该方案介绍了一种利用倒置共聚焦显微镜简化活体成像的新工具。
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摘要
摘要
理解正常与异常 体内 观察细胞行为对于开发临床干预措施以阻止疾病的发生和进展至关重要。因此，优化有助于观察细胞动态的成像方法具有重要意义。 原位，其中组织结构和组成保持未受干扰状态。表皮是人体最外层的屏障，也是最常见的人类癌症——皮肤癌——的主要来源。皮肤组织的可及性为利用无创活体显微技术在完整动物体内监测上皮和真皮细胞行为提供了独特的机会。然而，这种复杂的成像方法主要依赖于直立式多光子显微镜，这对大多数研究人员而言构成了较高的技术门槛。本研究介绍了一种定制设计的、可3D打印的显微镜载物台插件，适用于倒置共聚焦显微镜，可简化对活体转基因小鼠耳部皮肤的长期活体成像过程。我们认为，这一多功能装置可根据不同品牌和型号的倒置显微镜进行个性化调整，并可进一步改造用于其他器官系统的成像，将显著提升活体显微技术的可及性，从而为更广泛的科研群体提供重要工具。这一技术进步对于深入理解正常与疾病状态下活细胞动态过程具有重要意义。
引言
活体显微镜是一种强大的工具，能够在未受干扰的体内环境中监测细胞行为。这一独特方法为深入了解复杂的哺乳动物器官系统（包括肺1、脑2、肝3、乳腺4、肠5和皮肤6）的内部运作机制提供了关键见解。此外，该方法还揭示了肿瘤发生7、伤口愈合8,9、炎症10以及其他多种病理过程中细胞行为的改变原位。在本研究中，我们致力于提高活体显微镜的可及性，以对完整小鼠皮肤中的活体上皮和间质动态进行成像。由于哺乳动物皮肤具有显著的再生能力和致瘤潜能，理解其细胞行为具有重要的临床意义。
小鼠活体成像 主要使用直立式多光子显微镜进行，因其能够在组织深层提供高分辨率成像 >100 µm11,12。然而，这些仪器 缺乏倒置共聚焦显微镜所具备的实用多功能性和更广泛的可及性，后者操作更简便、成本效益更高，能够对培养细胞进行成像，成像过程中无需完全避光，且通常更安全，具有诸多显著优势13,14在本研究中，我们介绍了一种新工具，通过将该方法适配于倒置共聚焦显微镜，显著提高了活体成像的可及性。
本文介绍了一种3D打印的定制显微镜载物台插件设计，该设计包含多个关键特性，可实现在倒置共聚焦显微镜上对小鼠耳部皮肤进行稳定、长期的活体成像（图1、图2、图3、图4 和 图5）。这些特殊功能包括一个偏置物镜孔，可使成年小鼠整个身体在成像过程中完全平放，从而最大限度地减少小鼠身体运动对成像造成的振动干扰，并避免使用氯胺酮和赛拉嗪来抑制呼吸——这种做法常与活体成像结合使用6。此外，插件上的角部支架可准确定位异氟烷鼻罩，使其与小鼠面部对齐；金属耳夹将小鼠耳部固定在定制的盖玻片圆盘上；可选的可拆卸闭环生物反馈加热板平整嵌入插件内部，可在长时间成像过程中维持小鼠体温。该定制盖玻片圆盘通过在机加工车间去除普通含盖玻片细胞培养皿的侧壁制成，为小鼠头部和耳部提供必要的平坦支撑表面。结合使用40倍硅油浸没物镜（1.25数值孔径[N.A.]，0.3 mm工作距离）、盖玻片圆盘和定制载物台插件，可获得深度超过50 µm耳部真皮层的高分辨率图像>。
为了测试这种新型倒置显微镜载物台插入装置的功能，我们在活体转基因 K14-H2B-mCherry 小鼠耳部皮肤上，跨越表皮所有上皮层，连续3小时采集了z轴层扫图像15 成年小鼠（该小鼠品系的上皮细胞核含有红色荧光标记）图6A-A'）。我们还在活体转基因 Pdgfra-rtTA 小鼠耳部皮肤真皮层中，对跨越多个成纤维细胞层的区域进行了为期 3 小时的时间序列 z 轴层扫成像16；pTRE-H2B-GFP17 成年小鼠（该小鼠品系的成纤维细胞核在多西环素诱导后带有绿色荧光标记）图6B-D'）。