RNA 荧光 原位 杂交法用于长链非编码 RNA 在人骨肉瘤细胞中的定位

摘要

本实验方案描述了一种RNA荧光原位杂交方法，用于定位人骨肉瘤细胞中的长链非编码RNA（lncRNA）。

摘要

长链非编码RNA（lncRNA）在癌症中的重要作用已被广泛研究，例如调控癌细胞的增殖、上皮-间质转化（EMT）、迁移、浸润以及自噬等过程。对lncRNA在细胞内的定位检测有助于揭示其生物学功能。通过设计特异性的lncRNA反义链序列并标记荧光染料，可应用RNA荧光原位杂交（FISH）技术来检测lncRNA的细胞定位。随着显微镜技术的发展，RNA FISH技术现已能够实现对表达水平较低的lncRNA的可视化观察。该方法不仅能单独检测lncRNA的定位，还可结合双色或多色免疫荧光技术，实现与其他RNA、DNA或蛋白质的共定位分析。本文以人骨肉瘤细胞（143B）中lncRNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）为例，详细介绍了RNA FISH实验的操作步骤及注意事项，旨在为希望开展RNA FISH实验、尤其是lncRNA FISH实验的研究人员提供参考。

引言

近年来，全基因组技术的进步极大地拓展了我们对人类基因组的认识。人类基因组中约有93%的区域可以转录为RNA，但其中仅有2%的RNA能够翻译成蛋白质；其余98%不具有蛋白质翻译功能的RNA被称为非编码RNA（ncRNA）¹。作为一类非编码RNA（ncRNA），长链非编码RNA（lncRNA）包含超过200个核苷酸²，因其参与细胞的多种生理与病理过程，如分化、周期调控、凋亡、迁移和侵袭等，而受到越来越多的关注^3,4,5。lncRNA通过多种机制发挥功能，例如调控染色质结构和核内基因表达、调节mRNA剪接过程以及参与转录后修饰⁶。lncRNA在转录水平和转录后水平上均能调控恶性肿瘤的发生、发展及转移。转录水平的调控主要在细胞核内通过与染色体结构结合影响RNA转录实现，而转录后调控则在细胞质中通过内源性竞争性RNA（ceRNA）机制调控靶基因实现^{5, 7, 8}。ceRNA揭示了一种新的RNA相互作用机制，即lncRNA可作为“分子海绵”吸附miRNA，从而抑制miRNA介导的相关靶基因降解⁹。因此，了解lncRNA的亚细胞定位信息——即特定lncRNA是位于细胞质还是细胞核——对于揭示其生物学功能具有重要意义。

目前，lncRNA 的定位主要通过两种方法检测：一种是细胞核/细胞质分馏分离实验，另一种是 RNA 荧光原位杂交（RNA FISH）。在前一种方法中，分别提取细胞质和细胞核组分中的 RNA，然后使用特异性的 lncRNA 引物进行 PCR 扩增，以检测 lncRNA 在细胞质与细胞核中的比例。该方法的优点是耗时较短，缺点在于细胞质和细胞核中 lncRNA 的相对比例并不能直接反映 lncRNA 的实际定位情况。RNA FISH 通过设计针对 lncRNA 的特异性反义链序列，并用荧光染料标记，从而在细胞内检测 lncRNA 的定位¹⁰。随着探针技术和检测方法的进步，RNA FISH 技术已得到改进，包括使用荧光标记的多寡核苷酸探针组¹¹、锁核酸（LNA）探针¹²以及分支 DNA（bDNA）探针¹³。RNA FISH 不仅可用于检测 lncRNA 的定位，还可结合双色或多色免疫荧光技术，检测其与其他 RNA、DNA 或蛋白质的共定位情况¹⁴。

本研究以RNA荧光原位杂交（RNA FISH）技术检测成骨肉瘤细胞（143B）中长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因6（SNHG6）的亚细胞定位为例，提供了详细的实验方案。SNHG6在成熟剪接形式下为600–730个核苷酸长度的长链非编码RNA，已被鉴定为多种人类癌症中的新型癌基因，包括结直肠癌、胃癌、卵巢透明细胞癌、成骨肉瘤和肝细胞癌^15,16,17,18。已有研究证实SNHG6参与调控癌细胞的多种生物学行为，如增殖、上皮-间质转化（EMT）和自噬，并显示其主要定位于细胞质中，可能通过结合（“海绵吸附”）miRNA来调控靶基因的表达^15,16,17。本文详细介绍了利用RNA FISH技术检测SNHG6在细胞内定位的实验流程。

