结合人类新生儿肠类器官与失调微生物组的坏死性小肠结肠炎微流控模型

摘要

本方案描述了一种 体外 坏死性小肠结肠炎（NEC）模型，可用于疾病发病机制的机制性研究。该模型采用微流控芯片，芯片中接种了来源于人类新生儿肠道的肠类器官、内皮细胞以及一名重症NEC新生儿的肠道微生物组。

摘要

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）是一种严重且可能致命的肠道疾病，由于其发病机制复杂且尚未完全阐明，对该病的研究一直存在困难。NEC 的病理生理过程包括肠道紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、上皮细胞死亡、微生物群失衡以及炎症反应失调。研究 NEC 的传统工具包括动物模型、细胞系以及人源或小鼠肠道类器官。尽管利用这些模型系统的研究已推动了对疾病病理生理机制的理解，但它们在模拟人类 NEC 复杂性方面仍存在局限性。一种改进的 体外 一种利用微流控技术构建的坏死性小肠结肠炎模型，名为“芯片上的坏死性小肠结肠炎”（NEC-on-a-chip），现已开发成功。该NEC-on-a-chip模型由源自早产新生儿的肠道类器官接种于微流控装置中，并与人血管内皮细胞及来自重症NEC患儿的微生物组共培养而成。此模型为研究NEC发病机制提供了有力工具，也为新生儿肠道疾病的药物发现与测试提供了新资源。本文将对该NEC-on-a-chip模型进行详细描述。

引言

坏死性小肠结肠炎（NEC）影响早产儿，在出生体重< 1500 g的婴儿中发病率高达10%¹。NEC的病理生理机制复杂，包括肠上皮损伤、肠道紧密连接破坏、肠道屏障通透性增加、免疫失调以及上皮细胞死亡^2,3。目前对NEC发病机制中涉及的分子机制仍不完全清楚，尽管已有数十年的研究，但至今仍缺乏有效的靶向治疗手段。

推进坏死性小肠结肠炎（NEC）研究的一个重要障碍是，从人类婴儿中分离获得的原代肠组织数量有限且体积较小。来自NEC患儿的切除肠组织通常已发生坏死并严重受损，这使得对疾病发生前机制的研究变得复杂。例如，NEC患儿的小肠中充满大量免疫细胞，同时观察到肠干细胞数量减少、上皮细胞增殖降低以及上皮细胞凋亡增加^4,5,6,7。这导致从这些样本中培养肠上皮细胞，以及分离RNA和蛋白质存在困难，而这些分子在强烈的炎症环境中可能已被降解。此外，由于手术干预时患儿的疾病进程通常已处于晚期，因此无法开展针对诱发疾病因素的机制性研究。这些局限性使得目前对NEC机制的研究主要依赖于动物模型。

已为小鼠、大鼠、仔猪、兔子和狒狒建立了坏死性小肠结肠炎（NEC）的动物模型^5,8,9,11。动物 模型的一个优势在于，可通过与人类NEC发病相关的因素诱导出类似NEC的肠道疾病，这些因素包括微生物组失衡、反复缺氧发作以及缺乏母乳喂养^5,8,10,11。此外，实验性NEC中观察到的炎症反应和病理改变与人类疾病表现相似^5,9,12。尽管这些模型模拟了人类NEC的许多特征，但动物与人类之间在NEC的病理生理学上仍存在固有差异。例如，小鼠NEC模型通常在足月出生的小鼠中建立，尽管其肠道发育尚未成熟，但在这一临床背景下，NEC的病理生理机制本质上与人类早产儿不同。小鼠出生时的肠道基因表达谱类似于不可存活的人类胎儿，直到出生后第14天（P14）才接近妊娠22–24周早产新生儿的水平¹³。这一特点限制了小鼠NEC模型的应用，因为通常在出生后第10天（P10）之后难以成功诱导肠道损伤。此外，近交系小鼠缺乏人类新生儿所具有的免疫学¹⁴和微生物组多样性¹⁵，这也构成了另一个混杂因素。因此，在NEC研究中更多地纳入原代人类样本，有助于提高该领域研究的临床相关性。

关于坏死性小肠结肠炎机制的研究 体外 传统上使用源自成人肠道癌细胞的单型细胞系，例如结肠直肠腺癌（Caco2）和人结肠腺癌（HT-29）细胞¹⁶这些模型虽然使用方便，但由于其来源于成体癌细胞、缺乏极性结构以及在培养传代过程中出现的表型改变，导致其生理相关性受限。肠类器官相较于这些模型有所改进，因其可由肠组织隐窝细胞培养获得，能够分化为所有类型的肠上皮细胞亚群，并形成类似绒毛的三维（3D）结构。^17,18,19,20最近，肠道类器官已与微流控技术相结合，开发出一种“芯片上的小肠”模型，从而提供更具生理相关性的研究平台。 体外 模型系统²¹.