我们的高分辨率数据显示，在x、y和z平面上均无漂移现象，表现出稳定的成像性能，从而证明了该新型活体成像工具在倒置显微镜上应用的有效性。重要的是，该3D打印载物台插件的尺寸可根据文中所述方法进行调整， 补充文件 1, 补充文件 2，以及 补充文件 3，可适配任何倒置显微镜，且插入件中的物镜开口位置可调整至不同位置，以更适应特定组织和/或动物模型的成像需求。因此，该发明可使拥有共聚焦显微镜核心设施使用权的独立实验室或研究人员，根据其独特的活体成像需求灵活改装此工具，从而简化对多种样本的评估流程 体内 细胞生物学
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方案
本研究严格遵守埃默里大学和亚特兰大退伍军人事务医疗中心的动物护理与使用指南，并已获得机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 在倒置显微镜载物台上安装活体成像插件
- 使用 .stl 文件构建插入片段（补充文件1，补充文件2，以及 补充文件 3) 指定三维尺寸和设计（参见 图1 和 图2A），3D 打印机和聚乳酸（PLA）。
- 小心地将插入片段（图2B, C）放入显微镜载物台的大凹槽中（图2C 和 图3A）。使用螺丝固定插入件 通过 位于插入件每个角上的四个螺钉孔（图2B- C).
注意：插入件为双向设计，可根据显微镜的方向旋转180° 载物台和麻醉装置。 - 将加热板插头朝下插入插槽中（图 2D) 因此，该装置置于下层插槽上方，插头端口从载物台下方穿过。图3B).
- 将插入件中的带槽圆形开口与40倍硅油浸入式物镜对齐（图3C）并将硅油涂抹在物镜中央。
- 若进行较长时间段的成像（>1 小时），在盖玻片与物镜接触面涂抹足量的镜油，确保整个成像过程中油层持续存在。注意勿使镜油溢出物镜边缘。
- 使用注射器将少量真空脂涂抹于带凹槽的圆形开口处，然后将盖玻片圆盘置于其上，以密封插入件（图3D).
注意：盖玻片圆盘是通过移除35 mm × 10 mm玻璃底细胞培养皿的侧壁而制成的（由机加工车间完成）。 - 将40倍物镜抬升，直至镜油接触玻璃盖玻片底部。
2. 异氟烷配置与小鼠准备
- 放置低流量电子蒸发器的各个组件（麻醉室、管路、蒸发器、活性炭罐），使鼻罩及其连接的管路能够到达插入件（图3A）。
注意：异氟烷为吸入性麻醉剂，操作时应小心，避免泄漏，并尽量减少人员接触。 - 使用前称量异氟烷瓶的重量并记录。将电子蒸发器的瓶帽连接至异氟烷瓶上。
- 将电源线连接至电子蒸发器。关闭蓝色鼻罩夹，打开白色诱导室夹，使气流通过麻醉室进入活性炭罐。取下机器左侧的红色环境空气帽，以允许空气流通。
- 以200 mL/min（低流量）和2%异氟烷的条件让系统预热5分钟。
注意：尽管已选择鼻罩模式，蓝色鼻罩管路应保持关闭，白色诱导室管路应保持打开。 - 待系统充分平衡后，冲洗管路以清除麻醉室中残留的异氟烷。
- 将小鼠放入诱导室，并选择高流量模式。在将动物身体放置于插入件上方之前，完成所有小鼠准备工作（如脱毛、局部药物给药、眼膏涂抹等）。通过脚趾夹捏反射法确认小鼠已完全麻醉。
- 将小鼠腿部伸展，用指甲牢固夹捏脚趾，注意不要造成物理损伤。若小鼠对刺激产生阳性反应（如腿部回缩、足部抽动等），则继续在麻醉室内给予麻醉剂，直至无反应为止。适当麻醉后，小鼠呼吸频率 应减慢至约55–65次/分钟18。
- 当小鼠完全麻醉后，再次选择高流量模式以停止异氟烷输送。在打开麻醉室前进行冲洗，并调整夹子（蓝色：打开；白色：关闭），使异氟烷通过鼻罩输送。将鼻罩连接至小鼠后，选择低流量模式以持续输送异氟烷。
- 将带有鼻罩的异氟烷管路穿过插入件上的角落管路支架（图3A 和 图5）。
3. 活体成像时小鼠在插入装置上的放置