方案

有关本实验方案中使用的所有材料、试剂和仪器的详细信息，请参见材料表。图1展示了RNA FISH的整体实验流程；表1列出了所有溶液的组成成分，表2列出了本实验方案中使用的引物序列。

1. 探针制备

1. 从 GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等数据库中识别并获取目标 lncRNA 的 FASTA 序列。根据网站提示，在线设计原位杂交（ISH）探针¹⁹，并参考设计算法的建议，列出需订购的 Cy3 标记探针。
2. 提前将杂交缓冲液在 37 °C 下孵育 2 小时。
3. 避光条件下，将 4 光密度（OD）单位的探针溶解于 160 µL 经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的无核酸酶水（ddH₂O）中，使其终浓度为 1 mg/mL。
   注：光密度（OD）是 DNA 和 RNA 的测量单位。通常，1 OD 单位 = 33 µg/mL DNA。
4. 为每孔准备 200 µL 探针混合液（含 1.2 µL–10 µL 探针、70 µL 杂交缓冲液，用 DEPC 处理的 ddH₂O 补足至 200 µL），并设置一系列浓度梯度：50 µg/mL、25 µg/mL、12.5 µg/mL 和 6 µg/mL。
   注：探针浓度需预先通过实验探索确定。过高浓度会导致 lncRNA 非特异性结合，而过低浓度则可能导致 lncRNA 检测不灵敏或失败。
5. 将探针混合物于 73 °C 变性 5 分钟。
   注：若 Cy3 标记的 DNA 探针为双链，需在 95 °C 下变性 5 分钟以获得单链 DNA，然后立即置于冰上快速冷却 2 分钟。

2. 细胞制备

1. 在12孔细胞培养板中，将143B细胞以每孔50,000个的密度接种于无菌玻璃盖玻片上，加入DMEM培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时。
   注意：此处接种的细胞数量因细胞大小而异，应确保细胞在孵育24小时后达到约50%的汇合度。所用无菌玻璃盖玻片为圆形，适用于12孔板。
2. 吸除培养基，用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，每次5分钟。
   注意：使用经DEPC处理的ddH₂O配制1× PBS。不可使用未经DEPC处理的PBS，因其含有RNase。后续所有操作均需在无RNase条件下进行。
3. 吸除1× PBS，每孔加入200 µL 100%乙醇，在室温下固定15分钟。
4. 吸除乙醇，每孔加入200 µL 0.1% Triton X-100（溶于1× PBS），室温孵育15分钟。
   注意：Triton X-100的透化时间必须严格控制，不可过长。
5. 吸除0.1% Triton X-100，用1× PBS洗涤两次，每次5分钟。
   注意：若需在此处暂停实验流程，可将PBS替换为70%乙醇（用无RNase的ddH₂O稀释100%乙醇制得），并将样本置于4 °C保存，最长可保存3个月。
6. 吸除1× PBS，每孔加入200 µL 2×柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液（用无RNase的ddH₂O将20× SSC稀释），在37 °C孵育30分钟。
7. 吸除2× SSC缓冲液，每孔加入200 µL 70%乙醇，室温孵育3分钟。
8. 弃去70%乙醇，每孔加入200 µL 85%乙醇（用无RNase的ddH₂O稀释100%乙醇制得），室温孵育3分钟。
9. 弃去85%乙醇，每孔加入200 µL 100%乙醇，室温孵育3分钟。
10. 吸除并弃去100%乙醇，让各孔自然干燥。

