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方法文章

利用宏基因组扩增子测序分析葡萄酒酿造过程中发酵中的特拉米内特葡萄的细菌群落

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DOI：

10.3791/65598

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2023年12月1日

 ,  ,  ,  , 
1A.R. Smith Department of Chemistry and Fermentation Sciences, Appalachian State University, 2Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo

本文内容

摘要

本文介绍了一种扩增子宏基因组学实验方案，用于分析特拉米内葡萄、发酵葡萄及成品葡萄酒中的细菌群落组成。

摘要

测序技术的进步以及生物信息学工具在微生物群落结构分析中的相对便捷获取，促进了人们对葡萄和葡萄酒中可培养与不可培养微生物的更深入理解。在工业发酵过程中，已知和未知的微生物常常影响产品的形成以及产生异味。因此，对从葡萄到葡萄酒中细菌的群落结构进行分析，有助于清晰了解 原位 微生物动态。本研究对发酵过程中的特拉米内特葡萄汁及其最终葡萄酒中的细菌进行了DNA提取，提取浓度为15 ng/µL至87 ng/µL。对V4高变区的16S扩增子进行测序，结果显示相对丰度较高的细菌门类包括变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、梭杆菌门（Fusobacteriota），其次为疣微菌门（Verrucomicrobiota）、盐杆菌门（Halobacterota）、脱硫杆菌门（Desulfobacterota）、黏球菌门（Myxococcota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）。通过对操作分类单元（OTU）的共有性进行Venn图分析，发现共有15个细菌门类存在于葡萄汁、发酵阶段及最终葡萄酒中。通过16S扩增子测序检测到此前未见报道的细菌门类，以及肠杆菌科（Enterobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）等属。测试了葡萄酒中有机营养物质利用的差异及其对细菌的影响；特拉米内特 R 含有 Fermaid O 和 Traminette 的容器 L 用长相思（Sauvignon blanc）和 Fermaid O 刺激后，通过Kruskal-Wallis检验分析α多样性以确定均匀度。β多样性显示，在发酵阶段，两种处理间的细菌群落结构发生改变，而最终葡萄酒中的细菌群落结构则趋于相似。该研究证实，16S扩增子测序可用于监测葡萄酒生产过程中细菌群落的变化，从而支持产品质量控制，并更有效地利用葡萄来源的细菌。

引言

Traminette 葡萄以生产高品质葡萄酒为特征，同时具有可观的产量以及对多种真菌感染的部分抗性1,2,3。葡萄的自然发酵依赖于相关的微生物、酿酒环境以及发酵容器4,5。许多酒厂通常依赖野生酵母和细菌进行发酵，以产生酒精、酯类，并促进香气和风味的形成6。

本研究旨在分析葡萄中的细菌组成，并监测其在发酵过程中的动态变化。尽管现代酿酒中普遍采用如Saccharomyces cerevisiae等起始菌种进行主发酵（即酒精生成阶段），且该方法广泛应用于不同类型的葡萄酒酿造7。此外，苹果酸在次级发酵过程中被Oenococcus oeni脱羧转化为乳酸，这一过程可改善葡萄酒的感官特性与风味特征，并降低其酸度8,9。随着非培养依赖性分析技术的最新进展，目前已能够鉴定与酿酒葡萄相关联的多种微生物，以及在不同发酵阶段从葡萄汁传递至最终产品中的微生物种类10。

不同葡萄中野生细菌在葡萄酒发酵过程中转移至葡萄汁后的角色与动态变化尚不明确。许多这类细菌的分类学地位甚至尚未确定，或其表型特性未被表征，这导致它们在共培养发酵中的应用仍远未得到充分开发。然而，基于微生物培养的分析方法已被用于确定与葡萄和葡萄酒相关的细菌种群10。众所周知，选择性培养平板法操作繁琐、易受污染、重复性差，结果可能不可靠，且无法检测那些生长需求未知的细菌种类。先前研究表明，不依赖培养的、基于16S rRNA基因的分析方法在表征复杂微生物群落方面更具可靠性且成本效益更高11。例如，对16S rRNA基因高变区进行测序已成功应用于研究葡萄叶片、浆果及葡萄酒中的细菌12,13,14。研究显示，采用16S rRNA元条形码技术或全宏基因组测序均适用于微生物组研究15。目前正逐步积累有关细菌多样性与其在葡萄酒酿造过程中代谢特性之间潜在关联的信息，这有助于解析酿酒特性与风土特征16。