- 将加热板插入控制器（控制器附带一个直肠探头），打开电源，使加热板升温至 36 °C（图 4A）。
- 将麻醉后的小鼠从诱导室中取出，横置于加热板上（图 4B 和 Figure 5A）。从诱导室转移到固定装置的过程应迅速完成，以尽量减少小鼠在无吸入麻醉状态下活动的时间。
- 将鼻罩固定在小鼠鼻部（图 4B、C 和 图 5）。如有需要，可用胶带进一步固定鼻罩的角度和位置。
- 插入直肠探头，并调节控制器温度，使小鼠体温稳定在约 36 °C（图 4A、B）。小鼠正确固定后，如需进一步维持适宜体温，可用塑料保鲜膜覆盖以保温（图 4C）。
- 调整小鼠位置，使其头部与盖玻片圆盘对齐，并使用金属耳夹（图 5A、B）或胶带（图 5C）将耳朵固定在玻璃盖玻片中心。
注意：可通过松开固定耳夹的螺丝来调节金属耳夹对耳朵的压力，从而调整夹持力度。可添加金属弹簧以增强耳夹的紧固灵活性。- 如需更换耳夹位置，使用 2.5 mm 内六角扳手拧下螺栓，并转移至备用位置（图 2B、C）。重新组装耳夹时，先将耳夹贴合固定装置，再放上垫片，最后用螺栓施加适当力度牢固固定，使耳夹可轻微转动。
- 调节物镜的 z 轴位置，直至细胞位于焦平面上（图 6A、D）。根据实验目标设定 z 轴层扫和延时成像参数，并开始图像采集。
注意：若设置正确，可连续成像小鼠耳朵至少 3 小时（图 6A'、D'）。- 设定 z 轴层扫范围后，调节激光功率和增益，确保任一 z 平面均不出现过曝，以最小化光漂白。根据 z 轴层扫总厚度、步数（建议符合奈奎斯特采样定理）和时间间隔确定延时成像参数。
- 根据多种因素确定成像参数（时间间隔、总成像时间等），包括动物在麻醉状态下的存活能力、激光引起的光漂白/光毒性，以及活体成像的目标（如细胞分裂动态、细胞间相互作用等）。
4. 成像终止
- 在图像采集结束前至少30分钟，打开循环水加热垫，并设置为连续循环模式和35 °C。
- 成像完成后，在电子蒸发器上选择低流量以停止异氟烷输送，并将小鼠转移至加热垫上，直至其恢复自主活动能力。
- 待小鼠清醒后，将其移回转运容器，同时继续将其置于加热垫上直至完全恢复自主活动。在加热垫期间应持续监测小鼠，直至其对外界刺激有反应。
- 在电子蒸发器上，点击选择菜单 > 麻醉控制 > 排空。从系统中取出异氟烷瓶，并将厂家提供的瓶盖重新盖好。
- 称量异氟烷瓶和活性炭过滤罐的重量，并将重量记录到日志中。当活性炭过滤罐的重量超过初始基准值50 g时，应将其丢弃并更换新的过滤罐。将异氟烷瓶放回带锁的储存箱中。
- 取下盖玻片圆盘，用镜头纸和镜头清洁液擦拭干净。妥善存放以避免划伤，以便重复使用。
- 从插槽支架上取下麻醉 管路，并将插件从显微镜载物台上旋下。
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结果
通过在倒置共聚焦显微镜上正确组装活体成像插件，并将转基因小鼠恰当地置于插件上，可在至少1小时的时间范围内对荧光标记的活体耳组织进行z轴层扫描，且在x、y和z轴方向上几乎无漂移现象，从而验证组装与定位的准确性。应以固定的时间间隔（间隔时间取决于具体的生物学问题、荧光信号强度等）采集图像，以便随时间追踪细胞动态变化和图像漂移情况。在整个成像过程中，通过监测单个z平面是否持续保持在焦内，可判断动物的运动是否干扰了成像的稳定性。使用该活体成像插件在长时间成像过程中维持单个z平面聚焦状态的示例如图6所示。
从3小时延时录像中选取的四个60分钟时间点的图像（见图6A'），该录像是以2分钟为间隔，对一只3月龄成年雄性K14-H2B-mCherry小鼠（约30 g）耳朵中表达mCherry的表皮细胞进行采集，z轴步进为0.246 µm，在总z轴深度24 µm范围内实现奈奎斯特采样（每个时间点采集99张z轴层叠图像）。
从一只...
