我们介绍一种简单且易于实现的方法，用于在XY平面上观察丝状蓝细菌。该方法采用低熔点琼脂糖基质，可实现对参与分裂过程的蛋白质进行垂直方向的成像。因此，该技术可适用于任何丝状生物体以及多种不同类型的蛋白质。
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摘要
摘要
细菌细胞分裂的一个主要事件是隔膜形成过程，其中蛋白质FtsZ是关键组分。FtsZ在细胞中部聚合形成环状结构（Z环），为其他分裂相关蛋白提供支架。在细菌模型中应用超分辨率显微镜技术 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 表明Z环是不连续的，而活细胞成像研究则证明FtsZ通过一种称为“踏车运动”的机制沿环移动。为了研究FtsZ的动力学 体内，为了在XY平面上成像环的完整结构，必须将细胞以垂直方向进行特殊放置。在多细胞蓝藻（如 Anabaena sp. PCC7120，由于细胞尺寸和丝状体长度的原因，维持其丝状体垂直方向固定具有挑战性。本文介绍了一种实现丝状体垂直固定的实验方法 Anabaena 使用低熔点琼脂糖和注射器固定表达 FtsZ-sfGFP 融合蛋白突变体的 sp. PCC 7120 丝状体，以记录 Z 环的形成。该方法是一种利用共聚焦显微镜快速且经济地记录分裂位点蛋白质动态变化的技术。
引言
细菌细胞分裂是指母细胞通过一种称为二分裂的机制产生两个子细胞的过程。在隔膜形成过程的早期事件中，FtsZ蛋白会定位于细胞中央1。该蛋白在结构上与微管蛋白（tubulin）同源2，在大多数细菌中具有高度保守性和广泛分布性，其聚合后形成一种可收缩的结构，称为Z环3。Z环作为其他分裂相关蛋白的支架，共同组装成一种被称为分裂体（divisome）的分子机器。多项研究表明，Z环具有高度动态性，FtsZ原丝通过踏车运动（treadmilling）进行移动4,5,6。为了在延时实验中研究Z环，建议在XY平面上记录分裂位点，以获得更高的分辨率和更快的采样速度。为此，需要开发垂直固定细胞的方法，这些方法通常包括纳米加工的微孔细胞捕获结构以及复杂的微流控装置7。
蓝细菌是一类光合微生物，根据其细胞形态被归类为革兰氏阴性菌。然而，从系统发育关系上看，它们更接近于革兰氏阳性菌8这些生物具有在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中常见的细胞分裂基因，但它们的分裂体还包含一些独特组分。9. Anabaena sp. PCC 7120（下文简称 Anabaena sp.) 是一种具有单一分裂平面的丝状蓝细菌，是研究多细胞蓝细菌细胞分裂的模式生物。在该菌株中，已能够确定 FtsZ 定位于细胞中部10然而，尚无研究显示 体内 FtsZ 在该模型中的动态特性。在本实验室中，通过三亲本杂交和同源重组，我们获得了一种完全分离的突变体 Anabaena 表达与sfGFP融合的FtsZ蛋白的sp.，该融合蛋白取代了内源性的全长FtsZ ftsZ 基因。我们开发了一种快速且简单的细胞固定方法，可促进丝状蓝细菌突变株丝状体的垂直取向，便于进行延时成像实验以观察分裂蛋白。该方法无需使用可能昂贵且难以制备的微流控装置。作为示例，我们利用本方案通过共聚焦显微镜对FtsZ-sfGFP突变株中的Z环进行了可视化观察。
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方案
1. 细胞模型的考虑与选择
注意：由于含有光合色素，蓝细菌具有强烈的自发荧光。该信号位于光谱的红色区域，因此适用于蓝细菌成像的荧光蛋白应具有远离红色发射波长的特性。例如，GFP、YFP、Venus、Turquoise 和 BFP。
- 选择在目标丝状蓝藻菌株中存在的分裂体组分。为进行实验，需要构建一种表达所选分裂体组分与荧光蛋白融合的丝状蓝藻突变株。在本方案中，以表达 FtsZ-sfGFP 的 Anabaena sp. 突变株为例。该菌株通过三亲接合方法由 E. coli11 获得。
- 检测将要使用的突变株的分离程度。在本例中，通过目标基因的 PCR 扩增来确定分离情况。本方案中使用的 FtsZ-sfGFP 突变株为完全分离的菌株，缺失野生型 ftsZ 基因。
2. 生长条件
- 使用处于稳定期的10 mL培养物（在持续光照、25°C条件下培养约14天的Anabaena sp.）制备突变株的新鲜亚培养物，并将其接种至90 mL添加了抗生素的BG11培养基中（对于FtsZ-sfGFP突变株，添加终浓度为10 µl ml-1的链霉素和壮观霉素）。
