啮齿类动物骨骼全骨弯曲试验研究的设计、实施与结果解读的实用考量

摘要

啮齿类动物骨骼的力学测试是获取骨骼骨折易感性信息的一种有价值的方法。若缺乏适当的实际理解，测试结果可能被过度解读或缺乏有效性。本方案将作为指导，确保力学测试能够准确进行，从而提供有效且具有功能性的数据。

摘要

骨骼脆弱导致骨折是美国面临的一项重大公共卫生危机，每年造成150万例骨折，直接医疗费用达180亿美元。深入理解骨病发生机制及治疗反应的能力不仅备受期待，而且至关重要。骨组织的力学测试是一种有价值的手段，可用于理解并量化骨骼对骨折的易感性。尽管该方法看似操作简单，但如果使用者忽视其基本假设和关键步骤，则可能得出不恰当或不准确的结论。目前在多个学科领域均观察到此类问题，相关研究持续发表，却存在方法误用和结果误读的现象。本实验方案将系统介绍力学测试的基本原理及其技术应用，涵盖从样本量设计、组织采集与保存，到数据分析与解释的全过程。掌握本方案后，研究者可获得关于骨骼骨折易感性的有价值信息，从而推动学术研究与临床解决方案的进一步发展。

引言

骨的力学测试是获取骨抗骨折能力相关功能信息的主要方法。在临床前研究中，可采用多种测试方式，但目前最常用的是长骨弯曲试验。这类试验操作简便，适用于从人类到小鼠等不同尺寸的骨骼。由于小鼠是临床前研究中最常使用的实验动物之一，本实验方案将重点介绍对小鼠股骨和胫骨进行的弯曲测试。

在进行弯曲测试之前，必须正确地收获并储存骨骼。传统的储存方法中最常见的是将骨骼冷冻在生理盐水浸湿的纱布中、单独冷冻在生理盐水中，或在乙醇中脱水¹。研究表明，与冷冻储存的骨骼相比，乙醇中储存的骨骼表现出更高的刚度和弹性模量，且变形参数降低¹。即使在测试前对骨骼进行再水化处理，也无法使这些特性恢复至正常水平¹。将骨骼完全浸没于生理盐水中储存可能导致骨骼损伤，因为生理盐水在结冰膨胀时会产生压力。此外，若需取出骨骼进行显微计算机断层扫描（µCT），必须将溶液完全解冻。因此，将新鲜收获的骨骼冷冻在生理盐水浸湿的纱布中已成为标准的储存方法，本实验方案中亦推荐采用此法。

由于骨的尺寸和形状会影响其整体强度，而许多疾病模型会显著改变骨的尺寸和形态，因此采用工程学原理对尺寸效应进行归一化处理，以获得能够估计组织行为的材料特性²。该方法需要获取断裂位置的横截面几何参数，通常在测试前通....

方案

本方案中涉及动物的所有操作步骤均在实施前获得印第安纳大学理学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。方案中所涉及的动物通过吸入 CO₂ 实施安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助安乐死手段。

1. 骨组织的收获、保存与解冻

1. 收获与保存
   1. 将小鼠仰卧放置。使用解剖刀（或剃须刀片或剪刀）在身体一侧股骨与骨盆连接的大致位置做一划口。
   2. 沿背侧方向延长初始切口，直至找到髋关节；寻找附着于骨盆上的白色小球状结构，即为股骨头。
   3. 用解剖刀边缘对股骨头近端施加压力，直至股骨头从髋臼中脱出。切除周围多余组织，使后肢完全脱离躯干残余部分。
   4. 在后肢已分离的基础上，通过屈曲膝关节来分离胫骨与股骨。在膝关节前表面沿内侧-外侧方向移动解剖刀，切断包括骨间韧带在内的所有连接组织。
   5. 若上述操作未能分离骨骼，可伸展膝关节以暴露其后侧表面。操作时需小心避免切割骨骼或刮伤关节软骨。
   6. 一旦股骨与胫骨分离，通过屈曲关节并在关节后侧表面进行内侧-外侧方向的锯动动作，将后足从胫骨上移除。如有必要，伸展关节以暴露前侧表面。操作时需避免切割骨骼。
   7. 骨骼分离后，清除所有附着的软组织。若需对胫骨进行四点弯曲测试，还需同时去除腓骨。腓骨在近端通过韧带与胫骨相连，但在骨的远端附近与胫骨融合。使用锐利剪刀在....

结果

CT 扫描完成后，大多数不合格的扫描图像通常可在重建过程中被发现。通常，质量较差的扫描图像会表现出较高的错位补偿值，这是扫描过程中出现错误的一个明显指标。然而，其他步骤中也可能发生错误，从而导致数据不准确。这些错误通常可在逐一检查计算所得的结构参数时被发现。如果某个数值明显超出同组中其他样本的范围，则应重新检查扫描图像、感兴趣区域（ROI）以及参数的计算方法。

弯曲测试完成后，应检查每次测试的力-位移曲线，以识别可能存在缺陷、需要从数据集中剔除的测试结果。图4展示了一个存在问题的测试示例。图4A中的曲线显示了一次正确执行的弯曲测试结果。曲线具有明显的线性区域，无低斜率的 toe-in 段，包含屈服点、极限点（最大力）、在位移超过最大力后出现力的下降，以及最终的失效点。在达到极限点之前，曲线平滑，加载过程无突变。因此，该测试所得参数可被准确识别并可靠使用。图4B所示的弯曲测试结果则表现出多个令人关注的异常特.......

讨论

在整个扫描和检测过程中，存在需要进行故障排除和优化的环节。第一个需要优化的环节是在使用微计算机断层扫描（µCT）扫描骨骼时。尽管许多系统都配备了一个可固定单个样本进行扫描的支架，但也可以定制专用支架，以实现多个骨骼样本的同时扫描。同时扫描多个骨骼是优化效率的良好策略，但在整个扫描和分析过程中必须谨慎操作，以确保不会引入伪影。由于X射线在每个角度增量下穿过不同厚度的骨组织并被不同程度地衰减，可能导致最终数据出现偏差。

另一个需要排查的问题出现在扫描数据的重建过程中。根据所使用的程序，用户可自行定义用于重建的密度窗，该密度窗由扫描数据的衰减系数值计算得出。衰减系数是一个线性系数，用于表示X射线束穿过物体时被衰减的程度⁵。某些程序会获取这些密度值，并将其转换为直方图中0到255范围内的灰度值。直方图中将显示两个数值，称为对比度阈值¹⁰，必须合理设置该阈值，以便区分骨性与非骨性体素。通常将较低值设为灰度0，而建议将较高的对比度阈值设为感兴趣材料（骨组织）最大衰减值的10%至20%

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CTAn	Bruker	NA	CT 扫描分析软件
DataViewer	Bruker	NA	CT 扫描旋转软件
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	用于数据分析的编程平台
NRecon	Bruker	NA	CT 扫描重建软件
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD 检测器，含 3D Suite 软件	Micro Photonics Inc	SKY-016814	微米级 CT 系统，可对物体的每个虚拟切片中最多 209 个 mPs 进行无损成像