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RGBradford：使用智能手机摄像头进行蛋白质定量

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DOI：

10.3791/65547

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2023年9月8日

1Research Center in Morphology and Applied Immunology, Faculty of Medicine, University of Brasilia

本文内容

摘要

本文提供了一种利用 Bradford 法结合智能手机作为分析设备进行蛋白质定量的实验方案。通过智能手机拍摄的微孔板图像中提取的颜色数据，可对样品中的蛋白质含量进行定量分析。

摘要

蛋白质定量是生命科学研究中的一项基本实验步骤。在多种定量方法中，Bradford 法是使用最广泛的方法之一。由于该方法应用广泛，其优缺点已被充分报道，包括针对原始方法的多种改进以提升其性能。其中一项改进是将智能手机摄像头用作分析仪器。本文利用考马斯亮蓝染料在 Bradford 反应条件下存在的三种不同形式，介绍如何通过从微孔板的一张照片中提取颜色数据，准确测定样品中的蛋白质含量。在微孔板中完成反应后，使用智能手机拍摄照片，并通过一款免费开源的图像分析软件从照片中提取 RGB 颜色数据。随后，利用未知蛋白浓度样品的蓝色与绿色强度比值（RGB 标度下），根据标准曲线计算蛋白质含量。使用 RGB 颜色数据计算所得结果与传统吸光度数据计算结果之间无显著差异。

引言

无论下游应用如何（例如 ELISA、酶动力学、蛋白质印迹、蛋白质纯化和质谱分析），蛋白质定量对于生命科学实验室中的准确分析都至关重要。除了作为次要检测指标（即用于计算每单位质量蛋白质中分析物的相对水平）外，样品中的蛋白质含量本身也可能是研究的目标输出。例如，研究者可能关注食物资源中的蛋白质含量1 或在尿液中2. 目前有多种方法可用于测定样品中的蛋白质浓度3，包括直接紫外吸收读数4蛋白质-铜螯合5,6，蛋白质-染料结合比色测定法7以及蛋白质-染料结合荧光检测法8蛋白质定量的重要性体现在已有两篇论文描述了蛋白质测定方法5,7 被引频次最高的三大文献之一9,10尽管许多作者在引用时往往忽略实际引用原始文献，转而引用非原始参考文献或根本不引用任何文献，但描述Lowry蛋白质测定法和Bradford蛋白质测定法的原始论文数量却相当可观 >200,000 次引用 each10.

Bradford 法的广泛应用源于其经济性、操作简便、快速以及高灵敏度。该方法基于蛋白质与考马斯亮蓝 G 染料在酸性条件下的相互作用。在实验条件下（即低 pH 环境），该染料存在三种形式：最大吸收波长（λmax）位于 470 nm 的红色阳离子形式；λmax 位于 650 nm 的绿色中性形式；以及 λmax 位于 590 nm 的蓝色阴离子形式11,12（图 1）。在无蛋白质存在时，主要以阳离子形式存在。当蛋白质与染料结合后，会稳定蓝色阴离子形式，导致溶液颜色发生明显变化，由棕褐色变为蓝色。通常通过分光光度法定量测定染料蓝色形式浓度的变化，其在 590–595 nm 处的吸光度与样品中蛋白质含量成正比。

吸收光谱图；峰值位于 470、590、650 nm；光学研究结果；光谱分析。
图 1：Bradford 法测定条件下考马斯亮蓝 G 的吸收光谱。 三个主要峰分别用箭头标出，代表染料红色（470 nm）、绿色（650 nm）和蓝色（590 nm）形式的最大吸收波长（λmax）。光谱分别在无蛋白质（黄色线）、含有 3 µg（灰色线）和 10 µg（蓝色线）牛血清白蛋白的条件下记录。请点击此处查看该图的放大版本。

Bradford 法的广泛应用已暴露出若干局限性（例如，对不同蛋白质的响应差异11，以及脂质13和去垢剂7的干扰），并促使人们开发多种改进方法以提升其性能（例如，添加去垢剂14,15、碱化处理14,16，以及利用吸光度比值17）。除了对检测方法本身的改进外，已有研究报道使用智能手机或相机等替代设备来采集分析信号18,19,20。事实上，利用智能手机作为便携式化学分析仪的方法已成为一个活跃的研究领域。使用智能手机的动机源于这些设备价格低廉、便于携带、操作简便且广泛可用。

