方法文章

啮齿类动物骨骼全骨弯曲试验研究的设计、实施与结果解读的实用考量

1.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65616

⸱

2023年9月1日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Indiana University-Purdue University Indianapolis

本文内容

摘要

啮齿类动物骨骼的力学测试是获取骨骼骨折易感性信息的一种有价值的方法。若缺乏适当的实际理解，测试结果可能被过度解读或缺乏有效性。本方案将作为指导，确保力学测试能够准确进行，从而提供有效且具有功能性的数据。

摘要

骨骼脆弱导致骨折是美国面临的一项重大公共卫生危机，每年造成150万例骨折，直接医疗费用达180亿美元。深入理解骨病发生机制及治疗反应的能力不仅备受期待，而且至关重要。骨组织的力学测试是一种有价值的手段，可用于理解并量化骨骼对骨折的易感性。尽管该方法看似操作简单，但如果使用者忽视其基本假设和关键步骤，则可能得出不恰当或不准确的结论。目前在多个学科领域均观察到此类问题，相关研究持续发表，却存在方法误用和结果误读的现象。本实验方案将系统介绍力学测试的基本原理及其技术应用，涵盖从样本量设计、组织采集与保存，到数据分析与解释的全过程。掌握本方案后，研究者可获得关于骨骼骨折易感性的有价值信息，从而推动学术研究与临床解决方案的进一步发展。

引言

骨的力学测试是获取骨抗骨折能力相关功能信息的主要方法。在临床前研究中，可采用多种测试方式，但目前最常用的是长骨弯曲试验。这类试验操作简便，适用于从人类到小鼠等不同尺寸的骨骼。由于小鼠是临床前研究中最常使用的实验动物之一，本实验方案将重点介绍对小鼠股骨和胫骨进行的弯曲测试。

在进行弯曲测试之前，必须正确地收获并储存骨骼。传统的储存方法中最常见的是将骨骼冷冻在生理盐水浸湿的纱布中、单独冷冻在生理盐水中，或在乙醇中脱水1。研究表明，与冷冻储存的骨骼相比，乙醇中储存的骨骼表现出更高的刚度和弹性模量，且变形参数降低1。即使在测试前对骨骼进行再水化处理，也无法使这些特性恢复至正常水平1。将骨骼完全浸没于生理盐水中储存可能导致骨骼损伤，因为生理盐水在结冰膨胀时会产生压力。此外，若需取出骨骼进行显微计算机断层扫描（µCT），必须将溶液完全解冻。因此，将新鲜收获的骨骼冷冻在生理盐水浸湿的纱布中已成为标准的储存方法，本实验方案中亦推荐采用此法。

由于骨的尺寸和形状会影响其整体强度，而许多疾病模型会显著改变骨的尺寸和形态，因此采用工程学原理对尺寸效应进行归一化处理，以获得能够估计组织行为的材料特性2。该方法需要获取断裂位置的横截面几何参数，通常在测试前通过µCT扫描骨骼来获得。µCT因其设备普及率高且图像分辨率优异而被广泛使用。此外，该方法不包含软组织的贡献，且扫描过程无需化学固定或其他对骨骼的修饰处理3,4。在所有类型的CT中，X射线源对准被扫描物体，而位于物体另一侧的探测器测量透射后的X射线能量，从而产生样品的X射线投影阴影，该阴影可被转换为图像3,5。被扫描物体（或X射线源与探测器）围绕样品旋转，采集多角度图像，这些图像可重建为一个代表该物体的三维数据集5。

扫描分辨率，即两个物体能够被分别识别的最小间距，通过改变名义体素大小或最终图像中像素的尺寸来控制。通常认为，只有当物体的尺寸至少达到单个体素大小的两倍时，才能被识别。3，但更高的比例有助于提高精度。此外，较大的体素更容易产生部分容积效应：当单个体素包含不同密度的组织时，该体素会被赋予这些组织密度的平均值，而非某一单一组织的特定密度，这可能导致对组织面积和矿物密度的高估或低估3尽管通过选择更小的体素尺寸可在一定程度上缓解这些问题，但提高分辨率并不能确保完全消除部分容积效应，且可能需要更长的扫描时间。3扫描骨骼时 离体通常建议采用6-10 µm的体素大小，以准确评估小鼠骨小梁结构。对于皮质骨，可使用10-17 µm较大的体素大小，但仍应尽可能采用最小的合理体素大小。本方案采用10 µm的体素大小，该尺寸足够小，可在避免过长扫描时间的同时，区分关键的小梁骨特征并最小化部分容积效应。

