快速 体外 使用荧光成像法评估表达嵌合抗原受体的Jurkat细胞的细胞毒性

摘要

一种用于评估表达靶向单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤能力的定量实验方案。该方案可作为筛选平台，用于在外周血来源的T细胞中验证之前快速优化CAR铰链结构的实验。

摘要

嵌合抗原受体（CAR）T细胞处于肿瘤学研究的前沿。CAR由一个靶向结构域（通常为单链可变区片段，scFv）、一个链内连接子、随后的铰链区、跨膜区以及共刺激结构域组成。链内连接子和铰链区的修饰可显著影响CAR介导的杀伤作用。考虑到CAR结构中每个部分均有多种不同的选择，其组合数量极为庞大。制备CAR-T细胞是一个耗时且昂贵的过程，构建和测试多种CAR结构需要投入大量时间和材料。本实验方案描述了一种在Jurkat细胞中快速评估铰链区优化型CAR结构的平台（CAR-J）。Jurkat细胞是一种永生化的T细胞系，具有高效的慢病毒摄取能力，可实现CAR的高效转导。本文介绍了一种利用荧光成像仪快速评估CAR-J功能的平台，并进一步在PBMC来源的T细胞中验证其细胞溶解活性。

引言

CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中已展现出巨大前景，美国国家癌症研究所报告称，自2017年以来已有6种CAR-T产品获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准¹。目前还有众多针对实体瘤的CAR-T细胞疗法正处于临床试验阶段。设计新型CAR靶点并优化CAR结构对CAR-T细胞的疗效至关重要。针对不同应用选择理想的CAR结构，对于准确靶向肿瘤相关抗原（TAA）同时避免正常组织中低水平TAA表达所导致的脱靶效应具有重要意义²。

CAR 结构主要由五个部分组成：（1）靶向肿瘤抗原的胞外单链可变区片段（scFv）结构域；（2）铰链区；（3）跨膜结构域；（4）胞内T细胞共刺激结构域；（5）信号传导结构域。对这些结构域中的任何一个进行修饰，均会影响CAR-T细胞与靶细胞相互作用的精确性³因此，评估这些CAR结构的细胞毒性和交叉反应性 体外 选择合适的构建体对于推进研究至关重要 体内 实验。目前评估T细胞溶解作用的方法包括 ⁵¹铬释放试验、乳酸脱氢酶释放试验、生物发光成像试验、基于实时阻抗的细胞分析以及基于细胞的流式细胞术试验^4,5基于荧光成像的检测平台可直接计数活细胞与死细胞的数量，从而直接定量T细胞的细胞毒作用，而非采用间接方法评估T细胞的细胞毒活性。

本研究介绍了一种简便、低成本、快速且高通量的技术，可最小化人为干预，用于评估表达表皮生长因子受体（EGFR）嵌合抗原受体（CAR）的Jurkat细胞对MDA-MB-231三阴性乳腺癌（TNBC）细胞及EGFR CRISPR敲除的MDA-MB-231细胞的细胞毒性。Jurkat细胞是一种永生化的人T淋巴细胞⁶，已被广泛用于T细胞活化和信号转导机制的研究⁷。此外，Jurkat细胞已在多项研究中被用于体外（in vitro）CAR功能检测^8,9,10,11。Jurkat细胞易于被慢病毒转导，并具有持续增殖能力，本研究利用该系统优化了多种EGFR CAR结构中的铰链区结构域。

该检测可用于筛选靶向多种肿瘤抗原的多个CAR结构，并可用于针对多种贴壁肿瘤细胞系以及不同效应细胞与肿瘤细胞（E:T）比例的实验。此外，可评估多个时间点，并可调整重复次数，以在不同CAR结构中鉴定出最佳杀伤效果。最佳CAR结构需通过外周血单个核细胞（PBMCs）来源的CD3 T细胞进行验证。开发该方法的总体目标是以高通量方式快速优化CAR铰链区结构，克服诸如转导效率低等技术障碍，随后在PBMC来源的T细胞中进行确认。