本文提供了一种利用智能手机作为分析设备的 RGBradford 法进行蛋白质定量的实验方案20。与原始的 RGBradford 方法20相比，本方案引入了一种简化颜色提取流程的操作步骤。该方法采用一款免费的软件应用程序，可自动从微孔板图像的每个孔中提取颜色信息，显著节省了时间和工作量。这取代了此前需借助图形编辑软件手动逐个获取各孔颜色数据的方法20。最终，可通过智能手机拍摄的微孔板图像中提取的颜色数据，实现对样品中蛋白质含量的定量分析。

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方案

1. 考马斯亮蓝蛋白测定试剂的制备

  1. 将 100 mg 考马斯亮蓝 G 溶解于 50 mL 95% (w/v) 乙醇中。搅拌至考马斯亮蓝 G 完全溶解。
    警告：乙醇易燃，并可引起眼部刺激。应远离火源，并佩戴护目镜。
  2. 向上述溶液中小心加入 100 mL 85% (w/v) 磷酸。
    警告：磷酸对金属具有腐蚀性，并可导致皮肤腐蚀、严重眼损伤及急性经口毒性。操作时须佩戴手套和护目镜。
  3. 将含有考马斯亮蓝 G、乙醇和磷酸的溶液缓慢加入 600 mL 去离子水中。
  4. 加水稀释至最终体积为 1,000 mL。可根据待分析样品数量按比例放大或缩小。根据原始方法7所述，工作浓度的 Bradford 试剂中各成分终浓度应为 0.01% (w/v) 考马斯亮蓝 G、4.7% (w/v) 乙醇和 8.5% (w/v) 磷酸。
  5. 通过滤纸（Whatman #1 滤纸或等效产品）过滤，去除任何不溶物。
  6. 该试剂在室温（RT）避光保存时可稳定数周。由于长期存放可能产生沉淀，必要时需重新过滤。
    ​注：也可购买市售的即用型或需稀释后使用的 Bradford 试剂。请按照生产商说明书配制试剂，并进入下一步操作。

2. 蛋白质标准溶液的制备

  1. 制备用作标准品的纯化蛋白的储备液（参见步骤 2.4）。一种经济且常用的标准蛋白是牛血清白蛋白（BSA）。其他可选标准蛋白包括卵清蛋白和牛γ球蛋白。
  2. 若已知所用标准蛋白的摩尔吸光系数，则可通过分光光度计检测储备液的浓度。
  3. 对于 BSA，常用的计算公式为 BSA (mg/mL) = (A280/6.6) × 10，其中 A280 是以适当空白对照（即 ε2801% = 6.6）在 280 nm 波长、1 cm 光程下测得的吸光度值7。例如，0.8 mg/mL 的 BSA 在 280 nm 处的吸光度为 0.528。
  4. 为绘制标准曲线，需配制一系列浓度介于 0.025 mg/mL 至 1.0 mg/mL 之间的 BSA 稀释液。当每孔加入 10 µL 样品体积时，每孔中的 BSA 含量将为 0.25–10 µg。
    注意：蛋白标准溶液应使用与样品制备所用介质相同组成（终浓度）的缓冲液进行配制。

3. 检测

  1. 将样品稀释至蛋白浓度处于标准曲线范围 0.025–1.0 mg/mL 内。在该范围内制备多个（至少 3 个）不同稀释度的样品。
    注意：可用磷酸盐缓冲液（PBS）或其他与 Bradford 试剂兼容的培养基/缓冲液成分稀释样品。标准品与样品之间培养基组分的最终浓度应保持一致。
  2. 向 96 孔微孔板的三个孔（即三个复孔）中各加入 10 µL 每种蛋白标准溶液。对于 0（零蛋白）点，加入 10 µL 用于配制标准溶液和样品稀释液的缓冲液/培养基。
  3. 向另一组孔中，向同一块 96 孔微孔板的三个孔（即三个复孔）中各加入 10 µL 每种样品稀释液。一种方法是加入不同体积的样品，并用培养基补足至每孔总体积为 10 µL（例如，分别加入 0.5 µL、1 µL、2 µL、4 µL 和 8 µL 样品，再分别加入 9.5 µL、9 µL、8 µL、6 µL 和 2 µL 培养基）。
  4. 向所有孔中加入 250 µL Bradford 蛋白检测试剂。典型的微孔板设置如 图 2 所示。本示例中包含一组空白孔，每孔加入 260 µL（每孔最终体积）水，用于在微孔板读数仪中作为空白对照（步骤 4.5）。仅当需要收集吸光度数据时才需设置此空白孔。
    注意：每次进行检测时，均应在与样品相同的微孔板中制备标准曲线。换言之，若样品数量需使用另一块微孔板，则应在第二块板中也制备另一条标准曲线，依此类推。
  5. 在 5–15 分钟内记录结果（第 4 节）。