X射线能量和能量滤波器的设置也必须仔细选择，因为骨组织的高矿物质密度和厚度会显著衰减并改变透射X射线的能量谱。通常认为，由于发射的X射线谱与穿过物体后出射的谱相同6，在骨骼等致密物体上使用低能X射线可能导致一种称为射束硬化的人工伪影7。扫描骨样本时，建议采用50–70 kVp的较高电压，以减少此类伪影的发生5。此外，在光路中插入铝或铜制能量滤波器可使X射线能量更集中，进一步降低伪影4,7。本实验方案中将全程使用0.5 mm的铝滤波器。

最后，扫描旋转步长和旋转角度范围（例如 180°–360°）共同决定了所采集图像的数量，从而影响最终扫描结果中的噪声水平4。在每一步中对多帧图像进行平均可降低噪声，但可能会延长扫描时间4。本方案采用 0.7 度的旋转步长和 2 次帧平均。

关于扫描的最后一点说明：为了将衰减系数转换为以 g/cm35 表示的矿物密度，羟基磷灰石校准体模应采用与实验骨样本相同的扫描参数进行扫描。本方案使用羟基磷灰石浓度分别为 0.25 g/cm3 和 0.75 g/cm3 的体模，尽管也可获取其他类型的体模。请注意，某些扫描系统在每日系统校准中会使用内置体模。

扫描完成后，通常使用制造商配套的软件将角度投影重建为物体的横断面图像。无论使用何种系统，都必须确保重建时完整包含整个骨骼，并正确设置阈值，以便区分骨组织与非骨组织。重建后，必须使用制造商的软件在三维空间中旋转所有扫描图像，使骨骼方向保持一致，并与横轴正确对齐。

旋转后，可根据需要分析皮质骨特性、松质骨特性或用于力学归一化的骨折几何形态来选择感兴趣区域（ROI）。对于后者，应在测试后通过测量骨折部位至骨一端的距离，并利用体素大小确定扫描文件中对应的切片位置来选择ROI。所选区域长度应至少为100 µm，且骨折点应大致位于ROI的中心，以提供足够的估算精度4。

选定感兴趣区域（ROI）后，进行力学归一化（用于计算弯曲应力和应变）需要两个参数：从中性弯曲轴到发生失效表面的最大距离（假设为受拉载荷作用的表面，由测试装置确定），以及绕中性轴的截面惯性矩（同样取决于测试装置）。本方案推荐使用自定义代码来确定这些数值。如需获取该代码，请直接联系通讯作者，或访问实验室网站 https://bbml.et.iupui.edu/ 以获取更多信息。

一旦完成µCT扫描，即可开始进行力学测试。弯曲测试可采用四点弯曲或三点弯曲两种方式。首选四点弯曲测试，因为它能消除加载点之间骨段内的剪切应力，从而使该区域发生纯弯曲3。随后，骨样将因拉伸应力而断裂，所产生的破坏更真实地反映了骨的弯曲性能3。然而，必须以适当方式加载，确保两个加载点承受相同的载荷（可通过使用可旋转的加载头实现）。在三点弯曲测试中，加载点与骨接触处存在较大的剪切应力变化，导致骨在该点因剪切而非拉伸而断裂3。根据ASTM标准建议，进行弯曲测试的材料其长度与宽度之比应为16:1，即支撑跨距长度应为骨宽度的16倍，以尽量减小剪切效应的影响8,9。但在测试小型啮齿类动物骨骼时，这一比例往往难以实现，因此通常尽可能增大加载跨距，同时尽量减少横截面形状的变化。此外，在进行四点弯曲测试时，下跨距与上跨距的长度比应约为3:18，这在胫骨测试中通常可以实现，但在较短的股骨中则较难达成。另外，股骨的皮质骨壁较薄，容易发生环状变形，从而在测试过程中改变骨横截面的形状（在四点弯曲测试中，由于需要更大的力才能产生与三点弯曲相同的弯矩，这种变形可能更为明显）。因此，在本实验方案中，小鼠股骨将采用三点弯曲测试，而胫骨则采用四点弯曲测试。

最后，为进行统计分析，必须合理地确定研究的检验效能。机械测试的一般建议是，每个实验组应包含10至12根骨骼样本，以便能够检测出差异，因为某些机械性能，尤其是屈服后参数，可能具有较高的变异性。在某些情况下，考虑到研究过程中可能出现的样本损耗，可能需要从更大的动物样本量开始。在开展研究之前，应使用已有数据完成样本量分析。

尽管存在诸多局限性和假设，但弯曲测试仍可提供相当准确的结果，尤其是在关注组间相对差异时。将这些特性与小梁结构和皮质形态的分析相结合，能够更深入地了解疾病状态及治疗方案。只要在实验中可控的各个环节（例如样本采集、储存、扫描和测试）加以注意，我们就有理由相信所获得的结果是准确的。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案中涉及动物的所有操作步骤均已在操作前获得印第安纳大学理学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。操作中所涉及的动物通过吸入 CO2 实施安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助安乐死手段。