最早的器官芯片微流控装置于21世纪初被提出^22,23,24。首个器官芯片模型是模拟人类呼吸功能的肺器官芯片²⁵。此后，陆续开发出多种单器官模型，如肠道²¹、肝脏²⁶、肾脏²⁷、骨髓²⁸、血脑屏障²⁹和心脏³⁰等。这些器官芯片模型已被用于研究急性和慢性疾病以及罕见病，包括急性放射综合征³¹、慢性阻塞性肺疾病³²和神经退行性疾病³³。芯片上细胞的极性特征以及由多孔膜分隔的两个细胞腔室的存在，使得可以模拟灌注、化学浓度梯度和免疫细胞趋化等复杂的生理过程^34,35。因此，这些微流控系统为研究人类疾病的病理生理学机制提供了新工具。

Kasendra 等人于2018年描述了小肠芯片模型，该模型利用儿童（10至14岁）小肠活检标本分化形成的肠类器官，并在微流控装置上进行培养²¹。该模型还整合了血管内皮细胞、持续的培养基流动以及拉伸/松弛作用。研究人员观察到肠上皮亚型的分化、三维绒毛样结构的形成、黏液的产生以及小肠基因表达模式²¹。该微流控模型已被应用于新生儿疾病研究，发展出坏死性小肠结肠炎芯片（NEC-on-a-chip）系统，该系统整合了来自患有坏死性小肠结肠炎（NEC）新生儿的肠类器官、内皮细胞以及微生物组³⁶。NEC-on-a-chip 重现了人类坏死性小肠结肠炎的许多关键特征，包括炎症相关基因的表达、特化上皮细胞的丢失以及肠道屏障功能的下降³⁶。因此，该模型在NEC研究中具有广泛的应用前景，包括机制研究和药物发现。本文提供了一套详细的NEC-on-a-chip模型操作方案。

方案

类器官源自早产儿（妊娠22至36周出生）的小肠组织样本，这些样本是在因坏死性小肠结肠炎（NEC）或其他非炎症性病因导致的肠道疾病接受手术时获取的。所有样本的采集和处理均在获得知情同意，并经圣路易斯华盛顿大学机构审查委员会（IRB方案编号：201706182和201804040）以及北卡罗来纳大学教堂山分校机构审查委员会（IRB方案编号：21-3134）批准后进行。