样品检测用微孔板布局图；行 A-H，列 1-12；包含空白孔、标准品孔。
图 2：Bradford 蛋白测定法的典型微孔板布局。 “空白”（Blank）指含有 260 µL 水的三个孔，用于在微孔板读数仪中作为空白对照。“STD”指蛋白标准品。S1-S6 代表六个不同的样品。SX_1-SX_4 代表每个样品的四种不同稀释度。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 记录结果

  1. 在光线充足的房间内，用一只手将微孔板平行于实验台面，紧贴均匀的白色背景（例如一张白纸）。将气泡水平仪放置在微孔板上，以确保其准确对齐。
  2. 用另一只手将智能手机平行于实验台面和微孔板持稳（某些相机应用程序可有效显示设备的倾斜角度），并对整个微孔板拍摄一张或多张照片（图3）。在iOS设备中，通过在相机设置中启用网格选项来打开相机水平指示器；在Android设备中，通过在相机设置中启用构图提示选项来打开相机水平指示器。
  3. 无需特殊照明装置，但需注意避免阴影和反光。例如，避免智能手机遮挡微孔板或背景，也避免微孔板遮挡背景。孔区边缘出现的小反光无碍；每个孔中心极小区域即可提取颜色数据。
  4. 快速检查照片中背景的均匀性、是否存在阴影和反光。同时观察孔的角度；每个孔的中心应直接可见（即不被孔壁遮挡）。
  5. 若需比较微孔板吸光度读数与图像颜色数据，应在微孔板读板仪中于590 nm和450 nm波长下读取微孔板21。

ELISA检测微孔板实验；研究人员使用智能手机采集数据
图3：Bradford蛋白测定结果的采集。 在光线充足的环境中，用一只手将微孔板平行于实验台面放置在均匀背景前；另一只手将智能手机平行于实验台面和微孔板持握，以采集图像。 请点击此处查看该图的高清版本。

5. 提取颜色数据—自动方式

  1. 下载 ImageJ 和 ReadPlate22，ImageJ 插件可在 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/readplate/index.html 获取（此为 .txt 文件）。
  2. 打开 ImageJ，点击 插件 > 安装 并选择在步骤 6.1 中下载的文件。
  3. 单击以设置测量参数 分析 > 设置测量 并检查以下选项： 面积；标准差；最小值 & 最大灰度值；平均灰度值；众数灰度值在窗口底部，设置 重定向至：无 和 小数位数（0-9）：3.
  4. 前往 文件 > 打开 并选择第4步中拍摄的微孔板图片。
  5. 前往 插件 > ReadPlate. 阅读说明，然后点击 好的.
  6. 选择孔的数量： 96.
  7. 使用 矩形选择 工具由插件自动加载后，从 A1 孔中心开始至 H12 孔中心结束绘制一个矩形，然后单击 好的.
  8. 选择 蓝色 通道并点击 好的.
  9. 单击以确认默认参数 好的.
  10. 检查软件是否已划分出每个孔内的区域，并确认所选区域未覆盖存在异常阴影或反光的区域。单击 好的.
  11. 保存结果，并对绿色通道重复步骤 5.8-5.10。
  12. 使用每种颜色的众数计算蓝绿比值。
    注意：计算可手动完成，或使用读者偏好的软件进行，例如 R、Microsoft Excel 或 GraphPad Prism。