利用下一代测序（NGS）技术充分发挥宏基因组学工具的优势，以研究葡萄和葡萄酒微生物生态的需求已被多次强调16,17。此外，基于高通量测序的无需培养的方法，用于分析食品及发酵生态系统中微生物多样性的技术已变得极为重要且具有广泛应用价值，被众多实验室采纳，并推荐用于工业实践18,19。该方法能够检测现存的微生物群落并进行分类学分析，揭示环境微生物的组成、相对丰度以及α和β多样性，具有显著优势20。对16S基因可变区的测序已成为微生物生态学研究中首选的重要基因标记，并已在多项不同研究中广泛应用。

尽管许多研究关注葡萄酒发酵过程中的真菌，尤其是酵母21，但本研究报道了利用16S扩增子测序和生物信息学工具研究特拉米内特葡萄酿酒过程中细菌群落的方法。

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方案

1. 实验性葡萄酒生产

  1. 从位于北卡罗来纳州琼斯维尔的 Dynamis Estate 葡萄园获取 Traminnette 葡萄，去梗并压榨以释放葡萄汁，分别注入两个 600 L 的敞口发酵罐中，盖上盖子，使葡萄汁与果皮接触约 4 天。
  2. 每天进行一次压帽操作，将果皮压入汁液中以保持湿润，并减少挥发性酸（VA）的生成。
    注：由于大部分芳香前体物质（单萜类化合物）位于果皮中，使葡萄汁与果皮保持接触可增强葡萄酒的芳香潜力。
  3. 4 天后，接种 Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23（Lallemand）。选择该酵母菌株是因为其具有强发酵能力，并有助于增强葡萄酒中源自葡萄的品种特性。
  4. 在其中一个发酵罐 Traminette R 中，当糖度达到 17.7 时添加 20 g/hL Fermaid O，并在糖度降至 13.1 g/hL 时再次添加 20 g/hL Fermaid O 和 12.5 g/hL Fermaid K，以确保发酵稳定性；而在另一个发酵罐 Traminette L 中，当糖度为 17.1 时添加 40 g/hL Stimula Sauvignon blanc，并在糖度降至 13.4 时添加 20 g/hL Fermaid O，以增强葡萄酒的品种特性。
  5. 分别在第 1 天（葡萄汁）、第 4 天（接种酵母后）、第 15 天（发酵中葡萄汁）和第 30 天（成酒）采集两份平行样品，在 DNA 提取和宏基因组分析前于 -20 °C 保存。