1. 从人类新生儿小肠中分离隐窝并进行铺板以建立肠类器官

1. 培养基制备
   1. 按照表1所述准备所有所需培养基。所有培养基制备过程中均需采用无菌操作技术。使用0.2 µm滤器过滤除菌，并于4 °C保存至使用。
2. 清洗与切碎肠道组织
   1. 将细胞培养基质水凝胶置于冰上融化。从手术室获取人肠道组织，立即将样本放入5 mL冰上预冷的组织洗涤培养基中，以灭活内源性蛋白酶。
   2. 使用装有修剪过P1000移液器吸头的10 mL注射器，以冰上预冷的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）冲洗肠腔内容物。将肠道组织转移至含有5 mL冰上预冷D-PBS的35 mm培养皿中。
   3. 沿纵向切开肠道组织以暴露肠腔，并用精细剪刀将其剪成小块。通过在组织培养皿中轻轻振荡D-PBS对肠道组织进行冲洗。
   4. 将组织碎片转移至一个新的洁净35 mm培养皿中，用精细剪刀进一步切碎。最佳大小为每块约0.5 cm²。肠道组织应能通过修剪过的1 mL移液器吸头。
3. 消化肠道组织
   1. 向组织中加入1 mL预热的胶原酶I，用移液器吹打10–15次使组织与胶原酶混合，随后转移至15 mL锥形离心管中。
   2. 将离心管水平固定于摇床上，设定转速为50 rpm，在室温下振荡20分钟。
   3. 孵育结束后，从摇床上取下离心管，用移液器吹打10–15次重悬细胞。可选：取少量样品，通过相差显微镜观察单个隐窝的存在情况。
4. 分离肠道隐窝
   1. 将消化液通过70 µm细胞筛过滤至置于冰上的50 mL锥形离心管中。用9 mL冰上预冷的组织洗涤培养基冲洗细胞筛。将滤液转移至15 mL锥形离心管中。
   2. 在4 °C下以300 x g离心10分钟，轻柔地吸除上清液。此时管中约残留200 µL液体。将沉淀用5 mL冰上预冷的组织洗涤培养基重悬。
   3. 在4 °C下以300 x g再次离心10分钟。将沉淀重悬于1 mL组织洗涤培养基中，并转移至1.5 mL微量离心管中。
   4. 在4 °C下以300 x g离心5分钟，使隐窝沉淀。尽可能彻底地用移液器小心吸除上清液。将离心管置于冰上。
5. 接种肠道隐窝
   1. 将沉淀用预冷的移液器吸头在冰上重悬于细胞培养基质水凝胶中（每48孔板每孔20 µL），制成均匀的隐窝悬液，操作过程中保持离心管置于冰上。移液时避免产生气泡。使用前始终保持管子在冰上。
      注：细胞培养基质水凝胶在高于8 °C的温度下会聚合。通常将一段长度为0.5–1 cm的肠道组织分离出的隐窝接种于48孔板的10个孔中。
   2. 将隐窝/细胞培养基质水凝胶悬液接种至预热的48孔组织培养板中。预热培养板有助于基质凝固。将悬液置于孔中央，接种时避免产生气泡。
   3. 将培养板在37 °C孵育20分钟，使基质聚合。在添加培养基前，确保细胞培养基质水凝胶完全聚合至关重要。
   4. 基质聚合后，向每孔加入300 µL预热的50% L-WRN条件培养基。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。
   5. 每2至3天更换一次培养基，替换为温热的50% L-WRN条件培养基。每7至10天传代一次。当类肠体达到50%–90%汇合度并出现芽状结构时进行传代。
      注：若培养基变黄，可能需要更频繁地更换。传代频率取决于类肠体的密度及特定患者细胞的生长速度。若类肠体中心区域变暗，则需进行传代。
6. 类肠体传代
   1. 轻柔地从各孔中吸除培养基。用500 µL温热的D-PBS小心清洗各孔，注意不要扰动基质。
   2. 向每孔加入250 µL冷的细胞回收溶液。用新的移液器吸头轻轻刮擦每孔底部，以破坏 细胞培养基质水凝胶。将培养板置于冰上孵育30分钟。
   3. 通过剧烈吹打（使用P200移液器吹打约25–50次）使类肠体解离，并加入500 µL组织洗涤培养基。
   4. 将类肠体悬液转移至15 mL离心管中，并额外加入5 mL冷的组织洗涤培养基。轻柔吹打以形成均匀的悬液。
   5. 在4 °C下以400 x g离心5分钟，使类肠体沉淀。将离心管置于冰上，并尽可能完全地吸除上清液。此时管中约残留30–60 µL液体。
      注：若通过吹打难以解离类肠体，可使用0.25%胰蛋白酶-EDTA或酶解解离试剂辅助该过程。
   6. 用P200移液器将类肠体重悬于残留的洗涤液中。移液时避免产生气泡。
   7. 根据类肠体密度，每新孔（48孔板）加入20 µL细胞培养基质水凝胶至类肠体悬液中，按1:3、1:4或1:5比例进行分瓶。
   8. 将悬液加入预热的48孔板中。将培养板在37 °C孵育20分钟，使基质凝固。
   9. 聚合完成后，向每孔加入300 µL预热的50% L-WRN条件培养基。在37 °C、5% CO₂条件下孵育。