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讨论
本研究介绍了一种新工具，可在倒置共聚焦显微镜上实现完整小鼠皮肤上皮组织的稳定、长期 活体成像。该装置由聚乳酸（PLA）制成，PLA 是最常见且成本最低的可3D打印材料；制作该插件的全部内部3D打印成本低于<5美元。两个独立的插件部件（图1、补充文件1和补充文件2）可通过紧定螺钉轻松组装（见材料表）。值得注意的是，所提供的.stl文件也可用于通过商业途径订购该插件。另一种选择是使用数控机床（CNC）以阳极氧化铝加工制造该插件，但成本显著更高。
为了使用这种新工具在一段时间内实现可靠且高效的成像，关键是要根据用户的显微镜载物台正确设计活细胞成像插件的尺寸。补充文件1、补充文件2和补充文件3可进行调整，以反映与所选显微镜兼容的合适插件尺寸，然后进行3D打印。带有固定盖玻片圆盘的精确插件尺寸可最大程度减少每次成像...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢Valentina Greco提供K14-mCherry-H2B小鼠。感谢埃默里大学物理系机械车间制备玻璃盖玻片圆盘。本研究由美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发服务向LS提供的职业发展奖#IK2 BX005370、向MJMR提供的美国国立卫生研究院（NIH）资助RF1-AG079269和R56-AG072473，以及向MJMR提供的埃默里医学院/佐治亚理工学院I3计算与数据分析奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3D 打印机 | Qudi Tech | i-Fast | 使用 PLA 材料进行 3D 打印 |
| 40x 1.25NA 硅油物镜 | Nikon | ||
| AxR 激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon | ||
| 棉签 | VWR | 76337-046 | 用于乳膏/软膏涂抹 |
| 盐酸多西环素 | Sigma-Aldrich | D9891 | 在 Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP 小鼠中诱导成纤维细胞核的 GFP 标记 |
| 平头螺丝刀（2.5 mm） | 将插入件固定到显微镜载物台上 | ||
| 平头螺丝 × 4（#6-32） | Nikon | 将插入件拧紧至显微镜载物台 | |
| 玻璃底培养皿 | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | 通过机械加工去除培养皿侧壁，改造成适用于活细胞成像插入件的盖玻片圆盘；35 mm 直径圆盘包含 20 mm 直径玻璃盖玻片 |
| 加热板控制器 | Physitemp | TCAT-2LV | 动物体温控制器 — 低压型；配备直肠探头用于小鼠体温监测 |
| 六角扳手（1.5 mm） | 用于调节 M3 紧定螺钉 | ||
| 六角扳手（2.5 mm） | 调节金属耳夹的张力 | ||
| 活体成像插入件 | |||
| 异氟烷 | Med-Vet International | HPA030782-100uL | 用于小鼠麻醉 |
| 标签胶带（或透明胶带） | VWR | 10127-458 | 替代金属耳夹，将耳朵固定在盖玻片上 |
| 金属夹具 | 用作耳夹 | ||
| 小鼠：C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | 成纤维细胞特异性启动子驱动多西环素可诱导的 rtTA 表达 |
| 小鼠：K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | 以 mCherry 标记表皮上皮细胞核；文中简称为 "K14-H2B-mCherry" | |
| 小鼠：pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | 与 Pdgfra-rtTA 联用并在多西环素诱导下，以 GFP 标记成纤维细胞核 |
| 多功能密封膜 | Glad | 增强小鼠保温效果 | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | 眼部润滑剂 |
| 紧定螺钉 × 3（M3；6 mm） | Thorlabs | SS3M6 | 用于加热板模块的固定 |
| 硅油浸油 | 应用于 40x 硅油物镜 | ||
| 小型动物加热板 | Physitemp | HP-4M | 为动物提供热量 |
| Somnoflow 低流量电子蒸发器 | Kent Scientific | SF-01 | 用于小鼠麻醉 |
| 真空润滑脂 | Flinn Scientific | AP1095 | 用于密封盖玻片圆盘与插入件 |
| Veet | 脱毛 | ||
| 循环水加热垫 | Stryker Medical | TP700 | 用于成像后小鼠复苏 |
参考文献
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