一种用于评估表达靶向单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤能力的定量实验方案。该方案可作为筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中验证之前快速优化CAR铰链结构的实验。
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方法文章
快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
嵌合抗原受体（CAR）T细胞处于肿瘤学研究的前沿。CAR由一个靶向结构域（通常为单链可变区片段，scFv）、一个链内连接子、随后的铰链区、跨膜区以及共刺激结构域组成。链内连接子和铰链区的修饰可显著影响CAR介导的杀伤作用。考虑到CAR结构中每个部分均有多种不同的选择，其组合数量极为庞大。制备CAR-T细胞是一个耗时且昂贵的过程，构建和测试多种CAR结构需要投入大量时间和材料。本实验方案描述了一种在Jurkat细胞中快速评估铰链区优化型CAR结构的平台（CAR-J）。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞系，具有高效的慢病毒摄取能力，可实现CAR的高效转导。本文介绍了一种利用荧光成像仪快速评估CAR-J功能的平台，并进一步在PBMC来源的T细胞中验证其细胞溶解活性。
引言
CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已展现出巨大前景，美国国家癌症研究所报告称，自2017年以来已有6种CAR-T产品获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准1。目前还有众多针对实体瘤的CAR-T细胞疗法正处于临床试验阶段。设计新型CAR靶点并优化CAR结构对CAR-T细胞的疗效至关重要。针对不同应用选择理想的CAR结构，对于准确靶向肿瘤相关抗原（TAA）同时避免正常组织中低水平TAA表达所导致的脱靶效应具有重要意义2。
CAR 结构主要由五个部分组成：（1）靶向肿瘤抗原的胞外单链可变区片段（scFv）结构域；（2）铰链区；（3）跨膜结构域；（4）胞内T细胞共刺激结构域；（5）信号传导结构域。对这些结构域中的任何一个进行修饰，均会影响CAR-T细胞与靶细胞相互作用的精确性3因此，评估这些CAR结构的细胞毒性和交叉反应性 体外 选择合适的构建体对于推进研究至关重要 体内 实验。目前评估T细胞溶解作用的方法包括 51铬释放试验、乳酸脱氢酶释放试验、生物发光成像试验、基于实时阻抗的细胞分析以及基于细胞的流式细胞术试验4,5基于荧光成像的检测平台可直接计数活细胞与死细....
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方案
注意：所有细胞培养操作均须在生物安全柜中进行，并穿戴实验服、手套，遵循标准的无菌技术。
1. 生成表达CAR的Jurkat细胞（CAR-J）
- 从 ATCC 购买 Jurkat 细胞（克隆株 E6-1）。在 T-75 培养瓶中复苏 1 × 106 个细胞，并在 T-75 培养瓶中进行培养。使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中维持细胞悬浮状态，密度为 0.6 × 106 个细胞/mL。
- 将 Jurkat 细胞以每孔 1 × 105 个细胞接种于经组织培养处理的 24 孔板中，每孔加入含 4 µg/mL 多聚凝集素（polybrene）的 RPMI 生长培养基 500 µL，以提高慢病毒转导效率。使用基于激光的荧光检测台式细胞分析仪计数细胞。所需孔数取决于待评估的构建体数量。本示例将使用 4 种构建体及一个未转导对照组。CAR 构建体设计见表 1。
- 每孔加入 10 µL 各 CAR 构建体对应的慢病毒。CAR 构建体设计及慢病毒制备方法如前所述12。
- 次日，向每孔加入 1 m....
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结果
在72小时评估了CAR-J1对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞表面EGFR靶向作用的E:T比范围（1:8至8:1）。如步骤2所述，使用含polybrene的CAR慢病毒转导Jurkat细胞以生成CAR-J细胞。CAR-J1的细胞毒性随E:T比升高而显著增强，在1:8比例下杀伤效果无明显差异（图1）。在4:1的E:T比下，72小时内观察到超过50%的肿瘤细胞被杀伤。后续实验采用该E:T比，并将作用时间缩短至48小时，以便快速评估多种CAR结构的细胞毒性。设计了铰链区修饰的靶向EGFR的CAR结构（Table 1）。所使用的4种不同铰链分别为IgG长型、IgG中型、IgG短型和CD8α，如文献13所述。这3种结构在Jurkat细胞中表达，并通过流式细胞术检测Flag标签阳性细胞比例来确定CAR表达水平（图2A-D），方法见文献12。未转导的Jurkat细胞作.......