2. 新生儿类肠道芯片模型

注意：有关微流控芯片操作和设备使用的详细说明，请参见制造商提供的十二指肠肠芯片培养方案³⁷。

1. 培养基制备
   1. 按照表2所述准备所有所需培养基。确保使用无菌操作技术。使用0.2 µm滤器过滤灭菌培养基，并于4 °C保存至使用。
2. 第(-3)天：解冻并扩增人肠微血管内皮细胞（HIMECs）
   1. 解冻一管HIMECs，并根据制造商的建议进行接种。
   2. 用明胶包被液对25 cm²培养瓶进行包被，作用2分钟，去除多余液体。将重悬于6 mL HIMEC培养基中的HIMECs（约0.5-1 × 10⁶个细胞）加入培养瓶中。于37 °C、5% CO₂条件下培养。
   3. 每48小时更换一次HIMEC培养基。在细胞达到100%汇合后的48-72小时内，将HIMECs加入芯片的内皮（底部）通道。
3. 第(-1)天：在加入类肠体之前活化并包被芯片
   1. 将芯片活化试剂1（CR-1）粉末重悬以配制CR-1溶液。确保CR-1粉末和芯片活化试剂2（CR-2）溶液在此步骤中处于室温。
      注意：在后续步骤中，CR-1粉末及所配制的CR-1溶液必须始终避光保存。进行这些操作时，超净台内的光源应关闭。
      1. 将芯片和芯片载体放入芯片支架中，然后置于细胞培养超净台内的组织培养皿中。有关芯片在载体中正确放置的技术，请参见制造商的操作规程³⁷。
      2. 向CR-1粉末瓶中加入1 mL CR-2溶液，然后立即将溶液从CR-1粉末瓶转移至用铝箔包裹避光的15 mL离心管中。不要用移液器混合溶液，目的是避免气泡形成。
      3. 向CR-1瓶中再加入1 mL CR-2溶液，并转移至15 mL离心管中。重复此操作，共冲洗4次，总计通过CR-1瓶的CR-2溶液体积为4 mL。最后一次冲洗时盖上瓶盖并倒置，以去除残留粉末。
      4. 向含有CR-1的15 mL离心管中再加入6 mL CR-2溶液，最终体积为10 mL（0.5 mg/mL）。用移液器轻轻混匀溶液，避免引入气泡。确保CR-1在进入下一步前完全溶解。
   2. 向芯片中加入CR-1溶液
      注意：在加入这些溶液时，必须避免在通道中引入气泡。此步骤中CR-1溶液应始终保持避光。
      1. 使用200 µL移液枪头，向底部通道入口加入20 µL CR-1溶液，直至溶液开始从底部通道出口流出。再通过顶部通道入口加入50 µL CR-1溶液，直至溶液开始从顶部通道出口流出。用轻柔抽吸的方式去除芯片表面多余的CR-1溶液。
         注意：溶液应始终先加入底部通道，再加入顶部通道。若发现有气泡，用CR-1溶液冲洗两个通道，并重复步骤2.3.2.1。
      2. 若含有芯片的组织培养皿盖已盖上，请在此步骤中移除。将芯片置于紫外光下照射15分钟。随后从顶部和底部通道中移除CR-1溶液。
      3. 重复步骤2.3.2.1至2.3.2.2，共进行两次紫外活化。完成此步骤后，芯片不再对光敏感。
      4. 从顶部和底部通道中移除CR-1溶液。用100 µL CR-2溶液清洗两个通道。再从顶部和底部通道中移除CR-2溶液。
      5. 用100 µL无菌D-PBS清洗两个通道，重复清洗2次。向两个通道各加入100 µL D-PBS。去除芯片表面的多余液体，但保持通道充满。
   3. 用细胞外基质包被通道。
      1. 在此步骤前立即在冰上解冻纤连蛋白、IV型胶原和细胞培养基质水凝胶，并在本节剩余步骤中始终保持这些溶液处于冰上。
      2. 为芯片的顶部和底部通道分别配制以下细胞外基质（ECM）溶液：
         顶部通道：每片芯片使用100 µL含200 µg/mL IV型胶原和100 µg/mL细胞培养基质水凝胶的D-PBS溶液。
         ​底部通道：每片芯片使用100 µL含200 µg/mL IV型胶原和30 µg/mL纤连蛋白的D-PBS溶液。
      3. 完全移除顶部和底部通道中的D-PBS。向底部通道入口加入50 µL ECM溶液，直至出口处出现液滴。对上部通道重复此操作。确保为每个通道使用正确的ECM溶液，并先向底部通道加样。
      4. 向芯片支架的储液槽中加入D-PBS，并盖上组织培养板的盖子。将芯片置于湿润的37 °C、5% CO₂培养箱中过夜。
4. 第(0)天：在芯片上接种HIMECs和类肠体
   1. 培养基的真空平衡
      1. 将实验所需的HIMEC培养基和芯片扩增培养基体积加入无菌50 mL锥形管中。在水浴中于37 °C预热至少1小时，使培养基达到平衡。
      2. 将真空过滤装置连接至装有预热培养基的50 mL离心管。离心管应放置为预热培养基位于50 mL锥形管底部。在-70 kPa或更高负压下抽真空10秒。
      3. 翻转离心管，使培养基通过滤膜。继续抽真空5分钟。完成真空过滤后，移除真空过滤装置，并将含有培养基的50 mL离心管放回37 °C培养箱中。
   2. 清洗芯片
      1. 用100 µL预热的HIMEC培养基冲洗内皮通道。
         ​用100 µL预热的芯片扩增培养基冲洗上皮通道。去除扩散到芯片表面的任何培养基。
      2. 重复清洗步骤。冲洗后，通道以及进出口端口应保留培养基。盖上含有芯片的培养皿盖子，并放回培养箱中待用。
   3. 收获HIMECs
      1. 吸除含有HIMECs的25 cm²培养瓶中的培养基。用D-PBS轻轻清洗单层细胞。向培养瓶中加入2 mL预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA，并轻轻润洗单层细胞。
      2. 于37 °C孵育2-5分钟。用10 mL HIMEC培养基中和胰蛋白酶。将细胞重悬于培养基中，并转移至15 mL离心管。
      3. 在4 °C下以150 × g离心5分钟。用200 µL HIMEC培养基重悬细胞。
      4. 取出10 µL细胞悬液并将离心管置于冰上。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。HIMECs的目标浓度为6 × 10⁶至8 × 10⁶个细胞/mL。
   4. 在芯片上接种HIMECs
      1. 将芯片从培养箱中取出并移入超净台。吸除可能泄漏到芯片表面的任何培养基。
