本文介绍了一种扩增子宏基因组学实验方案，用于分析特拉米内葡萄、发酵葡萄及成品葡萄酒中的细菌群落组成。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
测序技术的进步以及生物信息学工具在微生物群落结构分析中的相对便捷获取，促进了人们对葡萄和葡萄酒中可培养与不可培养微生物的更深入理解。在工业发酵过程中，已知和未知的微生物常常影响产品的形成以及产生异味。因此，对从葡萄到葡萄酒中细菌的群落结构进行分析，有助于清晰了解 原位 微生物动态。本研究对发酵过程中的特拉米内特葡萄汁及其最终葡萄酒中的细菌进行了DNA提取，提取浓度为15 ng/µL至87 ng/µL。对V4高变区的16S扩增子进行测序，结果显示相对丰度较高的细菌门类包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、梭杆菌门（Fusobacteriota），其次为疣微菌门（Verrucomicrobiota）、盐杆菌门（Halobacterota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、黏球菌门（Myxococcota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）。通过对操作分类单元（OTU）的共有性进行Venn图分析，发现共有15个细菌门类存在于葡萄汁、发酵阶段及最终葡萄酒中。通过16S扩增子测序检测到此前未见报道的细菌门类，以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）等属。测试了葡萄酒中有机营养物质利用的差异及其对细菌的影响；特拉米内特 R 含有 Fermaid O 和 Traminette 的容器 L 用长相思（Sauvignon blanc）和 Fermaid O 刺激后，通过Kruskal-Wallis检验分析α多样性以确定均匀度。β多样性显示，在发酵阶段，两种处理间的细菌群落结构发生改变，而最终葡萄酒中的细菌群落结构则趋于相似。该研究证实，16S扩增子测序可用于监测葡萄酒生产过程中细菌群落的变化，从而支持产品质量控制，并更有效地利用葡萄来源的细菌。
引言
Traminette 葡萄以生产高品质葡萄酒为特征，同时具有可观的产量以及对多种真菌感染的部分抗性1,2,3。葡萄的自然发酵依赖于相关的微生物、酿酒环境以及发酵容器4,5。许多酒厂通常依赖野生酵母和细菌进行发酵，以产生酒精、酯类，并促进香气和风味的形成6。
本研究旨在分析葡萄中的细菌组成，并监测其在发酵过程中的动态变化。尽管现代酿酒中普遍采用如Saccharomyces cerevisiae等起始菌种进行主发酵（即酒精生成阶段），且该方法广泛应用于不同类型的葡萄酒酿造7。此外，苹果酸在次级发酵过程中被Oenococcus oeni脱羧转化为乳酸，这一过程可改善葡萄酒的感官特性与风味特征，并降低其酸度8,9。随着非培养依赖性分析技术的最新进展，目前已能够鉴定与酿酒葡萄相关联的多种微生物，以及在不同发酵阶段从葡萄汁传递至最终产品中的微....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 实验性葡萄酒生产
- 从位于北卡罗来纳州琼斯维尔的 Dynamis Estate 葡萄园获取 Traminnette 葡萄，去梗并压榨以释放葡萄汁，分别注入两个 600 L 的敞口发酵罐中，盖上盖子，使葡萄汁与果皮接触约 4 天。
- 每天进行一次压帽操作，将果皮压入汁液中以保持湿润，并减少挥发性酸（VA）的生成。
注：由于大部分芳香前体物质（单萜类化合物）位于果皮中，使葡萄汁与果皮保持接触可增强葡萄酒的芳香潜力。 - 4 天后，接种 Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23（Lallemand）。选择该酵母菌株是因为其具有强发酵能力，并有助于增强葡萄酒中源自葡萄的品种特性。
- 在其中一个发酵罐 Traminette R 中，当糖度达到 17.7 时添加 20 g/hL Fermaid O，并在糖度降至 13.1 g/hL 时再次添加 20 g/hL Fermaid O 和 12.5 g/hL Fermaid K，以确保发酵稳定性；而在另一个发酵罐 Traminette L 中，当糖度为 17.1 时添加 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc，并在糖度降至 13.4 时添加 20 g/hL Fermaid O，以增强葡萄酒的品种特性。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
首先测定了从葡萄汁、发酵酒液及成品酒中提取的DNA的数量和质量，其数量范围为15-87 ng/µL（表1）。
测序与生物信息学分析
