死亡。VTE的发生率因癌症类型和肿瘤负荷而异，在胰腺癌和胃癌患者中最高4。
癌症相关静脉血栓栓塞（VTE）在癌症患者中具有预后意义。即使在调整了年龄、种族和基础癌症分期后，癌症诊断后第一年的总体生存率仍与VTE显著相关，预后较差5。这些发现凸显了研究癌症相关VTE的重要性，以及利用动物模型深入探究其机制的必要性。该领域的转化意义进一步体现在：癌症患者的VTE可通过血栓预防和抗血栓治疗进行预防和治疗6。
癌症和静脉血栓形成的动物模型
癌症模型通常被称为异种移植模型，即向小鼠体内注射癌细胞。若将癌细胞注射到与其来源相同的解剖部位，称为原位模型；而注射到不同部位（如背部侧腹的皮下平面）则称为异位模型。根据癌细胞的物种来源，可将其分为同源性模型或异源性模型：例如HT-....
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方案
本研究使用了16只雌性C57Bl6/J小鼠，年龄为8至12周，体重为20至25 g。小鼠在标准条件下饲养，并可自由摄取饲料和水。ad libitum。本研究经波士顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。此处描述的开放性操作均在无菌条件下进行。
1. 异种移植模型
- 细胞培养
- 在异位皮下移植之前，将MC-38细胞以单层培养至80%融合度。
- 经胰酶消化并用含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬后，在4 °C条件下以277 × g离心5分钟。随后将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为1 × 104 个MC-38细胞/µL无血清培养基。
- 进行胰酶消化时，将MC-38细胞培养至所需融合度（通常约为70%–80%），然后从培养皿中吸除培养液。
- 加入1 mL胰酶-EDTA溶液，在37 °C孵育1分钟以使细胞脱落。轻轻敲击或晃动培养皿，确保细胞均匀脱落。
- 加入含血清的培养基或胰酶抑制剂以中和胰酶活性，防止细胞进一步解离。收集脱落的细胞及中和后的胰酶溶液。
- 对于重悬步骤，细胞经胰酶消化脱落后，需为其移植或后续实验做准备。将收集的细胞悬液在277 × g条件下离心，使细胞沉淀。
- 小心吸除上清液....
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结果
将处于对数生长期的MC-38细胞注射至一组8至12周龄的雌性C57Bl6/J小鼠体内。异种移植瘤在注射后第三至第四周迅速生长18。当肿瘤体积达到平均400 mm3时，将小鼠随机分为对照组和实验组。对照组小鼠接受缝线结扎下腔静脉（IVC）处理，而实验组小鼠则采用血管夹进行IVC结扎。对照组与实验组的肿瘤体积相似，差异无统计学意义（353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46.2 mm3，p = 0.445）。在术后48小时，采集肾下IVC至髂静脉分叉处包含血栓的血管段，以血栓重量作为静脉血栓形成倾向的生物学指标。所有对照组和实验组动物的术后过程均顺利，未见子宫角变色、肌肉骨骼缺血或下肢跛行等异常表现。第二次剖腹探查时未发现血管夹移位现象。实验终止前未观察到动物死亡。
血栓重量与标准化体重的比值
由于移植瘤小鼠可能会出现体重下降，因此将血栓重量（单位为 mg）根据处死时的总体重（单位也为 mg）进行标准化处理。与对照组小鼠相.......
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讨论
在同系异体移植结肠癌模型中，我们观察到实验组的血栓形成性及凝血标志物表达水平均高于对照组。重要的是，与对照组相比，实验组在所有这些参数上的变异程度更低。该改良方法涉及在下腔静脉与左肾静脉汇合处引入一个具有特定压力曲线的血管夹。血管夹置于一个垫片之上，该垫片为一根5-0聚丙烯缝线。此改良可减少血栓大小及血栓标志物的变异性。所有小鼠均达到100%存活率。
技术细节
该操作过程需特别注意多个步骤。开腹后，需仔细检查双侧输尿管，以防止任何意外损伤。为获得最佳暴露视野，将肠管用湿润纱布覆盖并置于右上腹，避免过度牵拉。接下来，对下腔静脉（IVC）的侧支血管进行电凝，电凝点应距离输尿管、下腔静脉和主动脉至少2至3 mm，以防静脉损伤。在确保完全止血后，准备进行下腔静脉结扎的分离平面。需要注意的是，小鼠的主动脉与下腔静脉在其走行过程中紧密相连，若试图将其分离，可能导致出血并造成动物死亡。唯一的例外是左侧肾静脉与主动脉的汇合处21。随后，使用镊子进行不超过三次精细、锐性且呈发散式的穿刺动作，以建立缝合通道。.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由美国心脏协会心血管肿瘤学SFRN CAT-HD中心资助项目857078（KR、VCC、XY和SL）以及R01HL166608（KR和VCC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 布托啡诺 0.3 mg/mL | PAR制药 | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J 小鼠 | 杰克逊实验室 | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺 | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| 细胞计数仪 | MOXIE | MXZ000 | |
| 夹钳 | 精细科学工具 | 13002-10 | |
| 单夹 ASSI.B2V，通用型夹具 | 精准外科手术 &和科学仪器 | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF 镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| 纤维蛋白 | 默克密理博 | MABS2155-100UG | |
| 大环精细剪刀 | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| 镊子 | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| 希尔止血钳 | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| 异氟烷，USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 细胞 | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| 显微镜 | 尼康Eclipse倒置显微镜 | TE2000 | |
| 剪刀 | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| 缝线-薇乔（Vicryl） | AD-外科手术 | #L-G330R24 | |
| 缝合线-尼龙 2-0 | Ethilon | 664H | |
| 缝合线-普理灵5-0 | Ethicon | 8661G | |
| 缝合线-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | 富士胶片 | |
| Vitrogel Matrigel 基质 | Well Bioscience | VHM01 |
参考文献
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al.
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