      2. 用100 µL预热的芯片扩增培养基冲洗芯片的上皮（顶部）通道。用100 µL预热的HIMEC培养基冲洗芯片的内皮（底部）通道。
      3. 轻轻重悬HIMECs以获得均匀分布。完全移除内皮（底部）通道中的培养基。向内皮（底部）通道中加入10 µL HIMECs（约每片芯片36,000个细胞）。
         注意：若使用10 µL HIMECs接种时难以避免气泡形成，可增加加入的细胞体积，但每片芯片的细胞数量应保持不变。
      4. 若上皮（顶部）通道未充满，可补充额外的类器官生长培养基。检查HIMECs的接种密度。若细胞分布不均或未能覆盖芯片表面的80%-90%，则冲洗通道并重新接种。
      5. 将芯片倒置放入细胞培养皿中的芯片支架内。向芯片支架的储液槽中加入D-PBS。盖上细胞培养皿盖子，并将其放回培养箱。
      6. 将芯片倒置于37 °C培养箱中2-3小时，使HIMECs附着于芯片膜上。孵育完成后，将芯片/芯片支架恢复至直立位置。
      7. 用100 µL温热的HIMEC培养基轻轻冲洗内皮（底部）通道，保留培养基在通道中。用100 µL类器官生长培养基轻轻冲洗上皮（顶部）通道，保留培养基在通道中。
      8. 在完成后续步骤期间，将芯片放回37 °C培养箱中。
   5. 收获类肠体并在芯片上接种
      注意：芯片接种所用的类肠体应为10-14天前传代、汇合度为50%-75%、处于第7至第20代的类肠体。请参见图2了解第0天类肠体的形态。类肠体达到接种所需状态的时间取决于特定患者细胞的生长速率。
      1. 轻柔吸除孔中的培养基。用500 µL温热的D-PBS小心清洗含有细胞培养基质水凝胶的孔。注意不要扰动细胞培养基质水凝胶。
      2. 向每个孔中加入250 µL冷的细胞回收溶液。用新的移液枪头刮擦每个孔底部以破坏细胞培养基质水凝胶。将孔内内容物转移至冰上的冷15 mL离心管中。
      3. 将离心管置于冰上孵育45分钟，每3-5分钟颠倒混匀一次。在此期间，准备类肠体解离培养基。在孵育剩余10分钟时，将该培养基放入37 °C水浴中预热。
      4. 在4 °C下以300 × g离心5分钟，使类肠体沉淀。弃去上清液。
      5. 每块收获的培养板向沉淀中加入2 mL类肠体解离培养基，并置于37 °C水浴中60至120秒。孵育期间轻轻摇动离心管。孵育时间应足够长以实现类肠体碎片化，但避免解离为单细胞悬液。
      6. 孵育结束后，向每个15 mL离心管中加入10 mL冷的组织洗涤培养基。在4 °C下以300 × g离心5分钟，使类肠体沉淀。彻底吸除上清液。
      7. 用200 µL芯片扩增培养基重悬沉淀。通过剧烈吹打（使用P200移液器约25-50次）解离类肠体。
      8. 将细胞合并至无菌1.5 mL微量离心管中。轻柔吹打以形成均匀悬液。目标是将类肠体以10-30个细胞的小簇形式接种到芯片上。
      9. 取出10 µL细胞悬液用于计数。将剩余细胞悬液置于冰上。调整芯片扩增培养基的体积，使细胞浓度达到6 × 10⁶个细胞/mL。
         注意：可能需要将类肠体离心后重悬于更小体积的培养基中，以达到所需密度。
      10. 将微流控芯片移入超净台，吸除芯片上皮（顶部）通道中的培养基。向芯片顶部通道加载30 µL重悬的细胞（约每片芯片180,000个细胞）。确保芯片上皮通道完全且均匀覆盖，以形成单层。若未达到此效果，用培养基冲洗类肠体并通过芯片重新接种。
          注意：若在同时加载多个芯片时难以维持均匀悬液，可将类肠体分装至多个1.5 mL微量离心管中，每管40 µL。这将最大限度减少加载过程中类肠体数量和碎片大小的变异性。
      11. 将芯片放回细胞培养皿中的芯片支架内（若已被取出）。向芯片支架的储液槽中加入D-PBS。盖上细胞培养皿盖子，并将芯片置于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养。
5. 第(1)天：准备芯片模块并引入流动
   1. 将芯片移入组织培养超净台。用100 µL芯片扩增培养基轻轻冲洗上皮通道两次。用100 µL HIMEC培养基轻轻冲洗内皮通道两次。去除芯片表面的多余培养基。
   2. 根据制造商的操作规程³⁷对芯片模块进行预处理和调节。向入口储液槽中加入2 mL相应培养基。向出口储液槽中加入300 µL相应培养基。流速设定为30 µL/h。此时暂不启动拉伸。
6. 第(2)天：监测单层发育情况并更换培养基
   1. 暂停培养模块，将芯片模块移入超净台。
   2. 检查芯片和模块中是否存在气泡。使用相差显微镜观察上皮单层。在芯片的固定位置拍摄图像以监测进展。图像采集时芯片应保留在模块中。
   3. 移除上部通道入口储液槽中的培养基，并更换为2 mL芯片分化培养基。向下部通道入口储液槽中加入1 mL HIMEC培养基。入口储液槽中应保留足够培养基，确保储液槽底部始终被一层薄薄的培养基覆盖。
   4. 将模块放回培养模块中，以30 µL/h的流速重新启动流动。
7. 第(3)天：监测单层发育情况，启动拉伸并添加培养基
   1. 重复步骤2.6.1.1和2.6.1.2。向上部通道入口储液槽中加入1 mL芯片分化培养基，向下部通道入口储液槽中加入1 mL HIMEC培养基。
      注意：当两个通道的出口储液槽容量达到50%-75%时，应及时移除其中的培养基。
   2. 将模块放回培养模块中。以30 µL/h的流速重新启动流动，并启动2%应变、0.2 Hz频率的拉伸。
8. 第(4)天：监测单层发育情况，增加拉伸强度并添加培养基
   1. 重复步骤2.6.1.1和2.6.1.2。向上部通道入口储液槽中加入1 mL芯片分化培养基，向下部通道入口储液槽中加入1 mL HIMEC培养基。
      注意：当两个通道的出口储液槽容量达到50%-75%时，应及时移除其中的培养基。
   2. 将模块放回培养模块中。以30 µL/h的流速重新启动流动，并将拉伸增加至10%应变、0.2 Hz频率。
9. 第(5)至第(7)天：监测单层发育情况并添加培养基
   1. 重复步骤2.6.1.1和2.6.1.2。向上部通道入口储液槽中加入1 mL芯片分化培养基，向下部通道入口储液槽中加入1 mL HIMEC培养基。
   2. 将模块放回培养模块中，并重新启动流动和拉伸。一旦观察到绒毛样结构形成，即可进入“芯片上的坏死性小肠结肠炎（NEC-on-a-chip）模型”阶段。