Illumina 高通量测序仪生成的 FASTQ 文件被导入 Nephele 平台，并在 QIIME 2 平台上进行查看26。首先，使用 FastQC 软件评估序列质量。随后，对序列的 5'-和 3'-端进行修剪，以去除低质量的核苷酸，接着进行去噪、序列合并，并去除嵌合序列，最后利用 DADA2 去噪器将序列聚类为 OTU（物种的操作性定义）23。使用 SILVA v138.1 数据库将序列比对至细菌分类单元。根据 99% 的核苷酸序列相似性将序列聚类为 OTU。图 1展示了 OTU 的 DADA2 稀疏曲线，曲线已趋于平缓，表明测序深度已足够覆盖大多数微生物多样性。对序列进行的重复分析未产生显著差异。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
宏基因组学实验方案从葡萄汁的采样开始，随后在酵母加入葡萄汁后，采集发酵中的葡萄酒以及最终成品酒样品。接着对这些样品进行了两轮重复的DNA提取，并成功获得了DNA。提取所得DNA的浓度在15 ng/µL至87 ng/µL之间不等。这表明该DNA提取方案适用于葡萄酒宏基因组学研究。尽管DNA在A260/A280处的纯度存在差异，但这种变化可能归因于多种影响提取效果的因素，例如酒精浓度以及发酵过程中和发酵后产生的其他代谢产物，以及其他可能抑制基因组提取的有机植物成分。先前的研究已报道过类似关于宏基因组植物材料的观察结果27。然而，本方案中提取的DNA数量足以满足后续分析步骤的要求。宏基因组学研究所需的PCR条形码构建，尤其是使用Illumina测序平台时，要求最低DNA量为1 ng/µL。本研究对V4区进行了测序，而细菌多样性分析需依赖16S rRNA基因测序；该基因包含从V1到V9的多个可变区23。从不同样品提取的DNA共获得6,393,443条双端序列读长，平均每组样本产生399590.1875 ± 138442.6148条序列。V4区被广泛使.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢阿巴拉契亚州立大学研究委员会（URC）资助项目以及巴西高等教育人员提升协调机构（CAPES）Print Travel 奖学金对 FAO 访问巴西圣保罗州里贝朗普雷图圣保罗大学的支持。 本研究部分由巴西高等教育人员提升协调机构（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil，CAPES）资助，资助代码 001。ECPDM 感谢 CAPES Print Travel 奖学金对其访问阿巴拉契亚州立大学的支持。ECPDM 是巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil，CNPq）2 级研究学者。....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖凝胶 | Promega，美国威斯康星州麦迪逊市 | V3121 | 电泳 |
| FastPrep 土壤DNA离心柱试剂盒 | MP Biomedicals，Solon，OH，美国 | 116560-200 | DNA 提取 |
| FastQC 软件 | 英国巴布拉汉研究所 | 生物信息学 | |
| Fermaid O | Scott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马 | 发酵 | |
| 高保真 PCR 预混液 | 美国新英格兰生物实验室 | F630S | 用于测序的聚合酶链式反应 |
| NEBNext Ultra | 美国新英格兰生物实验室 | NEB #E7103 | DNA文库构建 |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥 美国 | DNA测序 | |
| NovaSeq 控制软件（NVCS） | Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥 美国 | DNA测序 | |
| Novaseq6000 平台 | Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥 美国 | DNA测序 | |
| QuiBit | 美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司 | DNA 定量 | |
| Quickdrop分光光度计 | Molecular device，美国加利福尼亚州圣何塞 | DNA 定量 | |
| 磷酸钠 | Sigma Aldrich | 342483 | DNA提取缓冲液 |
| Stimula 长相思白葡萄酒 | Scott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马 | 发酵 |
参考文献
- Skinkis, P. A., Bordelon, B. P., Wood, K. V. Comparison of monoterpene constituents in traminette, gewürztraminer, and riesling winegrapes. American Journal of Enology and Viticulture. 59, 440-445 (2008).
- Bordelon, B. P., Skinkis, P. A., Howard, P. H.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