1. 骨组织的采集、保存与解冻

  1. 收获与保存
    1. 将小鼠腹侧朝上放置。使用解剖刀（或剃须刀片或剪刀）在身体一侧股骨与骨盆的大致连接处做一 incision。
    2. 将初始切口向背侧延伸，直至找到髋关节；寻找附着于骨盆上的白色小球状结构，即为股骨头。
    3. 用解剖刀的边缘对股骨头近端施加压力，直至股骨头从髋臼中脱出。切除周围多余组织，使后肢完全脱离躯干其余部分。
    4. 在后肢已分离的基础上，通过屈曲膝关节来分离胫骨与股骨。在膝关节前表面沿内侧-外侧方向移动解剖刀，切断包括骨间韧带在内的所有连接组织。
    5. 若上述操作未能分离骨骼，可伸展膝关节以暴露其后侧表面。操作时需小心，避免切割骨骼或刮伤关节软骨。
    6. 胫骨与股骨分离后，通过屈曲关节并在关节后表面进行内侧-外侧方向的锯切动作，将后足从胫骨上移除。如有必要，可伸展关节以暴露前表面。注意避免切割骨骼。
    7. 骨骼分离后，清除所有附着的软组织。若需对胫骨进行四点弯曲测试，还需同时去除腓骨。腓骨在近端通过韧带与胫骨相连，但在远端附近与胫骨融合。使用锐利剪刀在连接处附近将腓骨剪下。
    8. 将分离并清理干净的骨骼分别用生理盐水浸湿的纱布包裹，并于 -20 °C 保存。收获后应立即执行此步骤。
    9. 对尸体另一侧重复步骤 1.1.1 至 1.1.8。
      注意：在执行步骤 1.1.4–1.1.6 时，若骨骼分离遇到阻力，建议重复操作步骤，而非强行拉扯骨骼。剧烈动作可能导致骨骼损伤或骨折。
  2. 解冻
    注意：骨骼经历的冻融循环次数应尽可能减少，因为过多的冻融循环可能对骨骼的力学性能产生不利影响。如需为 µCT 扫描进行部分解冻，可将骨骼在室温下放置 5–10 分钟实现。仅在执行下述弯曲测试前，才将骨骼完全解冻。
    1. 过夜解冻——推荐方法
      1. 将骨骼从 -20 °C 保存环境转移至冷室或冰箱中，温度保持在 1–4 °C。确保骨骼在此温度下放置 8–12 小时，以充分完成解冻后再进行测试。
    2. 快速解冻
      1. 将水浴温度设定为约 37 °C。待温度达到后，将骨骼放入水浴中。
      2. 使骨骼在水浴中保持约 1 小时。

2. µCT 扫描

  1. 扫描前用封口膜包裹骨骼以保持其湿润。等待扫描时，将其他所有骨骼置于冰上。
  2. 用封口膜包裹后，将骨骼放入扫描仪配套的样品 holder 中。确保所有扫描的骨骼方向一致，因为一致的取向将便于后续分析中的旋转操作。
  3. 根据扫描的应用目的调整扫描参数。以下为小鼠骨骼推荐的一般扫描设置：分辨率/体素大小：10 µm；像素大小：中等，2000 x 1048；滤镜：0.5 mm 铝；旋转步长：0.7；帧平均：2。
    注意：这些参数可能因所使用的扫描系统而异，必要时应参考设备制造商提供的用户手册。
  4. 开启X射线源后，执行平场校正以减少伪影。操作时，首先确保扫描腔内无任何物体，并关闭平场校正功能。
  5. 测量视野的平均强度，并将其调整至60%。达到60%后，更新平场校正设置并重新开启该功能。
  6. 确保当前平均强度处于（86–88%）范围内。
    注意：此过程可能因所使用的µCT系统不同而有所差异。在执行该步骤前，请查阅用户手册。
  7. 成功完成平场校正后，将样品 holder 放入扫描腔内。在将样品台放入扫描腔前，确保样品居中且水平。
  8. 固定样品台后，关闭扫描腔，确认整个骨骼将被完整扫描（必要时可使用定位扫描），然后开始扫描。
  9. 扫描完成后，将骨骼重新储存于浸有生理盐水的纱布中，并置于 -20 °C 条件下保存。