3. 肠道芯片坏死性小肠结肠炎模型

1. 肠道细菌培养
   注意：此步骤需要提前制备好的、来自坏死性小肠结肠炎（NEC）患者的肠道细菌冻存液，且该冻存液需预先进行滴定。在本实验中，使用了先前描述的一例重症外科NEC患者来源的多微生物肠道细菌悬液³⁸。
   1. 制备含50%甘油的肠道细菌冻存液，并于-80 °C冰箱中保存，以备后续使用。
   2. 取一份肠道细菌冻存液解冻，将10 µL接种至3 mL的Luria-Bertani（LB）培养基中，在37 °C、150 rpm振荡条件下过夜培养。
   3. 同一天，用100 µL预热的无抗生素芯片分化培养基（上通道）或100 µL预热的无抗生素HIMEC培养基（下通道）轻柔冲洗各通道，完全吸除培养基后重复冲洗，共洗涤3次。
   4. 第三次洗涤吸除后，向通道中加入新鲜培养基并保留。
   5. 用无菌D-PBS冲洗上下通道的进样储液池，然后分别加入3 mL相应的无抗生素培养基。按照步骤2.5.2的操作进行引流通路预处理并调节流体。
   6. 将芯片放回培养模块，重新启动拉伸和灌注。
   7. 次日早晨，取1 mL过夜培养的细菌液，接种至25 mL新鲜LB培养基中。
   8. 将新培养物放回37 °C摇床继续培养，直至OD₆₀₀达到0.6 ± 0.02（使用1 cm比色皿测定）。随后用无抗生素芯片扩增培养基将细菌培养液稀释至7 × 10⁸ 菌落形成单位/mL。
   9. 保留一份该培养液样本，用于确认接种物浓度³⁹。根据上皮细胞的反应，可能需要调整细菌浓度。
   10. 移除上皮层（上）通道中的培养基。向上通道中加入30 µL用无抗生素芯片扩增培养基稀释后的细菌培养液。操作时需格外小心，避免细菌污染HIMEC（内皮）通道。清除芯片表面多余的液体。
   11. 让芯片在静态条件下孵育30分钟，以促进细菌黏附至新生儿上皮细胞的顶面。孵育结束后，用100 µL无抗生素扩增培养基冲洗上通道，去除未黏附的细菌。将芯片放回培养模块，重新启动拉伸和灌注。
   12. 每24小时，将芯片从培养模块中取出，缓慢用100 µL无抗生素芯片扩增培养基冲洗上皮通道，以防止细菌过度生长。

4. 肠道通透性检测

注意：此步骤可在实验方案的任何阶段进行。若在芯片接种时开始，可利用肠道通透性检测连续评估单层细胞的汇合度；若在添加肠道细菌后开始，则可利用该检测确定肠道细菌对肠道上皮单层完整性的影响。