3. 荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）

1. 向每个孔中加入 200 µL 探针混合物（按步骤 1.5 变性处理），在 37 °C 下孵育过夜（16–18 小时）。
   注意：杂交温度与探针浓度之间存在显著的正相关性；因此，为优化背景信号，应同时降低杂交温度和探针浓度。
2. 次日，从 37 °C 取出样品，弃去探针混合物。向每个孔中加入 200 µL 预热至 65 °C 的 0.4x SSC/0.3% Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤 2 分钟。
3. 弃去 0.4x SSC/0.3% Tween-20 缓冲液，向每个孔中加入 200 µL 2x SSC/0.1% Tween-20 缓冲液，在室温下洗涤 2 分钟。
4. 弃去 2x SSC/0.1% Tween-20 缓冲液，向每个孔中加入 200 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液（1 µg/mL），避光染色 20 分钟。
5. 弃去 DAPI 染色液，用 1x PBS 在室温下洗涤 2 分钟。
6. 在载玻片上加入 50 µL 含有树胶的封片剂，将盖玻片盖在载玻片上以固定样本。
   注意：务必使盖玻片的细胞面朝下放置。
7. 在荧光显微镜下观察。
   注意：可使用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜；后者可提供更高灵敏度和更清晰的成像。

结果

人骨肉瘤细胞中SNHG6 FISH的代表性图像如（图2）所示。阴性对照使用阴性Ctrl探针处理；阳性对照使用U6探针处理²⁰。SNHG6探针和U6探针均用Cy3标记，可发出红色荧光。DAPI是一种可染色DNA并发出蓝色荧光的染料。该结果表明SNHG6主要定位于细胞质中，这一信息可为SNHG6的进一步研究提供重要方向。

如果使用非常高浓度的探针，在荧光显微镜下可能会观察到背景着色。图3展示了在RNA FISH中使用高浓度SNHG6探针时的代表性图像。白色箭头指示非特异性染色。

讨论

该RNA FISH方案不仅可以检测lncRNA在细胞内的定位，还可以检测其他RNA、DNA或蛋白质在细胞内的共定位，也可用于检测lncRNA在石蜡包埋组织中的位置。然而，在此类情况下具体方案有所不同，因为石蜡包埋组织需要进行脱蜡处理²¹。该实验操作可应用于48孔或96孔板，但384孔板过小，不适用于此实验。

该方法有几个关键步骤需要注意，包括无RNase环境、探针浓度、杂交温度以及阴性对照和阳性对照的设置。首先，无RNase环境至关重要，因为RNase会破坏核苷酸之间的化学键，导致长链非编码RNA（lncRNA）普遍降解。其次，通常推荐的探针浓度范围为5至50 µg/mL。探针浓度过高会导致lncRNA的非特异性结合，而浓度过低则可能导致lncRNA检测不敏感或失败¹⁹。如果使用极高浓度的探针，即使仅使用乱序探针（阴性对照），在荧光显微镜下也能观察到背景染色；因此，在初步实验中探索合适探针浓度时，通常使用相同浓度的阴性对照以建立基线（与内参对照相同），从而避免任何非特异性结合。在阴性对照...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动细胞计数仪	上海西默生物科技有限公司	IC1000	细胞计数
12孔细胞培养板	上海约年生物科技有限公司	3513,corning	将盖玻片放置于培养板中
细胞系 (143B)	中国科学院细胞库	CRL-8303	骨肉瘤癌细胞系
离心管 (15 mL, 50 mL)	上海约年生物科技有限公司	430790, Corning	离心细胞
盖玻片	上海约年生物科技有限公司	abs7026	将细胞接种于盖玻片上
Cy3标记的SNHG6 DNA探针	上海吉玛制药技术有限公司	A10005	检测SNHG6定位
DMEM培养基	上海约年生物科技有限公司	LM-E1141	细胞培养基
干式恒温孵育器	海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司	DKT200-2	在不同高温条件下孵育
100%乙醇	国药集团化学试剂有限公司	10009218	脱水
荧光显微镜	上海外海生物科技有限公司	Olympus BX43 配备 Olympus U-TV0.5XC-3 相机 (SN:5J01719), olympus	观察与定位
培养箱	上海一恒科学仪器有限公司	DHP-9051	样品在37 °C下孵育
封片剂	生工生物工程（上海）股份有限公司	E675004	将盖玻片固定于载玻片上
摇床	海门麒麟-贝尔实验仪器有限公司	TS-8S	洗涤样品
载玻片	上海约年生物科技有限公司	188105	将盖玻片置于载玻片上
Triton X-100	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600198	通透细胞膜和核膜
胰蛋白酶 (0.25%)	上海约年生物科技有限公司	25200056, Gibco	细胞胰酶处理
Tween-20	生工生物工程（上海）股份有限公司	A600560	去垢剂