- 将新培养的细胞在持续光照及最适温度下培养，直至进入对数生长期。FtsZ-sfGFP突变株的Anabaena sp.需在25 °C下培养7天，然后进行样品制备。
3. 琼脂糖基质中的样品制备
- 取2 mL均质化的生长培养物。
- 在室温下以2,500 × g 离心10分钟。
- 在此期间，在50 mL烧瓶中，将30 mL含3%低熔点琼脂糖的BG11液体培养基加热。使用微波炉中等功率，每15秒检查一次溶液，直至完全溶解。随后放置冷却至37 °C。
注意：为避免污染，需对琼脂糖溶液进行高压灭菌。 - 离心完成后，弃去1.9 mL上清液，并用移液器反复吹打至少三次，使细胞在剩余液体中重悬。
- 通过反复吹打至少三次，将重悬的细胞与900 µL的3%琼脂糖溶液混合。
注意：琼脂糖溶液必须保持液态，但温度不宜过高，以免损伤细胞。下一步操作需迅速进行，且必须在琼脂糖溶液形成凝胶状之前完成。 - 小心地用1 mL注射器吸取琼脂糖基质。在用注射器吸取样品时，应避免产生气泡。
注意：在此步骤之前，务必剪掉注射器尖端，以消除狭窄的入口孔。 - 将注射器水平放置于室温下2小时，使样品-琼脂糖混合物凝固。
- 小心使用推杆将琼脂糖基质推出，并置于干净平整的表面上。
- 将凝固的样品切成厚度为0.5 – 1 mm的薄片，同时保持基质的完整性。
注意：为获得更佳效果，建议使用解剖刀或薄剃刀片切割琼脂糖基质。 - 将切片并排放置在盖玻片上。盖玻片上可放置的圆片数量取决于其尺寸。
注意：对于延时显微成像，建议使用专用于显微分析的细胞培养腔室（例如Attofluor或Chamlide磁性腔室）。此类腔室可防止样品脱水。本示例中，样品被制备在圆形盖玻片（25 mm）上，并使用Attofluor腔室。 - 向腔室中的样品加入2 mL熔化的3%琼脂糖溶液，以防止脱水。
- 等待琼脂糖溶液完全凝固形成凝胶。
4. 图像采集
- 在共聚焦显微镜下标准化参数，以观察突变株中目标荧光蛋白的信号。确保显微镜能够同时检测自发荧光和所选的荧光标记。
- 以最大放大倍数在明场模式下观察样品，并寻找垂直方向的丝状结构，如图1所示。
- 利用Z平面的自发荧光信号进行初步扫描，定位感兴趣的分裂位点。
- 使用目标荧光蛋白标记的参数，在分裂位点处观察该蛋白的信号。
- 根据生物模型和目标蛋白的特性开展时间序列实验。例如，在本实验中，每隔50秒采集一次、每次曝光10秒的时间序列图像，用于记录Anabaena sp.中FtsZ蛋白在Z环上的动态变化过程（图2）。
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结果
利用垂直固定方法可视化 Anabaena sp. 中的 Z 环
为了研究细菌中 Z 环组分的动力学，必须获取细胞呈垂直取向时的图像。在此位置下，可对分裂体中的 Z 环及主要蛋白进行可视化，从而通过延时显微镜监测蛋白动力学。传统的细菌样品制备方法不适用于丝状蓝藻。以 Anabaena sp. 为例，其丝状体的排列方向无法实现对 Z 环的有效观察。此外，难以在较长时间内保持丝状体的固定状态，从而无法对单个细胞中的细胞分裂蛋白进行准确的可视化观察。因此，为了在 Anabaena sp. 的 FtsZ-sfGFP 突变体中可视化 Z 环，我们开发并标准化了一种使用 LMP 琼脂糖及样品水平孵育的实验方案。与先前使用的方法相比，该方案可获得更高比例的垂直取向丝状体（图 1）。因此，能够在突变菌株中直接记录与盖玻片接触的细胞在 XY 平面上的 Z 环结构（图 2A）。
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讨论
对分裂体蛋白动态的研究无疑是一项挑战。特别是在丝状蓝细菌中，挑战之一是在水平面上观察Z环，为此细胞必须垂直排列。我们在此描述的方法能够将Z环定位在XY平面上，从而进行各种分析。这是首个能够实现丝状蓝细菌Z环完整可视化的简单方法。
尽管本实验方案简单且快速，但在琼脂糖基质中的样品制备步骤需特别小心，因为低熔点琼脂糖必须处于合适的温度，才能具有足够的流动性以与细胞溶液充分混合。同时，琼脂糖溶液不能过热，否则可能导致细胞损伤。另一个需要关注的关键步骤是圆片的切割，若操作不当，基质可能塌陷并损坏样品。
采用该方法后，处于垂直位置的菌丝比例高于经典实验方案。然而，为确保统计学分析的可靠性（即获得多个处于垂直位置的菌丝），有必要尽可能多地切割培养皿中的菌块。
与其他可在微流控系统中进行单细胞研究的方法相比，我们的方法更简便、快速且成本更低，仅需任何实验室均易获得的材料和试剂。另一方面，尽管微流控系统已广泛应用于多细胞蓝细菌的研究，但据我们所知，它们尚未解决细胞在垂直方向上的定位问题<...