1. 移除上皮（顶部）通道入口储液池中的培养基。向入口储液池中加入含有通透性染料（50 µg/mL）的适当培养基。对于芯片上的坏死性小肠结肠炎（NEC-on-a-chip）模型，使用不含抗生素的芯片分化培养基。
2. 每24小时收集一次上皮通道和内皮通道的流出液。参照Lanik等人的方法³⁶，使用微孔板读数仪定量测定通透性染料的浓度。

5. 免疫组织化学

1. 用 200 µL D-PBS 轻柔冲洗芯片的底部通道和顶部通道。将通道中的 D-PBS 完全吸出。
2. 用 4% 多聚甲醛冲洗两个通道以固定细胞，并将溶液保留在通道中。吸去芯片表面多余的液体，在室温下孵育 30 分钟。
3. 用 200 µL D-PBS 冲洗两个通道。在底部通道中保留 D-PBS，将顶部通道中的液体完全移除。
4. 用 100 µL 0.1% 去垢剂溶液冲洗顶部通道，以通透上皮层，并将溶液保留在通道中。吸去芯片表面多余的液体，在室温下孵育 45 分钟。
5. 用 200 µL D-PBS 冲洗两个通道。在底部通道中保留 D-PBS，将顶部通道中的液体完全移除。
6. 向顶部通道加入 10% 驴血清（或适当的封闭剂），在室温下孵育 1 小时。用 200 µL D-PBS 冲洗两个通道。在底部通道中保留 D-PBS，将顶部通道中的液体完全移除。
7. 将一抗用 5% 驴血清稀释后加入芯片的顶部通道（所用抗体及其浓度可参见 Lanik 等人³⁶）。在 4 °C 下孵育过夜。
8. 用 200 µL D-PBS 对两个通道各冲洗 3 次。最后一次冲洗后，在通道中保留 D-PBS。
9. 将荧光标记的二抗用含 5% 驴血清的 D-PBS 稀释至 1:200，并加入 Hoechst 33342 或 DAPI（核染料）。将二抗溶液加入芯片的顶部通道，在室温下避光孵育 1 小时。
10. 用 200 µL D-PBS 对两个通道各冲洗 3 次。最终冲洗后使通道充满 D-PBS。将芯片置于含 D-PBS 的成像培养皿中，用于共聚焦显微镜成像。
    ​注意：固定后的芯片（无论是否染色）可在 PBS 中于 4 °C 保存最多 1 周。保存期间应确保通道不干燥。

6. RNA 的提取、cDNA 的制备及定量实时 PCR

1. 用 200 µL D-PBS 轻柔清洗芯片的下通道和上通道。将 D-PBS 从通道中完全吸出。
2. 根据制造商说明书，使用 RNA 提取试剂从细胞中提取总 RNA。若仅需分离上皮层 RNA，则仅通过上通道进行灌注。
3. 使用微量分光光度计测定 RNA 浓度。取 1 µg 总 RNA 进行逆转录。进行定量实时 PCR 检测。本模型中先前使用的引物见 Lanik 等人³⁶。

结果

将肠类器官接种到微流控装置上（图1），并按照上述方法进行培养。通过明场显微镜监测接种前肠类器官在细胞培养基质水凝胶中的生长情况，以及接种装置后肠上皮细胞单层的后续扩展情况（图2）。肠上皮细胞形成融合的单层结构，并进一步发育为成熟的三维绒毛样结构（图2）。这种接种了由肠类器官衍生的新生儿肠上皮细胞和HIMECs的微流控装置，被称为新生儿肠芯片模型³⁶。

开发了“芯片上的坏死性小肠结肠炎”（NEC-on-a-chip）模型，以模拟新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）期间存在的微生物群失衡状态。该模型将来自患有严重NEC的新生儿的失调微生物群添加至“芯片上的新生儿肠道”模型中。在引入该失调微生物群后，检测到一系列促炎细胞因子的表达显著升高，包括肿瘤坏死因子α（TNFα；图3）、白细胞介素（I...

讨论

该“芯片上的坏死性小肠结肠炎”（NEC-on-a-chip）系统是一种强大的新型工具，可用于模拟坏死性小肠结肠炎的病理生理过程。该平台提供了一个更为复杂的微环境，能够更接近地模拟人体肠道的生理条件 体内 通过引入具有持续管腔流和拉伸作用的共培养系统，该模型比以往模型更接近肠道微环境。这些条件促进了三维绒毛样结构的发育，其表面由高度极化的上皮细胞衬覆，包含成熟的上皮亚型细胞和紧密连接（图2)³⁶此外，该模型的上皮顶端表面易于接触实验刺激物，例如患者来源的微生物群或新型治疗药物。最后，通过利用来自相关患者群体的肠类器官，该模型还可用于研究多种炎症性和非炎症性肠道疾病，以及正常肠上皮发育的机制。该模型能够从单个患者样本中最大化获取数据，鉴于新生儿肠道样本的数量有限且体积较小，这一点尤为重要。