方案

注意：所有细胞培养操作均须在生物安全柜中进行，并穿戴实验服、手套，遵循标准的无菌技术。

1. 生成表达CAR的Jurkat细胞（CAR-J）

1. 从 ATCC 购买 Jurkat 细胞（克隆株 E6-1）。在 T-75 培养瓶中复苏 1 × 10⁶ 个细胞，并在 T-75 培养瓶中进行培养。使用添加 10% 胎牛血清（FBS）的 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）培养基，在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中维持细胞悬浮状态，密度为 0.6 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 将 Jurkat 细胞以每孔 1 × 10⁵ 个细胞接种于经组织培养处理的 24 孔板中，每孔加入含 4 µg/mL 多聚凝集素（polybrene）的 RPMI 生长培养基 500 µL，以提高慢病毒转导效率。使用基于激光的荧光检测台式细胞分析仪计数细胞。所需孔数取决于待评估的构建体数量。本示例将使用 4 种构建体及一个未转导对照组。CAR 构建体设计见表 1。
3. 每孔加入 10 µL 各 CAR 构建体对应的慢病毒。CAR 构建体设计及慢病毒制备方法如前所述¹²。
4. 次日，向每孔加入 1 mL RPMI 生长培养基，并继续在 37 °C、5% CO₂ 的培养箱中培养。
5. 两天后收集细胞（Jurkat 细胞转导后共 72 小时），并进行计数。
6. 取 1 × 10⁴ 个细胞用于流式分析，以确认 Jurkat 细胞表面 CAR 的表达。简要步骤如下：先用 FACS 染色液（FSS）洗涤细胞两次，然后在 4 °C 避光条件下，用针对 Flag 标签的抗体对 CAR-J 进行染色 30 分钟，以检测 CAR 阳性率。再次用 FSS 洗涤两次，随后按照先前描述的方法¹²通过流式细胞仪检测细胞。抗体使用浓度应遵循生产商推荐。
7. Jurkat 细胞易于转导，几乎总是表现出>90% 的 CAR 表达。建议在共培养细胞毒性实验前较早时间制备 CAR-J，并冻存以备后续使用。

2. 铺板CFSE标记的肿瘤细胞

注意：MDA-MB-231 细胞（来自 ATCC，HTB-26）由合作者惠赠，EGFR 基因敲除的 MDA-MB-231 细胞系的构建方法如前所述¹²。

1. 在T-75培养瓶中复苏1 × 10⁶个细胞，并在T-75培养瓶中进行培养。将MDA-MB-231肿瘤细胞及CRISPR EGFR基因敲除（KO）MDA-MB-231肿瘤细胞培养于含10%胎牛血清（FBS）的14 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养，当细胞融合度约为70%时进行传代。
2. 在普通明场显微镜下观察贴壁生长的肿瘤细胞，确保细胞融合度接近70%。
3. 使用血清移液管从培养瓶中移除培养基。向T75培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育3–5分钟，使细胞从瓶壁脱落。
4. 加入等体积（3 mL）的完全培养基以中和胰蛋白酶。将细胞悬液收集至离心管中，在400 × g条件下离心4分钟，使细胞沉淀。
5. 用移液器弃去上清液，将细胞重悬于2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用细胞计数仪测定细胞浓度。
6. 取8 × 10⁵个细胞转移至另一支15 mL离心管中，并加入PBS至终体积为1 mL。
7. 向每管中加入2 µL羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE；储存浓度为5 µM），使用1 mL移液器充分混匀。
8. 将细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中与CFSE共同孵育20分钟。20分钟后从培养箱中取出离心管，向每管中加入5 mL完全培养基。
9. 在400 × g条件下离心4分钟，使CFSE标记的细胞沉淀。用移液器弃去上清液，加入1 mL新鲜培养基重悬细胞。
10. 使用细胞计数仪重新测定细胞浓度。取4 × 10⁵个细胞转移至25 mL试剂储液槽中，并加入培养基至总体积为8 mL。
    1. 为确保能够以100 µL培养基接种5000个肿瘤细胞/孔，并满足多通道移液器操作所需的液体体积，同时补偿步骤1.7中可能的细胞损失，建议额外准备10%–20%的细胞和培养基体积。
11. 使用5 mL血清移液管充分混匀细胞悬液。使用100 µL多通道移液器，将100 µL细胞悬液加入左侧半区透明平底黑色96孔板的每一行孔中。可参考表2中的示例加样策略。
12. 以相同方式将EGFR基因敲除细胞加样至96孔板的右侧半区。加样完成后，在生物安全柜操作台面上前后、左右轻摇培养板，确保肿瘤细胞在各孔中均匀分布。
13. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育4小时，使肿瘤细胞充分贴壁。

