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方法文章

癌症小鼠模型中的静脉血栓形成检测

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DOI：

10.3791/65518

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2024年1月5日

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1Renal Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 2Vascular Biology Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 3Division of Interventional Radiology, Department of Radiology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 4Department of Medicine, Whitaker Cardiovascular Institute, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 5Department of Biochemistry and Cell Biology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 6Veterans Affairs Boston Healthcare System, 7Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology, 8Center of Cross-Organ Vascular Pathology, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University

本文内容

摘要

本文旨在介绍一种利用血管夹进行静脉结扎以评估小鼠癌症模型中静脉血栓形成的方法，并对该方法进行了优化。优化后的方案可减少血栓相关测量指标的变异性，并提高其在人类癌症相关静脉血栓研究中的适用性。

摘要

本方法学论文重点阐述了一种啮齿类动物静脉血栓形成模型的手术技术细节，特别是在癌症相关性血栓（CAT）背景下的应用。深静脉血栓是癌症幸存者中常见的并发症，可能危及生命。目前的小鼠静脉血栓模型通常采用缝线对下腔静脉（IVC）进行完全或部分机械性阻塞。该操作可诱导血液完全或部分淤滞，并造成内皮损伤，从而触发血栓形成。现有模型存在一些局限性，例如血栓重量变异较大、死亡率较高以及学习曲线较长。本报告介绍了一种使用血管夹进行手术改进的新方法，以克服上述部分局限。在同基因型结肠癌异种移植小鼠模型中，我们采用定制的血管夹对肾下下腔静脉进行结扎。这些血管夹在IVC结扎后所保留的残余缝隙空间与5-0聚丙烯缝线相当。采用缝线法的小鼠作为对照组。与缝线法相比，血管夹法实现了更稳定、可重复的部分性血管阻塞，并产生更大且变异更小的血栓重量。由于血管夹相较于6-0聚丙烯缝线具有更高的压力特征，因此可预期其产生更大的血栓重量、更高的血栓质量以及更大的血栓与IVC管腔表面积比。该方法通过灰阶超声成像进行了验证，结果显示使用血管夹组在肾下下腔静脉中形成的血栓质量始终显著高于缝线组。免疫荧光染色结果进一步证实了这些观察结果。本研究提供了一种改进的小鼠静脉血栓模型构建方法，可用于深入理解CAT的机制，并应用于药物发现等转化医学研究。

引言

癌症相关静脉血栓栓塞症（VTE）
与普通人群相比，癌症幸存者的静脉血栓栓塞症（VTE）风险高出4至7倍1,2,3。该病症在每七名癌症患者中即导致一人死亡。VTE的发生率因癌症类型和肿瘤负荷而异，在胰腺癌和胃癌患者中最高4。

癌症相关静脉血栓栓塞（VTE）在癌症患者中具有预后意义。即使在调整了年龄、种族和基础癌症分期后，癌症诊断后第一年的总体生存率仍与VTE显著相关，预后较差5。这些发现凸显了研究癌症相关VTE的重要性，以及利用动物模型深入探究其机制的必要性。该领域的转化意义进一步体现在：癌症患者的VTE可通过血栓预防和抗血栓治疗进行预防和治疗6。

癌症和静脉血栓形成的动物模型
癌症模型通常被称为异种移植模型，即向小鼠体内注射癌细胞。若将癌细胞注射到与其来源相同的解剖部位，称为原位模型；而注射到不同部位（如背部侧腹的皮下平面）则称为异位模型。根据癌细胞的物种来源，可将其分为同源性模型或异源性模型：例如HT-29细胞系（人结肠癌）属于异源性模型7,8,9；相反，同源性模型则使用小鼠来源的癌细胞系，包括RenCa和MC-38细胞系3,10。

文献中已描述了啮齿类动物的动脉、静脉和毛细血管血栓形成模型。通过机械损伤（导丝）或完全结扎下腔静脉（IVC）、化学法（三氯化铁）或电解损伤，可在下腔静脉诱导静脉血栓形成。三氯化铁诱导的血栓或下腔静脉完全结扎属于完全闭塞模型。后者会导致静脉内血液淤滞及炎性细胞浸润11,12,13。完全结扎模型在95%至100%的小鼠中可高效诱导血栓形成。部分下腔静脉结扎模型可能包括阻断髂腰侧支，并通过对下腔静脉远端目标位点进行缝线结扎以阻断静脉回流12。有时也使用占位物来部分阻断静脉回流。然而，现有的部分闭塞模型中血栓重量不一致，导致血凝块重量和高度的变异性较高12,14。