利用该模型，观察到了早产儿发生坏死性小肠结肠炎（NEC）期间肠道上皮发生的多种生理变化。添加来自重症NEC患者的失调菌群后，导致促炎性细胞因子上调（

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
[Leu15]-胃泌素 I 人	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
高级DMEM/F12培养基	Gibco	12634010
B-27添加剂，无血清（50倍浓缩）	Gibco	17504044
基础生物实验套装	模拟	N/A
BioTek Synergy 2 多功能微孔板读板仪	安捷伦	7131000
BRAND 甲基丙烯酸甲酯（PMMA）比色皿，半微量	BrandTech	759085D
细胞回收溶液	康宁	354270
CFX Opus 实时荧光定量 PCR 系统	伯乐（Bio-Rad）	12011319
芯片支架	模拟	N/A
Chip-S1 可拉伸芯片	模拟	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
透明TC处理的多孔板，  48 孔板	康宁	3548
人胎盘胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C5533
I型胶原酶，粉末状	Gibco	17018029
含试剂盒的完全人内皮细胞培养基	细胞生物学	H-1168
15 mL 锥形聚丙烯离心管	Fisher Scientific	05-539-12
50 mL 圆锥形聚丙烯离心管	Fisher Scientific	05-539-8
Countess 细胞计数板载玻片	Invitrogen	C10283
Countess II 自动细胞计数仪	Invitrogen	AMQAX1000
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
葡聚糖，级联蓝，3000 分子量，阴离子型，赖氨酸可固定	Invitrogen	D7132	通透性染料
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8418
一次性PES滤器，0.2 μm aPES膜	Fisher Scientific	FB12566504
DMEM/F-12	Gibco	11320033
驴血清	Sigma-Aldrich	D9663
杜尔贝科′s 改良伊格尔′s 中等-高葡萄糖培养基	Sigma-Aldrich	D5796
杜尔贝科′磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco	14190-136
EDTA，0.5 M，  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 表面活化试剂	模拟	ER-1	芯片活化试剂1
ER-2 表面活化试剂	模拟	ER-2	芯片活化试剂2
人血浆纤维连接蛋白	Gibco	33016015
Fisherbrand 带透明盖的培养皿，100 mm	Fisher Scientific	FB0875713
明胶基包被溶液	细胞生物学	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
庆大霉素	Gibco	15750060
HEPES，液体，1 M 溶液（238.3 mg/mL）	康宁	25-060-CI
Hoechst 33342 三盐酸盐三水合物	Invitrogen	H3570
人Ⅰ型胶原蛋白	Sigma-Aldrich	CC050
人原代小肠微血管内皮细胞	细胞生物学	H-6054
倒置显微镜	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp 通用型高级水浴锅	Fisher Scientific	FSGPD10
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081
Luria肉汤（LB）琼脂，Miller	Supelco	L3027
L-WRN 细胞	美国典型培养物保藏中心	CRL-3276
生长因子减少型基底膜基质（Matrigel），无LDEV	康宁	356231	细胞培养基质
N-2 补充剂（100 倍浓缩）	Gibco	17502048
N-乙酰-L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR 紫外灯	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC 微体积紫外-可见分光光度计	赛默飞世尔科技	840-274200
烟酰胺	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 中心模块	模拟	N/A
多聚甲醛	赛默飞世尔科技	047392.9L
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010023
Pipet-Lite 多通道移液器 L8-200XLS+	Rainin	17013805
Pipette Tips TR LTS 1000µL S 768A/8	Rainin	17014966
Pod 便携式模块	模拟	N/A
优质级胎牛血清（FBS）（热灭活）	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect 反转录试剂盒	QIAGEN	205313
重组小鼠表皮生长因子（EGF）	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
带手柄方形生物检测培养皿，未经TC处理	康宁	431111
SsoAdvanced Universal SYBR 绿色超级混合液	伯乐（Bio-Rad）	1725271
Steriflip-GV 无菌离心管顶部滤器单元	默克密理博	SE1M179M6
无菌细胞筛，70 μm	Fisher Scientific	22-363-548
无菌注射器，10 mL	Fisher Scientific	14-955-453
直头、精细、尖锐剪刀	Miltex 仪器	MH5-300
赛默飞世尔科技 Sorvall X4R Pro-MD 离心机	赛默飞世尔科技	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	去垢剂
TRIzol试剂	Invitrogen	15596026	RNA提取试剂
台盼蓝溶液，0.4%（w/v）在 PBS 中，pH 7.5 ± 0.5	康宁	25-900-CI
TrypLE Express 酶（1X），无酚红	Gibco	12604013	酶解解离试剂
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 培养箱，165 L	赛默飞世尔科技	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
动物学ë-CM1 培养模块	模拟	N/A