2. 宏基因组学的DNA提取

  1. 将上述获得的所有重复样品置于冰上，直至进行第一次离心。
  2. 将20 mL发酵样品转移至一个无菌的50 mL螺口管中。
  3. 加入10 mL冷水并混匀（涡旋）。在4 °C条件下以800 × g离心1分钟，将上清液转移至新的50 mL管中。
    注意：此步骤将去除样品中的固体成分。
  4. 重复步骤2.3两次，并将上清液合并至同一管中。
  5. 将上清液在4 °C条件下以3,000 × g离心20分钟，沉淀细胞。弃去上清液。
  6. 用1 mL PBS重悬沉淀，转移至2 mL螺口管中，并以14,000 × g离心2分钟。使用PBS再清洗两次。
  7. 在此步骤中，可将沉淀在-20°C下冷冻保存，或继续进行步骤2.8。重要的是所有样品需以相同方式处理。
  8. 加入978 µL磷酸钠缓冲液。配制磷酸钠缓冲液：将3.1 g NaH2PO4·H2O和10.9 g Na2HPO4 （无水）溶于蒸馏H2O中，定容至1 L，并调节pH至7.4。
  9. 加入122 µL DNA缓冲液（DNA spin试剂盒），涡旋混匀。
  10. 将样品置于冰箱（4 °C）中静置45分钟至1小时。每15分钟涡旋混匀一次。此步骤也可过夜（o/n）或持续至准备继续使用DNA spin试剂盒时。
  11. 将1 mL样品转移至Lysis solution 1管（DNA spin试剂盒）中并拧紧管盖（将样品编号写在管壁而非管盖上；试剂会清除管盖上的书写内容）。
  12. 在珠磨破碎仪中以6.5 m/s速度（CY：24 × 2）均质样品，每次60秒，共三次。若破碎仪具备冰浴装置，可在管下放置50 g干冰。若无此装置，则每次均质后将样品置于湿冰上冷却5分钟。
  13. 将Lysing Matrix E管（DNA spin试剂盒）以16,800 × g（或最大转速）离心1分钟。
  14. 将上清液转移至洁净的微量离心管中。然后加入250 µL蛋白沉淀溶液（PPS试剂，DNA spin试剂盒），用手轻轻颠倒混匀10次。
  15. 以16,800 × g离心5分钟，使沉淀形成沉淀物。
  16. 将上清液转移至无菌的15 mL管中。向上清液中加入1 mL结合基质悬浮液（DNA spin试剂盒）。
    注意：使用前需充分重悬结合基质悬浮液，直至均匀。
  17. 用手轻轻颠倒混匀管子2分钟，然后将管子置于管架中静置3分钟（使硅胶基质沉降）。
  18. 小心移除1 mL上清液。将基质在剩余的上清液中重悬。
  19. 将600 µL混合液转移至离心过滤管（DNA spin试剂盒）中，并以14,500 × g离心1分钟。
  20. 加入剩余的混合液并再次离心。
  21. 倒出穿滤液，向离心过滤管中加入500 µL洗涤液（DNA spin试剂盒），并以14,500 × g离心1分钟（确保在洗涤液中加入乙醇；参见产品说明书）。倒出穿滤液，重复洗涤两次（共洗涤三次）。
  22. 倒出穿滤液，再以14,500 × g额外离心2分钟，以去除残留的洗涤液，使基质干燥。
  23. 取出离心过滤管，将其放入新的收集管（DNA spin试剂盒）中。在室温（RT）下将离心过滤管晾干5分钟。
  24. 将无DNA酶的水（DNA spin试剂盒）在55 °C下预热5分钟。加入50 µL无DNA酶的水，并用移液枪头轻轻搅动滤膜上的基质，以高效洗脱DNA。让样品在室温下静置1分钟，然后以14,500 × g离心1分钟，完成DNA洗脱。
  25. 将样品置于冰上。将样品混合液（2 µL样品 + 2 µL水 + 1 µL上样缓冲液）上样至凝胶。测定DNA浓度。
  26. 将样品在-20 °C下保存。
  27. 使用分光光度计对提取的DNA进行定量。
    注意：取1 µL DNA样品进行检测，通过A260/A280比值评估DNA质量。

3. DNA 电泳

  1. 用0.5倍浓度的Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液配制1%琼脂糖凝胶（小型凝胶使用20 mL，中型凝胶使用70–100 mL）。称取琼脂糖和缓冲液，微波加热至琼脂糖完全溶解，重新称重后用dH2O补足至初始重量。将琼脂糖溶液冷却至55–60 °C，倒入带有梳子组件的凝胶模具中。静置使凝胶完全凝固。
  2. 向样品（10 µL）中加入1 µL 10×上样缓冲液，与分子量标记物一同上样至凝胶。以100–115 V（大凝胶）或90 V（小型凝胶）的电压从负极（黑色）向正极（红色）电泳，直至蓝色染料迁移至凝胶底部附近。
  3. 将凝胶置于含1 µL/mL溴化乙锭或SYBR Green的溶液中染色30分钟（需佩戴腈类手套和护目镜），用水冲洗后在紫外（UV）光源下观察。从重复样品中选择产量最高的样品用于后续处理。