这两种大静脉机械模型（部分和完全）均存在局限性。首先，下腔静脉结扎（淤血模型）常导致低血压，血液通过椎静脉分流。尽管在经验丰富的操作者手中，该模型的死亡率在5%–30%之间，但在学习曲线阶段死亡率更高。重要的是，完全闭塞模型并不能再现人类深静脉血栓形成（DVT）的典型特征，因为在人类中血栓通常为非闭塞性。完全闭塞可能改变血液流变学因素和药效动力学参数，从而影响化合物在局部的生物利用度。由于这些局限性，完全闭塞模型可能并非用于测试新型化学化合物治疗效果及药物研发的理想选择12。

需要注意的是，为了提供一种更具临床相关性的、伴有血流减少和内皮损伤的小鼠静脉血栓形成模型，已引入一种静脉血栓模型，该模型在无内皮破坏的情况下通过限制血流来触发深静脉血栓（DVT）。该模型已通过扫描电子显微镜验证15。一种更理想的、具有临床相关性的血栓模型应能实现接近完全的血栓形成，从而有利于药物研发。目前的部分阻塞模型中血栓形成不一致，导致血栓重量和高度存在较大变异性12,16。此外，传统方法得到的血栓重量变异较大，因此每项研究需要使用 更多 小鼠12。

既往与癌症相关的血栓形成模型主要集中在结肠癌、胰腺癌和肺癌，且均为完全闭塞模型17,18,19。本论文对部分闭塞血栓形成模型进行了改良，以获得变异性更低的血凝块并降低小鼠死亡率(图1)。以往的研究在免疫缺陷的无胸腺小鼠背景下使用同种异体癌细胞系19,20,21。本论文在C57Bl6/J小鼠中采用MC-38细胞的同基因异种移植模型，从而可使用免疫功能健全的小鼠，并研究免疫成分在血栓形成中的作用。

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方案

本研究使用了16只雌性C57Bl6/J小鼠，年龄为8至12周，体重为20至25 g。小鼠在标准条件下饲养，并可自由摄取饲料和水。ad libitum。本研究经波士顿大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。此处描述的开放性操作均在无菌条件下进行。

1. 异种移植模型

  1. 细胞培养
    1. 在异位皮下移植之前，将MC-38细胞以单层培养至80%融合度。
    2. 经胰酶消化并用含10%胎牛血清（FBS）的培养基重悬后，在4 °C条件下以277 × g离心5分钟。随后将细胞重悬于无血清培养基中，浓度为1 × 104 个MC-38细胞/µL无血清培养基。
      1. 进行胰酶消化时，将MC-38细胞培养至所需融合度（通常约为70%–80%），然后从培养皿中吸除培养液。
      2. 加入1 mL胰酶-EDTA溶液，在37 °C孵育1分钟以使细胞脱落。轻轻敲击或晃动培养皿，确保细胞均匀脱落。
      3. 加入含血清的培养基或胰酶抑制剂以中和胰酶活性，防止细胞进一步解离。收集脱落的细胞及中和后的胰酶溶液。
      4. 对于重悬步骤，细胞经胰酶消化脱落后，需为其移植或后续实验做准备。将收集的细胞悬液在277 × g条件下离心，使细胞沉淀。
      5. 小心吸除上清液（细胞沉淀上方的液体）。向细胞沉淀中加入9 mL培养基、缓冲液或其他溶液，以达到移植或实验所需的细胞浓度。
      6. 通过轻柔吹打或 使用细胞培养摇床轻柔重悬细胞。避免剧烈吹打，以免损伤细胞。
        注：根据所使用的细胞变体或细胞系不同，可将细胞重悬于可溶性基底膜基质与无血清培养基按1:1比例混合的溶液中，以减缓高侵袭性小鼠细胞在移植后的生长和扩散。所有细胞培养操作均应在专用的细胞培养区域内的完全无菌操作台中进行，并定期检测支原体污染。
    3. 按照仪器提供的操作手册，使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
  2. 细胞移植
    1. 将八只小鼠随机分配至实验组，另八只小鼠分配至对照组，具体如下：对照组使用MC38异种移植小鼠，采用5-0聚丙烯缝合线进行下腔静脉（IVC）结扎；实验组同样使用MC38异种移植小鼠，但采用定制的血管夹进行IVC结扎。
    2. 将小鼠置于左侧卧位，剃除前肢与后肢之间右侧体表的毛发。用酒精和碘伏对背部腰部区域进行消毒，为注射做好无菌准备。
    3. 用27G针头，在非优势手轻柔固定小鼠的同时，将200 µL含2 × 106 个MC-38细胞的细胞悬液，皮下注射至小鼠侧腹部，注射位置位于最远端肋骨与骨盆隆起之间的中点。
    4. 注射完成后，仔细检查动物状况，并将其放回笼中。应观察以下项目：1. 小鼠行为、活动水平及整体运动能力的变化，任何显著变化可能提示不适或健康问题；2. 小鼠整体身体状况，包括毛发质量、理毛行为以及是否有明显的痛苦或异常表现；3. 饮食和饮水恢复情况；4. 活动水平、姿势或与笼内同伴互动方式的变化。嗜睡或攻击性增强可能是痛苦的表现。