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致谢
感谢国家博士奖学金（ANID 21211333；21191389）提供的资助。Fondecyt 基金项目 1161232。
本工作由天主教大学先进显微镜设施中心（de Advanced Microscopy Facility UMA UC）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 ml 注射器 | 青岛艾格娜医疗科技有限公司 | - | 一次性医用塑料注射器，带1 ml针头，通常用于抽吸或注射液体；本实验中用于吸取样品并使其聚合。 |
| Attofluor 细胞培养皿 | 赛默飞世尔科技 | A7816 | Attofluor 细胞成像室是一种耐用且实用的盖玻片固定装置，专为在正置或倒置显微镜下观察活细胞样品而设计。 |
| Axygen MaxyGene II 96孔梯度PCR仪 | CORNING | THERM-1001 | 新型MaxyGene II PCR仪提升了运行速度并具备先进功能，提供您所期待的Axygen品牌产品的卓越性能。具有独特的灵活编程功能、快速运行时间，相比传统梯度PCR仪显著优化了工作流程。升降温速率最高可达5°C/秒。可调节加热盖，适用于排管、离心管和微孔板。 |
| Fisherbrand 盖玻片：圆形 | 赛默飞世尔科技 | 12-546-2P | 采用优质光学级硼硅酸盐玻璃制成，厚度和尺寸均匀。圆形设计，耐腐蚀。 |
| 低熔点琼脂糖 | Promega | V3841 | 分析级低熔点琼脂糖，适用于在凝胶电泳后需完整回收DNA片段的应用。 |
| 蔡司Airyscan LSM 880 激光共聚焦显微镜 | 蔡司 | - | 蔡司Airyscan LSM 880显微镜是一种激光扫描共聚焦显微镜，可在分辨率极限下获取图像（横向分辨率约120 nm，轴向分辨率约350 nm）。其探测器具有高灵敏度，能够高速采集超分辨率图像。 |
| Microcentrífuga Fresco 17 微型离心机 | 赛默飞世尔科技 | 75002402 | 使用我们标准的微型离心机（可选配制冷功能），可将常规样品制备过程加速至最高17,000 × g。该系列微型离心机集高效、多功能、安全与便捷于一体，设计紧凑，操作简便，适用于实验室环境。 |
| 尼康延时成像显微镜 | 尼康 | - | 尼康C2激光扫描共聚焦显微镜是进行长期延时成像的理想设备，因其配备培养室，可使样品在超过8小时的时间内保持在最佳状态。 |
| Schick Super Chromium 超薄剃须刀片 | Farmazon | SKU: 401146 | 超薄刀片用于切割琼脂糖基质，使我们能够在保持基质完整性的前提下获得含样品的圆片。 |
参考文献
- Löwe, J., Amos, L. A. Crystal structure of the bacterial cell-division protein FtsZ. Nature. 391 (6663), 203-206 (1998).
- Erickson, H. P. FtsZ, a prokaryotic homolog of tubulin. Cell. 80 (3), 367-370 (1995).
- Huang, K., Mychack, A., Tchorzewski, L. Characterization of the FtsZ C-terminal variable ( CTV ) region in Z-ring assembly and interaction with the Z-ring stabilizer ZapD in E. coli cytokinesis. , 1-24 (2016).
- Perez, A. J., et al. Movement dynamics of divisome proteins and PBP2x:FtsW in cells of Streptococcus pneumoniae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3211-3220 (2019).
- Bisson-Filho, A. W., et al. Treadmilling by FtsZ filaments drives peptidoglycan synthesis and bacterial cell division. Science. 355 (6326), 739-743 (2017).
- Yang, X., et al. GTPase activity-coupled treadmilling of the bacterial tubulin FtsZ organizes septal cell wall synthesis. Science. 355 (6326), 744-747 (2017).
- Whitley, K. D., et al. FtsZ treadmilling is essential for Z-ring condensation and septal constriction initiation in Bacillus subtilis cell division. Nature Communications. 12 (1), (2021).
- Mazón, G., et al. LexA-binding sequences in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Molecular Genetics and Genomics. 271 (1), 40-49 (2004).
- Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
- Camargo, S., et al. ZipN is an essential FtsZ membrane tether and contributes to the septal localization of SepJ in the filamentous cyanobacterium Anabaena. Scientific Reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- Thiel, T., Peter Wolk, C. Conjugal Transfer of Plasmids to Cyanobacteria. Methods in Enzymology. 153 (C), 232-243 (1987).
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: An agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab on a Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
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重印与许可