4. 高通量测序

  1. 使用特异性引物515F（5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'）扩增16S rRNA基因的V4高变区22。PCR反应条件设置为：94 °C预变性2 min，随后进行30个循环（94 °C变性20 s，58 °C退火20 s，65 °C延伸1 min），最后在65 °C延伸10 min（终末延伸）。
  2. 使用高保真PCR预混液进行PCR反应（材料表）。
  3. 使用DNA文库构建试剂盒制备文库，随后在测序平台上进行双端测序。
    注：本实验中使用NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒制备文库，并在novaseq6000平台上采用Illumina双端测序（2 × 250 bp）进行测序。
  4. 按照以下测序步骤操作：
    1. 步骤1：使用酶对DNA进行片段化，通常采用选择特定片段大小的方法。
      1. 向25 µL DNA（约1 µg）中加入3.5 µL测序缓冲液和1.5 µL酶混合液，用移液器吹打混匀10次，短暂离心。
      2. 将反应管放入热循环仪中，设置如下程序：预热盖子至75°C，（1）20 °C孵育30 min，（2）65 °C孵育30 min，（3）4°C保存。
    2. 步骤2：通过连接反应添加接头
      1. 用移液器向反应体系中加入15 µL连接主混合液、1.25 µL接头、0.5 µL连接增强剂和30 µL末端修复后的DNA混合液。
      2. 在热循环仪中20 °C孵育15 min，然后向连接反应体系中加入1.5 µL尿嘧啶特异性切除试剂（USER）酶，总体积达48.26 µL，37 °C孵育15 min。
      3. 向接头连接后的DNA中加入43.5 µL磁珠，用移液器吹打混匀20次，室温孵育5 min。使用磁力架分离磁珠，再孵育5–10 min，弃去上清液。
      4. 用100 µL 80%乙醇洗涤沉淀一次，干燥30 s，再次洗涤。在8.5 µL 10 mM Tris HCl/0.1x Tris-EDTA（TE）/HPLC H2O中重悬磁珠和沉淀，用移液器混匀，室温孵育2 min。
      5. 将反应管置于磁力架上，吸取7.5 µL洗脱的DNA作为上清液。将洗脱液转移至新管中，进行PCR扩增步骤。
      6. 首先，向7.5 µL接头连接的DNA中加入12.5 µL主混合液、2.5 µL i7索引引物和2.5 µL通用PCR引物/i5引物，总体积为25 µL PCR反应体系。PCR程序如下：预热盖子至103 °C，98 °C预变性30 s，进行10个循环（98 °C变性10 s，65 °C延伸75 s），最后65 °C延伸5 min，4 °C保存。
      7. 对25 µL扩增后的DNA进行纯化。加入22.5 µL磁珠，吹打混匀20次，室温孵育5 min，移除50 µL上清液。用100 µL 80%乙醇洗涤磁珠，轻轻干燥30 s以彻底去除乙醇。
      8. 用16 µL水重悬深棕色磁珠，用移液器吹打混匀20次，置于磁力架上静置30–60 s。将15 µL上清液转移至新管中。
      9. 使用荧光计测定DNA浓度。将90 µL缓冲液 + 1 µL染料 + 2 µL DNA文库样品混匀后读取浓度。将DNA稀释至2 nM，取27–30 µL上样至流动池，并放入测序仪中。
    3. 步骤3：对已连接接头的片段进行测序，将上述生成的文库杂交至规则排列的流动池基质上，并根据制造商说明书捕获DNA。以此作为第二条链合成的模板。
      1. 随后，将第二条链扩增形成克隆簇。线性化克隆簇并封闭活性位点。根据制造商的操作方案加入测序引物，为边合成边测序提供起始位点。
        注：从化学原理上讲，修饰的核苷酸通过天然互补配对结合到DNA模板链上。每个核苷酸均带有荧光标记和可逆终止子，后者可阻止下一个碱基的加入。因此，荧光信号的存在指示了当前插入的核苷酸类型，随后终止子被切除，以便下一个碱基结合。
    4. 步骤4：扩增单链结合的DNA，形成可进行同步边合成边测序的序列簇。
      注：由于采用双向扫描和双通道测序化学技术，序列簇产生的信号比单链更强。测序软件会自动将碱基识别结果（*.cbcl文件）传输至指定的输出文件夹，用于后续数据分析。

5. 生物信息学

  1. 将序列数据生成为 FASTQ 文件，并按以下部分进行分析。
    1. 第一部分：
      1. 保存从测序仪获得的 FASTQ 文件，点击打开电子表格文件，并创建对应的映射/元数据文件。
      2. 打开 Nephele 网站（https://nephele.niaid.nih.gov/）， 上传 FASTQ 文件，在 QIIME2 中进行读段质量控制、过滤和修剪22。将原始序列存入 NCBI BioProject 的序列读段归档（SRA）和 GenBank（https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/）
    2. 第二部分：访问 Nephele 网站（https://nephele.niaid.nih.gov/）， 对去多重标签的双端读段进行处理，过滤替换错误和嵌合体错误，并使用 DADA2 进行序列合并23。采用基于 Silva 132 版本 99% OTU 数据库训练的朴素贝叶斯分类器，在 97% 相似度水平下进行细菌分类学注释24。
    3. 第三部分：打开 MicrobiomeDB 网站，点击上传文件，生成 OTU 的 α-多样性、β-多样性、相对丰度及稀疏曲线（https://microbiomedb.org/mbio/app）。
    4. 第四部分：打开电子表格，导入数据以绘制热图、维恩图以及线性判别分析效应大小图（https://microbiomedb.org/mbio/app）。