2. 肿瘤生长的随访观察

  1. 每2周监测一次动物肿瘤生长趋势，持续3-4周。使用游标卡尺测量肿瘤并记录肿瘤尺寸。
    1. 沿肿瘤最长轴（L）及其垂直方向的轴（W）进行测量。使用公式 L × (W2) = V 计算肿瘤体积（V）。若肿瘤在任一维度超过20 mm，或出现溃疡迹象，应在实验结束前对动物实施安乐死。
  2. 当肿瘤体积达到400 mm3时，计划将小鼠用于IVC结扎实验。

3. 麻醉与准备

  1. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉，并皮下注射镇痛剂：抓住小鼠尾根部，将其固定于非惯用手的背侧表面。
  2. 将小鼠转移至充满3%-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中。通过夹趾反射消失确认全身麻醉效果充分。维持麻醉时使用1%-3%异氟烷。双眼涂抹兽用眼膏。
  3. 皮下注射布托啡诺（用于缓解疼痛的阿片类药物）：将布托啡诺原液用0.9%氯化钠（NaCl）溶液稀释至0.3 mg/mL的储备浓度，再进一步稀释至0.03 mg/mL的工作浓度。
  4. 术前皮下注射0.03 mg/mL布托啡诺，剂量为0.05–0.1 mg/kg，并同时注射500 µL无菌0.9% NaCl溶液。对于一只20 g的小鼠，需注射2 µg布托啡诺，即0.03 mg/mL溶液66 µL。
  5. 皮肤准备：将完全麻醉的小鼠仰卧置于加热毯上。用0.5%氯己定酊剂对腹部前侧区域消毒两次。操作过程中需频繁检查加热毯温度，确保温度不下降。