3. 将表达CAR的Jurkat细胞与CFSE标记的肿瘤细胞共培养

1. 根据未转导和表达CAR的Jurkat细胞计数，将每种CAR-J细胞各4 × 10⁵个转移至25 mL储液槽中。加入DMEM培养基，使总体积为2 mL。
2. 对于效靶比（E:T）为4:1的条件，使用多通道移液器将2 × 10⁴个CAR-J细胞沿每孔侧壁轻轻加入含培养基的孔中，总体积为100 µL，避免扰动已贴壁的肿瘤细胞。
3. 使用多通道移液器向含有肿瘤细胞和Jurkat细胞的孔中再沿侧壁加入100 µL培养基。仅含肿瘤细胞的对照组孔中加入200 µL培养基，使所有孔中培养基总体积均为300 µL。
4. 在平台上前后左右轻缓拖动培养板，以确保Jurkat细胞在肿瘤细胞上均匀分布。
5. 将共培养体系置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育48小时。

4. 成像用培养板的制备

1. 根据孔数及每孔加入100 µL培养基的需要，用低自发荧光培养基配制浓度为1 µg/mL的碘化丙啶（PI）溶液。
2. 对于84个孔，准备含有PI的9 mL培养基，并用移液器充分混匀。
3. 通过将Triton-X用去离子水稀释，配制10 mL的20% Triton-X溶液。共培养48小时后，将含有CAR-J的上清液通过将培养板倒置一次并轻敲纸巾的方式弃去。
4. 使用多通道移液器，向每孔中轻柔加入100 µL上述已配制的含PI培养基（步骤4.2），避免扰动贴壁的肿瘤细胞。
5. 向每种肿瘤类型的第一个孔中加入20 µL的20% Triton-X溶液，作为完全裂解死亡对照。
6. 将培养板置于培养箱中孵育20分钟，然后使用荧光成像细胞仪对培养板进行成像。数据将存储在计算机中，可供后续分析。

5. 分析荧光图像

1. 使用其中一个仅含肿瘤细胞的孔来设置绿色荧光通道。
2. 将孔的掩模缩小至98%，以去除孔边缘的细胞，因为边缘处的信号不完整。
3. 在绿色荧光CFSE通道中识别CFSE标记的肿瘤细胞。调整荧光强度阈值，确保识别孔内所有细胞。
4. 将最小细胞直径设为25 µm，以去除CFSE通道中检测到的任何碎片。该数值根据所分析的细胞类型而有所不同。
5. 启用 分离接触物体 功能，以便在细胞相互接触时仍能识别单个细胞。
6. 在图像显示中选择 CFSE，并查看图形叠加，以确定系统正在识别的内容。
7. 当CFSE标记的细胞被正确识别后，设置门控以区分活细胞与死细胞群体。
8. 选中CFSE标记的细胞，生成一个直方图，y轴为计数，x轴为平均PI荧光强度。
9. 根据添加了Triton-X的孔（步骤4.5），绘制分割线以区分低PI染色与高PI染色的细胞。该孔中的大多数细胞应位于高PI染色区域。
   注意：活细胞中PI存在基础信号。因此，加入Triton-X可杀死所有细胞，使其在红色荧光通道中强烈染色，从而有助于设置门控以区分死细胞与活细胞。
10. 调整x轴数值，以便更清晰地观察细胞。现在将低PI染色的细胞标记为活细胞。
11. 选中活细胞，设置另一个直方图，x轴为细胞面积，y轴为计数。
12. 利用仅含肿瘤细胞的孔绘制另一条分割线，以捕获细胞并排除碎片。Jurkat处理孔将开始积累CFSE染色的碎片，需从计数中去除。剩余的非碎片部分标记为“Big cells"。
13. 对整块板运行分析，并导出包含数据的电子表格。
14. 绘制“Big counts”图表，以确定经CAR-J处理后孔中残留的活CFSE标记肿瘤细胞数量。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析。

结果

在72小时评估了CAR-J1对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞表面EGFR靶向作用的E:T比范围（1:8至8:1）。如步骤2所述，使用含polybrene的CAR慢病毒转导Jurkat细胞以生成CAR-J细胞。CAR-J1的细胞毒性随E:T比升高而显著增强，在1:8比例下杀伤效果无明显差异（图1）。在4:1的E:T比下，72小时内观察到超过50%的肿瘤细胞被杀伤。后续实验采用该E:T比，并将作用时间缩短至48小时，以便快速评估多种CAR结构的细胞毒性。设计了铰链区修饰的靶向EGFR的CAR结构（Table 1）。所使用的4种不同铰链分别为IgG长型、IgG中型、IgG短型和CD8α，如文献¹³所述。这3种结构在Jurkat细胞中表达，并通过流式细胞术检测Flag标签阳性细胞比例来确定CAR表达水平（图2A-D），方法见文献¹²。未转导的Jurkat细胞作...