6. 手动提取颜色数据

  1. 下载 Inkscape，一款免费的开源图形编辑软件。
    注意：任何带有取色器工具（通常显示为滴管图标）的软件均可用于识别颜色并提取 RGB 数据。
  2. 打开 Inkscape，进入 文件 > 打开。 选择在 步骤 4 中拍摄的微孔板图像。
  3. 选择位于左上角、图标为箭头的选择与变换对象 (S)工具，然后点击图像。虚线边框将指示当前选中状态。
  4. 选择位于左侧、图标为滴管的从图像中选取颜色 (D)工具。
  5. 点击一个孔的中心位置。底部面板中的颜色（“填充：”）将相应改变。点击该颜色，右侧将弹出填充与描边选项卡。
  6. 将纯色下拉菜单更改为RGB。记录每个孔对应的蓝色和绿色通道的数值。
  7. 使用记录的数值计算蓝绿比值。
    ​注意：该计算可手动完成，也可使用研究者偏好的软件完成，例如 R、Microsoft Excel 或 GraphPad Prism。

7. 构建标准曲线并推算未知样本

  1. 以蛋白标准品浓度为横坐标，绘制平均绿色与蓝色荧光强度比值的函数曲线。
    注意：可手动绘图，或使用研究者偏好的软件（如 R、Microsoft Excel 或 GraphPad Prism）进行绘图。
  2. 计算每个样品及其稀释倍数的平均绿色与蓝色荧光强度比值。
  3. 检查样品所获得的信号是否位于蛋白标准曲线的线性范围内。
  4. 忽略低于或高于标准曲线最小值或最大值的任何数据点。
  5. 利用描述标准曲线的线性方程，外推计算样品中的蛋白含量，并将计算结果乘以相应的稀释倍数。

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结果

图4 是一张微孔板的图像，从中提取了颜色数据，并记录了 450 nm 和 590 nm 处的吸光度。此处报告的代表性 RGB 颜色数据是按照第 5 节所述方法自动获取的。典型的颜色数据模式表现为蓝色值升高，红色和绿色值降低（图5）。请注意，尽管所有孔中均存在明显的反光现象，且微孔板未完全对齐（图4），但从图像中提取的颜色数据仍能准确反映吸光度读数（图6）。此外，样品稀释倍数与吸光度读数及颜色数据之间均呈线性关系（图7）。在这些代表性结果中，使用了两个样品：BV-2 细胞裂解液（B001）和按前述方法制备的 Galleria mellonella 匀浆液（G001）20，每个孔分别加入 0.5 µL、1 µL、2 µL、4 µL 和 8 µL。加样后用缓冲液补足至 10 µL，再...

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讨论

本文介绍了RGBradford方法，该方法利用智能手机摄像头记录Bradford蛋白测定实验的数据，提取颜色信息，并准确量化生物样品中的蛋白质水平，其原理最近已有报道20。与原始RGBradford方法的一个不同之处在于，本研究采用了一种通过ImageJ插件自动获取颜色数据的流程22。RGBradford方法的主要创新在于使用RGB数据作为分析信号；因此，研究人员可继续使用实验室中常规的考马斯亮蓝G法测定蛋白质的实验方案，随后对该结果拍照并提取颜色数据。换句话说，本方案中的步骤1-3可根据特定实验室的常规操作流程进行调整。鉴于原始Bradford蛋白测定法已存在多种改良版本，研究者可选择最适合其样品类型和性质的方案进行实验，然后进入数据采集阶段。

本方案包含两个关键步骤：图像采集和颜色数据提取。此处以及先前的研究中20均未使用特殊照明设备，但仍获得了满意的结果（即吸光度读数结果与从图像中提取的颜色数据之间无显著差异）。尽管如此，使用者仍可选...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作由巴西国家科学技术发展委员会（CNPq，巴西）[资助号 428048/2018-8 和 402556/2022-4] 和巴西利亚大学（巴西）资助。 作者感谢杜阿尔特·努诺·卡瓦略博士和伊芙琳·桑托斯博士（i3s，葡萄牙波尔图）提供本研究中所使用的智能手机。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔平底聚苯乙烯微孔板 Jet Biofil，中国广州TCP011096任何可兼容光学读数的平底微孔板均可使用。 
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯A2153
考马斯亮蓝GSigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯B0770
乙醇
iPhone 11AppleMWM02BR/A可替换为配备摄像头的其他智能手机
iPhone 14 ProAppleN/A
磷酸Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯695017
Redmi Note 9 ProXIAOMI N/A
S22 UltraSamsung N/A
SpectraMax 384 Plus 微孔板读板仪Molecular Devices，美国加利福尼亚州圣何塞PLUS 384任何能够在450 nm和590 nm波长下读数的微孔板读板仪均可使用。此设备为可选；本方法的建立初衷正是为了消除对微孔板读板仪的依赖。

参考文献

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