4. 下腔静脉结扎

  1. 正中开腹术
    1. 使用精细剪刀从剑突开始沿腹壁皮肤剪开至膀胱处。用无创镊子在皮肤切口的中点夹住腹膜。确保切口与上方肠管之间有足够的空间（图2A）。
    2. 沿无血管的白线纵向切开腹膜。
  2. 将肠管移至右侧腹腔
    1. 用湿润的棉签轻轻牵拉肠管，并用完全湿润的无菌纱布覆盖。确保被覆盖的肠管处于无张力状态，避免对肠系膜血管施加过度牵拉。
  3. 充分暴露下腔静脉（IVC）及其分支，包括左肾静脉汇入下腔静脉的部位（图2B）。
    1. 滴加200–300 µL生理盐水。探查输尿管、下腔静脉、主动脉及肾静脉的走行（图2）。
  4. 肾下下腔静脉与左肾静脉汇合处的无血管平面。
    1. 使用闭合尖端的无创镊子，沿尾侧至头侧方向，轻柔地将6-0聚丙烯缝线穿过该无血管平面2–3次。
    2. 如有轻微渗血，使用棉签轻压止血。通过轻柔的尾侧至头侧移动6-0聚丙烯缝线，进一步扩大该平面。
  5. 电凝处理性腺支和腰支（图2D）
    1. 可能存在多达4条后方或腰支。为避免脊髓缺血和间歇性跛行等潜在并发症，本方案中保留腰支完整。
    2. 确认存在2–3条侧支，包括双侧子宫角动脉供血支和髂内血管。确保双侧最先出现的分支被一致切断。在左肾静脉与下腔静脉汇合处（肾下下腔静脉）稍远端电凝双侧分支。注意不要破坏子宫角的静脉引流血管。
      注：选择电凝侧支，是因为该方法可提供光滑且连续的表面，减少不可控出血的风险。此外，与使用10-0缝线结扎相比，电凝操作更快、更可行，因此动物接受的手术时间更短、更安全。
  6. 再次检查输尿管走行及血管结构，确保无渗血或误伤电凝（图2C）。
  7. 实验组使用血管夹进行下腔静脉结扎
    1. 使用无创镊子将血管夹调整至与2-0尼龙缝线宽度相匹配。在实验组中，将定制的血管夹环绕肾下下腔静脉放置。
    2. 将血管夹置于缝线上方。初次缝线通过时，通过2–3次精细的尾侧至头侧移动，形成足够宽的无血管平面（图2E-F）。
    3. 进一步将血管夹穿过已准备好的平面。在左肾静脉与下腔静脉汇合处，将平面充分扩大，以确保血管夹顺利通过（图2E）。
    4. 将定制的血管夹水平放置，垂直于下腔静脉走行方向，穿过已准备好的平面。将血管夹置于5-0聚丙烯缝线上，以确保留有足够空间（图2G）。
    5. 确保上述操作轻柔进行，防止血管夹部位发生血管损伤或出血。观察手术区域是否有渗血，若出现渗血，使用棉签轻压止血。
  8. 对照组使用缝线进行下腔静脉结扎
    1. 使用6-0聚丙烯缝线进行缝扎。在已准备好的平面内，于5-0丝线之上围绕肾下下腔静脉打外科方结。
    2. 缝合完成后，轻柔移除丝线，以确保留有足够空间。
  9. 皮下注射200 µL生理盐水。
    注：为提供一种可与夹闭法部分下腔静脉阻断相比较的技术，本研究中对血管夹进行定制，使其夹唇间留有间隙。随后将该血管夹置于左肾静脉与下腔静脉汇合处已准备好的无血管平面内。
  10. 使用连续锁边4-0薇乔缝线关闭腹腔切口。

5. 首次手术后的随访

  1. 术后在独立的清洁笼具中持续观察动物1小时，或直至其平衡能力和翻正能力恢复（以先达到者为准），直至完全苏醒。
  2. 术后每日观察动物2天。若动物表现出痛苦迹象，则每日观察两次，持续2天。根据方案给予术后镇痛和补液治疗。
    1. 将浓度为0.3 mg/mL的丁丙诺啡储备液用0.9%氯化钠（NaCl）溶液稀释，配制成0.03 mg/mL的工作浓度。
    2. 在首次手术后的前48小时内，每8至12小时皮下注射一次0.03 mg/mL丁丙诺啡，剂量为0.05–0.1 mg/kg，并同时给予500 µL无菌0.9% NaCl溶液。对于一只20 g的小鼠，需给予2 µg或66 µL的0.03 mg/mL丁丙诺啡。

6. 安乐死并获取含有血栓的下腔静脉

  1. 将小鼠置于异氟烷麻醉舱中进行麻醉，用手抓住小鼠尾根部，并将其背部朝上置于手背表面。
  2. 将小鼠转移至充满3%-4%异氟烷的持续麻醉诱导舱中，使其呈仰卧位。
  3. 按照描述，从剑突开始沿中线做一长切口，延伸至膀胱。
  4. 将肠管移至腹腔右侧，暴露并采集位于髂动脉分叉远端至肾下腔静脉段的夹闭下腔静脉（图2G）。
  5. 在采集血栓和肿瘤组织后，通过颈椎脱位法处死动物。

