丝状蓝细菌延时显微镜分析的垂直固定方法

摘要

我们介绍一种简单且易于实现的方法，用于在XY平面上观察丝状蓝细菌。该方法采用低熔点琼脂糖基质，可实现对参与分裂过程的蛋白质进行垂直方向的成像。因此，该技术可适用于任何丝状生物体以及多种不同类型的蛋白质。

摘要

细菌细胞分裂的一个主要事件是隔膜形成过程，其中蛋白质FtsZ是关键组分。FtsZ在细胞中部聚合形成环状结构（Z环），为其他分裂相关蛋白提供支架。在细菌模型中应用超分辨率显微镜技术 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 表明Z环是不连续的，而活细胞成像研究则证明FtsZ通过一种称为“踏车运动”的机制沿环移动。为了研究FtsZ的动力学 体内，为了在XY平面上成像环的完整结构，必须将细胞以垂直方向进行特殊放置。在多细胞蓝藻（如 Anabaena sp. PCC7120，由于细胞尺寸和丝状体长度的原因，维持其丝状体垂直方向固定具有挑战性。本文介绍了一种实现丝状体垂直固定的实验方法 Anabaena 使用低熔点琼脂糖和注射器固定表达 FtsZ-sfGFP 融合蛋白突变体的 sp. PCC 7120 丝状体，以记录 Z 环的形成。该方法是一种利用共聚焦显微镜快速且经济地记录分裂位点蛋白质动态变化的技术。

引言

细菌细胞分裂是指母细胞通过一种称为二分裂的机制产生两个子细胞的过程。在隔膜形成过程的早期事件中，FtsZ蛋白会定位于细胞中央¹。该蛋白在结构上与微管蛋白（tubulin）同源²，在大多数细菌中具有高度保守性和广泛分布性，其聚合后形成一种可收缩的结构，称为Z环³。Z环作为其他分裂相关蛋白的支架，共同组装成一种被称为分裂体（divisome）的分子机器。多项研究表明，Z环具有高度动态性，FtsZ原丝通过踏车运动（treadmilling）进行移动^4,5,6。为了在延时实验中研究Z环，建议在XY平面上记录分裂位点，以获得更高的分辨率和更快的采样速度。为此，需要开发垂直固定细胞的方法，这些方法通常包括纳米加工的微孔细胞捕获结构以及复杂的微流控装置⁷。

蓝细菌是一类光合微生物，根据其细胞形态被归类为革兰氏阴性菌。然而，从系统发育关系上看，它们更接近于革兰氏阳性菌⁸这些生物具有在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中常见的细胞分裂基因，但它们的分裂体还包含一些独特组分。

方案

1. 细胞模型的考虑与选择

注意：由于含有光合色素，蓝细菌具有强烈的自发荧光。该信号位于光谱的红色区域，因此适用于蓝细菌成像的荧光蛋白应具有远离红色发射波长的特性。例如，GFP、YFP、Venus、Turquoise 和 BFP。

1. 选择在目标丝状蓝藻菌株中存在的分裂体组分。为进行实验，需要构建一种表达所选分裂体组分与荧光蛋白融合的丝状蓝藻突变株。在本方案中，以表达 FtsZ-sfGFP 的 Anabaena sp. 突变株为例。该菌株通过三亲接合方法由 E. coli¹¹ 获得。
2. 检测将要使用的突变株的分离程度。在本例中，通过目标基因的 PCR 扩增来确定分离情况。本方案中使用的 FtsZ-sfGFP 突变株为完全分离的菌株，缺失野生型 ftsZ 基因。

2. 生长条件

1. 使用处于稳定期的10 mL培养物（在持续光照、25°C条件下培养约14天的Anabaena sp.）制备突变株的新鲜亚培养物，并将其接种至90 mL添加了抗生素的BG11培养基中（对于FtsZ-sfGFP突变株，添加终浓度为10 µl ml^-1的链霉素和壮观霉素）。<....

结果

利用垂直固定方法观察集胞藻（Anabaena sp.）中的 Z 环
为了研究细菌中 Z 环组分的动态变化，必须获取细胞在垂直方向上的图像。在此取向中，可以观察到 Z 环以及分裂体的主要蛋白质，从而通过延时显微镜监测蛋白质的动态行为。传统的细菌样品制备方法不适用于丝状蓝细菌。以集胞藻（Anabaena sp.）为例，其丝状体的排列方向不利于观察 Z 环。此外，无法长时间稳定固定丝状体，以实现对单个细胞中分裂相关蛋白的准确观察。因此，为了观察集胞藻（Anabaena sp.）FtsZ-sfGFP 突变体中的 Z 环，我们开发并标准化了一种使用低熔点琼脂糖（LMP agarose）并进行水平孵育的实验方案。与先前使用的方法相比，该方案可获得更高比例的垂直取向丝状体（图1）。因此，能够在突变菌株的细胞中，于盖玻片直接接触的 XY 平面上记录 Z 环的图像（图2A）。

讨论

对分裂体蛋白动态的研究无疑是一项挑战。特别是在丝状蓝细菌中，挑战之一是在水平面上观察Z环，为此细胞必须垂直排列。我们在此描述的方法能够将Z环定位在XY平面上，从而进行各种分析。这是首个能够实现丝状蓝细菌Z环完整可视化的简单方法。

尽管本实验方案简单且快速，但在琼脂糖基质中的样品制备步骤需特别小心，因为低熔点琼脂糖必须处于合适的温度，才能具有足够的流动性以与细胞溶液充分混合。同时，琼脂糖溶液不能过热，否则可能导致细胞损伤。另一个需要关注的关键步骤是圆片的切割，若操作不当，基质可能塌陷并损坏样品。

采用该方法后，处于垂直位置的菌丝比例高于经典实验方案。然而，为确保统计学分析的可靠性（即获得多个处于垂直位置的菌丝），有必要尽可能多地切割培养皿中的菌块。

与其他可在微流控系统中进行单细胞研究的方法相比，我们的方法更简便、快速且成本更低，仅需任何实验室均易获得的材料和试剂。另一方面，尽管微流控系统已广泛应用于多细胞蓝细菌的研究，但据我们所知，它们尚未解决细胞在垂直方向上的定位问题<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 ml 注射器	青岛艾格娜医疗科技有限公司	-	一次性医用塑料注射器，带1 ml针头，通常用于抽吸或注射液体；本实验中用于吸取样品并使其聚合。
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