讨论

本文提出了一种快速、高效评估CAR在Jurkat细胞中表达所诱导的靶标特异性细胞溶解活性的方法。所有CAR构建体均含有相同的scFv，但铰链区和跨膜区不同，而这些区域已被证明会影响CAR-T细胞的效力¹³。为进一步评估这些CAR-J细胞的非特异性杀伤作用，将其与抗原敲除（KO）细胞共培养。结果表明，细胞杀伤作用具有肿瘤抗原特异性，而非由CAR-J的本底激活所致。通过该方法可轻松确定不同效靶比（E:T）下的细胞毒潜力，从而明确在特定时间点清除肿瘤细胞所需的最少效应细胞数量。此外，还可使用同一种或不同癌症类型的多种细胞系以及正常细胞，以评估这些构建体的特异性。在CAR-J平台中筛选出的最具活性的候选分子，可进一步通过在PBMC来源的CD3+ T细胞中表达CAR，并进行类似的杀伤实验，同时检测其在接触抗原阳性与阴性肿瘤细胞后的耗竭和活化状态，从而完成深入表征。

需要注意的是，Jurkat 细胞是 CD4+ 细胞，其 T 细胞受体（TCR）信号通路发生改变¹⁵。因此，CAR 结构的胞内信号结构域...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 圆锥形离心管（无菌）	Midwest Scientific	#C15B	任何类似产品均可使用
50 mL 圆锥形离心管（无菌）	Thermo Scientific	339652	任何类似产品均可使用
黑色/透明 96 孔板	Falcon	353219	Celligo 提供兼容孔板列表
Celigo 四通道成像细胞仪	Nexcelcom Bioscience	200-BFFL-5C	任何类似产品均可使用
Celigo 软件	Nexcelcom Bioscience	版本 5.3.0.0	任何类似产品均可使用
细胞培养孵育箱	Thermo Scientific	HeraCell 160i	任何类似产品均可使用
细胞培养处理烧瓶（T75，多种规格，无菌）	TPP	90076	任何类似产品均可使用
CFSE	Tonbo	13-0850-U500	任何类似产品均可使用
Cytek Muse 细胞分析仪	Cytek	0500-3115	任何类似产品均可使用
DMEM	Gibco	11995-040	任何类似产品均可使用
FBS	Gemini bio-products	900-108	任何类似产品均可使用
流式细胞仪	Cytek, BD 等	Aurora, LSR II 等	任何类似产品均可使用
FlowJo 软件	Becton Dickinson & Company	版本 10.7.1	任何类似产品均可使用
Fluorobrite DMEM	Gibco	A18967-01	任何类似产品均可使用
GraphPad 软件	GraphPad	版本 9.3.1 (471)	任何类似产品均可使用
多通道移液器	Thermo Scientific	Finnpipette F2	任何类似产品均可使用
PBS	Gibco	10010-031	任何类似产品均可使用
青霉素-链霉素溶液（PenStrep）	Gibco	15070-063	任何类似产品均可使用
移液器吸头（无菌，带滤芯，1 mL，多种规格）	Pr1ma	PR-1250RK-FL 等	任何类似产品均可使用
移液器	Thermo Scientific	Finnpipette F2	任何类似产品均可使用
碘化丙啶	Invitrogen	P1304MP	任何类似产品均可使用
RPMI 培养基	Corning	10-041-cv	任何类似产品均可使用
血清移液管辅助器	Drummond Scientific	4-000-105	任何类似产品均可使用
血清移液管（无菌，多种规格）	Pr1ma	PR-SERO-25 等	任何类似产品均可使用
丙酮酸钠	Corning	25-000-CI	任何类似产品均可使用
无菌储液槽	Midwest Scientific	RESE-2000	任何类似产品均可使用
台式离心机	Eppendorf	5810R	任何类似产品均可使用