7. 统计分析

  1. 根据具体情况，采用均值、中位数和标准差（SD）或均值的标准误（SEM）、第25或第75百分位数，或包括最小值和最大值在内的全值范围来呈现统计分析结果。根据需要进行学生t检验和F检验。统计学显著性水平设定为 p <0.05。

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结果

将处于对数生长期的MC-38细胞注射至一组8至12周龄的雌性C57Bl6/J小鼠体内。异种移植瘤在注射后第三至第四周迅速生长18。当肿瘤体积达到平均400 mm3时，将小鼠随机分为对照组和实验组。对照组小鼠接受缝线结扎下腔静脉（IVC）处理，而实验组小鼠则采用血管夹进行IVC结扎。对照组与实验组的肿瘤体积相似，差异无统计学意义（353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46.2 mm3，p = 0.445）。在术后48小时，采集肾下IVC至髂静脉分叉处包含血栓的血管段，以血栓重量作为静脉血栓形成倾向的生物学指标。所有对照组和实验组动物的术后过程均顺利，未见子宫角变色、肌肉骨骼缺血或下肢跛行等异常表现。第二次剖腹探查时未发现血管夹移位现象。实验终止前未观察到动物死亡。

血栓重量与标准化体重的比值
由于移植瘤小鼠可能会出现体重下降，因此将血栓重量（单位为 mg）根据处死时的总体重（单位也为 mg）进行标准化处理。与对照组小鼠相...

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讨论

在同系异体移植结肠癌模型中，我们观察到实验组的血栓形成性及凝血标志物表达水平均高于对照组。重要的是，与对照组相比，实验组在所有这些参数上的变异程度更低。该改良方法涉及在下腔静脉与左肾静脉汇合处引入一个具有特定压力曲线的血管夹。血管夹置于一个垫片之上，该垫片为一根5-0聚丙烯缝线。此改良可减少血栓大小及血栓标志物的变异性。所有小鼠均达到100%存活率。

技术细节
该操作过程需特别注意多个步骤。开腹后，需仔细检查双侧输尿管，以防止任何意外损伤。为获得最佳暴露视野，将肠管用湿润纱布覆盖并置于右上腹，避免过度牵拉。接下来，对下腔静脉（IVC）的侧支血管进行电凝，电凝点应距离输尿管、下腔静脉和主动脉至少2至3 mm，以防静脉损伤。在确保完全止血后，准备进行下腔静脉结扎的分离平面。需要注意的是，小鼠的主动脉与下腔静脉在其走行过程中紧密相连，若试图将其分离，可能导致出血并造成动物死亡。唯一的例外是左侧肾静脉与主动脉的汇合处21。随后，使用镊子进行不超过三次精细、锐性且呈发散式的穿刺动作，以建立缝合通道。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国心脏协会心血管肿瘤学SFRN CAT-HD中心资助项目857078（KR、VCC、XY和SL）以及R01HL166608（KR和VCC）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
布托啡诺 0.3 mg/mLPAR制药 NDC 42023-179-05
C57BL/6J 小鼠杰克逊实验室IMSR_JAX:000664
CaliperVWR International，美国宾夕法尼亚州拉德诺12777-830
CD31AbcamAb9498
细胞计数仪MOXIEMXZ000
夹钳 精细科学工具   13002-10
单夹 ASSI.B2V，通用型夹具精准外科手术 &和科学仪器PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF 镊子Fine Science Tools11252-00
纤维蛋白默克密理博MABS2155-100UG
大环精细剪刀Fine Science Tools14040-10
镊子 Fine Science Tools11002-12
希尔止血钳Fine Science Tools13111-12
异氟烷，USP CovetrusNDC 11695-6777-2
MC-38 细胞Sigma AldrichSCC172
显微镜尼康Eclipse倒置显微镜TE2000
剪刀 Fine Science Tools  14079-10
缝线-薇乔（Vicryl）AD-外科手术#L-G330R24
缝合线-尼龙 2-0Ethilon664H
缝合线-普理灵5-0Ethicon8661G
缝合线-Prolene 6-0EthiconPDP127
VEV03100VisualSonics富士胶片
Vitrogel Matrigel 基质Well BioscienceVHM01 

参考文献

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