6. 统计分析

  1. 打开 QIIME222，使用 alpha-group-significance 脚本确定组间 α 多样性的显著差异。该分析还将执行 Kruskal-Wallis 检验。
  2. 通过 PERMANOVA 分析确定组间 β 多样性的差异，并包含成对检验25。
  3. 使用 MicrobiomeDB 获取各组间细菌群落结构的显著差异。统计学显著性阈值设定为 p 值 ≤0.05。

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结果

首先测定了从葡萄汁、发酵酒液及成品酒中提取的DNA的数量和质量，其数量范围为15-87 ng/µL（表1）。

测序与生物信息学分析
Illumina 高通量测序仪生成的 FASTQ 文件被导入 Nephele 平台，并在 QIIME 2 平台上进行查看26。首先，使用 FastQC 软件评估序列质量。随后，对序列的 5'-和 3'-端进行修剪，以去除低质量的核苷酸，接着进行去噪、序列合并，并去除嵌合序列，最后利用 DADA2 去噪器将序列聚类为 OTU（物种的操作性定义）23。使用 SILVA v138.1 数据库将序列比对至细菌分类单元。根据 99% 的核苷酸序列相似性将序列聚类为 OTU。图 1展示了 OTU 的 DADA2 稀疏曲线，曲线已趋于平缓，表明测序深度已足够覆盖大多数微生物多样性。对序列进行的重复分析未产生显著差异。

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讨论

宏基因组学实验方案从葡萄汁的采样开始，随后在酵母加入葡萄汁后，采集发酵中的葡萄酒以及最终成品酒样品。接着对这些样品进行了两轮重复的DNA提取，并成功获得了DNA。提取所得DNA的浓度在15 ng/µL至87 ng/µL之间不等。这表明该DNA提取方案适用于葡萄酒宏基因组学研究。尽管DNA在A260/A280处的纯度存在差异，但这种变化可能归因于多种影响提取效果的因素，例如酒精浓度以及发酵过程中和发酵后产生的其他代谢产物，以及其他可能抑制基因组提取的有机植物成分。先前的研究已报道过类似关于宏基因组植物材料的观察结果27。然而，本方案中提取的DNA数量足以满足后续分析步骤的要求。宏基因组学研究所需的PCR条形码构建，尤其是使用Illumina测序平台时，要求最低DNA量为1 ng/µL。本研究对V4区进行了测序，而细菌多样性分析需依赖16S rRNA基因测序；该基因包含从V1到V9的多个可变区23。从不同样品提取的DNA共获得6,393,443条双端序列读长，平均每组样本产生399590.1875 ± 138442.6148条序列。V4区被广泛使...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢阿巴拉契亚州立大学研究委员会（URC）资助项目以及巴西高等教育人员提升协调机构（CAPES）Print Travel 奖学金对 FAO 访问巴西圣保罗州里贝朗普雷图圣保罗大学的支持。 本研究部分由巴西高等教育人员提升协调机构（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil，CAPES）资助，资助代码 001。ECPDM 感谢 CAPES Print Travel 奖学金对其访问阿巴拉契亚州立大学的支持。ECPDM 是巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil，CNPq）2 级研究学者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖凝胶 Promega，美国威斯康星州麦迪逊市V3121电泳 
FastPrep 土壤DNA离心柱试剂盒 MP Biomedicals，Solon，OH，美国116560-200DNA 提取 
FastQC 软件英国巴布拉汉研究所生物信息学 
Fermaid OScott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马 发酵 
高保真 PCR 预混液 美国新英格兰生物实验室F630S用于测序的聚合酶链式反应 
NEBNext Ultra美国新英格兰生物实验室NEB #E7103DNA文库构建
NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥  美国DNA测序 
NovaSeq 控制软件（NVCS）Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥  美国DNA测序 
Novaseq6000 平台 Illumina，加利福尼亚州圣地亚哥  美国DNA测序 
QuiBit美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司DNA 定量 
Quickdrop分光光度计 Molecular device，美国加利福尼亚州圣何塞DNA 定量 
磷酸钠 Sigma Aldrich342483DNA提取缓冲液
Stimula 长相思白葡萄酒Scott 实验室，美国加利福尼亚州佩塔卢马 发酵 

参考文献

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