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讨论
本文提出了一种快速、高效评估CAR在Jurkat细胞中表达所诱导的靶标特异性细胞溶解活性的方法。所有CAR构建体均含有相同的scFv，但铰链区和跨膜区不同，而这些区域已被证明会影响CAR-T细胞的效力13。为进一步评估这些CAR-J细胞的非特异性杀伤作用，将其与抗原敲除（KO）细胞共培养。结果表明，细胞杀伤作用具有肿瘤抗原特异性，而非由CAR-J的本底激活所致。通过该方法可轻松确定不同效靶比（E:T）下的细胞毒潜力，从而明确在特定时间点清除肿瘤细胞所需的最少效应细胞数量。此外，还可使用同一种或不同癌症类型的多种细胞系以及正常细胞，以评估这些构建体的特异性。在CAR-J平台中筛选出的最具活性的候选分子，可进一步通过在PBMC来源的CD3+ T细胞中表达CAR，并进行类似的杀伤实验，同时检测其在接触抗原阳性与阴性肿瘤细胞后的耗竭和活化状态，从而完成深入表征。
需要注意的是，Jurkat 细胞是 CD4+ 细胞，其 T 细胞受体（TCR）信号通路发生改变15。因此，CAR 结构的胞内信号结构域.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
MDA-MB-231 细胞系由 Shane Stecklein 博士惠赠。作者感谢堪萨斯大学癌症中心为开展本研究提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 15 mL 圆锥形离心管（无菌） | Midwest Scientific | #C15B | 任何类似产品均可使用 |
| 50 mL 圆锥形离心管（无菌） | Thermo Scientific | 339652 | 任何类似产品均可使用 |
| 黑色/透明 96 孔板 | Falcon | 353219 | Celligo 提供兼容孔板列表 |
| Celigo 四通道成像细胞仪 | Nexcelcom Bioscience | 200-BFFL-5C | 任何类似产品均可使用 |
| Celigo 软件 | Nexcelcom Bioscience | 版本 5.3.0.0 | 任何类似产品均可使用 |
| 细胞培养孵育箱 | Thermo Scientific | HeraCell 160i | 任何类似产品均可使用 |
| 细胞培养处理烧瓶（T75，多种规格，无菌） | TPP | 90076 | 任何类似产品均可使用 |
| CFSE | Tonbo | 13-0850-U500 | 任何类似产品均可使用 |
| Cytek Muse 细胞分析仪 | Cytek | 0500-3115 | 任何类似产品均可使用 |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | 任何类似产品均可使用 |
| FBS | Gemini bio-products | 900-108 | 任何类似产品均可使用 |
| 流式细胞仪 | Cytek, BD 等 | Aurora, LSR II 等 | 任何类似产品均可使用 |
| FlowJo 软件 | Becton Dickinson & Company | 版本 10.7.1 | 任何类似产品均可使用 |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | 任何类似产品均可使用 |
| GraphPad 软件 | GraphPad | 版本 9.3.1 (471) | 任何类似产品均可使用 |
| 多通道移液器 | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | 任何类似产品均可使用 |
| PBS | Gibco | 10010-031 | 任何类似产品均可使用 |
| 青霉素-链霉素溶液（PenStrep） | Gibco | 15070-063 | 任何类似产品均可使用 |
| 移液器吸头（无菌，带滤芯，1 mL，多种规格） | Pr1ma | PR-1250RK-FL 等 | 任何类似产品均可使用 |
| 移液器 | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | 任何类似产品均可使用 |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P1304MP | 任何类似产品均可使用 |
| RPMI 培养基 | Corning | 10-041-cv | 任何类似产品均可使用 |
| 血清移液管辅助器 | Drummond Scientific | 4-000-105 | 任何类似产品均可使用 |
| 血清移液管（无菌，多种规格） | Pr1ma | PR-SERO-25 等 | 任何类似产品均可使用 |
| 丙酮酸钠 | Corning | 25-000-CI | 任何类似产品均可使用 |
| 无菌储液槽 | Midwest Scientific | RESE-2000 | 任何类似产品均可使用 |
| 台式离心机 | Eppendorf | 5810R | 任何类似产品均可使用 |
参考文献
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....
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