RNA 荧光 原位 杂交法用于长链非编码 RNA 在人骨肉瘤细胞中的定位

摘要

本实验方案描述了一种RNA荧光原位杂交方法，用于定位人骨肉瘤细胞中的长链非编码RNA（lncRNA）。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的重要作用已被广泛研究，例如调控癌细胞的增殖、上皮-间质转化（EMT）、迁移、浸润以及自噬等过程。对lncRNA在细胞内的定位检测有助于揭示其生物学功能。通过设计特异性的lncRNA反义链序列并标记荧光染料，可应用RNA荧光原位杂交（FISH）技术来检测lncRNA的细胞定位。随着显微镜技术的发展，RNA FISH技术现已能够实现对表达水平较低的lncRNA的可视化观察。该方法不仅能单独检测lncRNA的定位，还可结合双色或多色免疫荧光技术，实现与其他RNA、DNA或蛋白质的共定位分析。本文以人骨肉瘤细胞（143B）中lncRNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）为例，详细介绍了RNA FISH实验的操作步骤及注意事项，旨在为希望开展RNA FISH实验、尤其是lncRNA FISH实验的研究人员提供参考。

引言

近年来，全基因组技术的进步极大地拓展了我们对人类基因组的认识。人类基因组中约有93%的区域可以转录为RNA，但其中仅有2%的RNA能够翻译成蛋白质；其余98%不具有蛋白质翻译功能的RNA被称为非编码RNA（ncRNA）¹。作为一类非编码RNA（ncRNA），长链非编码RNA（lncRNA）包含超过200个核苷酸²，因其参与细胞的多种生理与病理过程，如分化、周期调控、凋亡、迁移和侵袭等，而受到越来越多的关注^3,4,5。lncRNA通过多种机制发挥功能，例如调控染色质结构和核内基因表达、调节mRNA剪接过程以及参与转录后修饰⁶。lncRNA在转录水平和转录后水平上均能调控恶性肿瘤的发生、发展及转移。转录水平的调控主要在细胞核内通过与染色体结构结合影响RNA转录实现，而转录后调控则在细胞质中通过内源性竞争性RNA（ceRNA）机制调控靶基因实现^{5, 7, 8}。ceRNA揭示了一种新的RNA相互作用机制，即lncRNA可作为“分....

方案

有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。图1展示了RNA FISH的整体实验流程；表1列出了所有溶液的组成成分，表2列出了本实验方案中使用的引物序列。

1. 探针制备

1. 从 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等数据库中识别并获取目标 lncRNA 的 FASTA 序列。根据网站提示，在线设计原位杂交（ISH）探针¹⁹，并参考设计算法的建议，列出需订购的 Cy3 标记探针。
2. 提前将杂交缓冲液在 37 °C 下孵育 2 小时。
3. 避光条件下，将 4 光密度（OD）单位的探针溶解于 160 µL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的无核酸酶水（ddH₂O）中，使其终浓度为 1 mg/mL。
   注：光密度（OD）是 DNA 和 RNA 的测量单位。通常，1 OD 单位 = 33 µg/mL DNA。
4. 为每孔准备 200 µL 探针混合液（含 1.2 µL–10 µL 探针、70 µL 杂交缓冲液，用 DEPC 处理的 ddH₂O ....

结果

人骨肉瘤细胞中SNHG6 FISH的代表性图像如（图2）所示。阴性对照使用阴性Ctrl探针处理；阳性对照使用U6探针处理²⁰。SNHG6探针和U6探针均用Cy3标记，可发出红色荧光。DAPI是一种可染色DNA并发出蓝色荧光的染料。该结果表明SNHG6主要定位于细胞质中，这一信息可为SNHG6的进一步研究提供重要方向。

如果使用非常高浓度的探针，在荧光显微镜下可能会观察到背景着色。图3展示了在RNA FISH中使用高浓度SNHG6探针时的代表性图像。白色箭头指示非特异性染色。

讨论

该RNA FISH方案不仅可以检测lncRNA在细胞内的定位，还可以检测其他RNA、DNA或蛋白质在细胞内的共定位，也可用于检测lncRNA在石蜡包埋组织中的位置。然而，在此类情况下具体方案有所不同，因为石蜡包埋组织需要进行脱蜡处理²¹。该实验操作可应用于48孔或96孔板，但384孔板过小，不适用于此实验。

该方法有几个关键步骤需要注意，包括无RNase环境、探针浓度、杂交温度以及阴性对照和阳性对照的设置。首先，无RNase环境至关重要，因为RNase会破坏核苷酸之间的化学键，导致长链非编码RNA（lncRNA）普遍降解。其次，通常推荐的探针浓度范围为5至50 µg/mL。探针浓度过高会导致lncRNA的非特异性结合，而浓度过低则可能导致lncRNA检测不敏感或失败¹⁹。如果使用极高浓度的探针，即使仅使用乱序探针（阴性对照），在荧光显微镜下也能观察到背景染色；因此，在初步实验中探索合适探针浓度时，通常使用相同浓度的阴性对照以建立基线（与内参对照相同），从而避免任何非特异性结合。在阴性对照.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	上海西默生物科技有限公司	IC1000	细胞计数
12孔细胞培养板	上海约年生物科技有限公司	3513,corning	将盖玻片放置于培养板中
细胞系 (143B)	中国科学院细胞库	CRL-8303	骨肉瘤癌细胞系
离心管 (15 mL, 50 mL)	上海约年生物科技有限公司	430790, Corning	离心细胞
盖玻片	上海约年生物科技有限公司	abs7026	将细胞接种于盖玻片上
Cy3标记的SNHG6 DNA探针	上海吉玛制药技术有限公司	A10005	检测SNHG6定位
DMEM培养基	上海约年生物科技有限公司	LM-E1141	细胞培养基
干式恒温孵育器	海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司	DKT200-2	在不同高温条件下孵育
100%乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218	脱水
荧光显微镜	上海外海生物科技有限公司	Olympus BX43 配备 Olympus U-TV0.5XC-3 相机 (SN:5J01719), olympus	观察与定位
培养箱	上海一恒科学仪器有限公司	DHP-9051	样品在37 °C下孵育
封片剂	生工生物工程（上海）股份有限公司	E675004	将盖玻片固定于载玻片上
摇床	海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司	TS-8S	洗涤样品
载玻片	上海约年生物科技有限公司	188105	将盖玻片置于载玻片上
Triton X-100	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600198	通透细胞膜和核膜
胰蛋白酶 (0.25%)	上海约年生物科技有限公司	25200056, Gibco	细胞胰酶处理
Tween-20	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600560	去垢剂