3. µCT 重建

  1. 选择一个能够完整捕获重建中整个骨骼的感兴趣区域（ROI）。为此，需查看骨骼的最大横截面，并根据该横截面确定ROI的大小。
  2. 设置软件的阈值，以实现对骨组织与非骨组织的准确区分。具体操作是使用直方图，将下限设为0，上限设为直方图数据峰值的末端。
  3. 调整其他设置，包括环形伪影校正和束硬化校正，分别设为5和20%。检查错位补偿值是否处于-7至7的范围内。这些数值可能因软件而异。在开始重建之前，必须根据用户手册和制造商提供的说明确认这些参数。
    注意：在重建过程中，可通过束硬化校正、环形伪影校正和错位补偿来最小化伪影。错位补偿可作为扫描质量的指标，若超出制造商规定的范围，则必须重新进行扫描。然而，重建参数取决于所使用的软件，应参考用户手册进行设置。

4. µCT 旋转

注意：重建后，必须对扫描图像进行旋转，以确保所有骨骼具有统一的朝向，并使所得骨骼的横截面尽可能垂直于其长轴且偏移角度最小。此步骤应使用用户选择的软件完成。

  1. 股骨旋转
    1. 旋转股骨，使所有骨骼具有相同的纵向方向。例如，将所有骨骼的方向调整为骨骼近端位于扫描图像的上方。
    2. 旋转骨骼，使所有骨骼的横截面方向保持一致。例如，旋转骨骼，使前侧始终位于扫描图像的右侧。
    3. 完成上述调整后，校正扫描图像，确保围绕中心轴保持对称性。
    4. 保存旋转后的数据集。
  2. 胫骨旋转
    1. 对胫骨重复步骤 4.1.1–4.1.4。

5. 力学测试程序

  1. 准备
    1. 在进行力学测试之前，应确保已对每个样本完成分辨率为6–10 µm的µCT扫描并完成重建，以确认获得高质量扫描图像，用于计算骨折部位横截面几何参数（见第2–3节）。
    2. 获取并验证扫描结果后，在测试前将所有骨骼解冻（第1节）。同一次实验中的所有骨骼应在同一天完成测试，并随机化测试顺序，以尽量减少操作者偏倚及不同样本与实验组之间的系统差异。确保骨骼在整个测试过程中保持湿润。
  2. 仪器装置设置
    1. 选择适合试样灵敏度和量程的载荷传感器。根据试样预期的破坏载荷范围，选用量程约大50%且灵敏度尽可能高的载荷传感器（例如，对于破坏载荷范围为0–25 N的小鼠骨，可选用量程为45 N的10 lbf载荷传感器）。
    2. 定位加载和支撑跨距夹具。
    3. 如图所示安装载荷传感器和夹具 图1通过将负荷传感器拧到测试仪的顶部或底部支撑上，将顶部加载夹具拧到负荷传感器上，再将底部夹具拧到测试仪的底部支撑上，确保各部件连接牢固。
      注意：进行弯曲测试时，通常建议将载荷传感器连接到上方夹具，以避免液体与载荷传感器接触；但在必要时也可使用下方夹具。
    4. 安装好载荷传感器和夹具后，选择一个支撑跨距长度，并确保所有待测样本均保持相同的支撑跨距。选择支撑跨距时，首先找出样本组中最短的骨骼。
    5. 将骨骼按图示方向置于固定装置之间 图2.
    6. 对于股骨的三点弯曲试验，遵循以下步骤 图2A确保骨的前表面紧贴支承跨距，且跨距区域位于样本的骨干部分。避免将近端的第三转子和远端骨向干骺端及髁部扩展的过渡区域包含在内。
    7. 对于四点弯曲试验，确保支撑跨距与加载跨距相互对齐并居中。 图2B 将骨样加载到夹具中。
      1. 将支撑跨度与加载跨度的长度设置为遵循3:1的比例8 （例如，9 mm 支撑跨距和 3 mm 加载跨距）。
      2. 对于胫骨，将骨的内侧表面置于支点跨度上，其中一个支点位于胫骨/腓骨连接处，另一个支点通常位于胫骨嵴稍后位置。确保加载跨度位于支点跨度中心，并包含骨的一段均匀区域。
    8. 若进行三点弯曲试验，测量支点间距；若进行四点弯曲试验，则测量加载点间距和支点间距，并记录这些距离。确保加载点间距和支点间距均从加载点中心开始测量并记录该数值。
    9. 将骨组织放回生理盐水中，或用一剂生理盐水重新水化。
      注意：在选择加载跨度的支点时，建议使用圆形支点（半径0.75 mm已足够，因其可在将载荷分散的同时，以圆的切线接触骨骼）。尽管理论建议采用刀刃状边缘来模拟点载荷，但这会在载荷施加点处压碎骨组织，导致应变被高估而模量被低估。
    10. 确保夹具的所有部件均紧固且无松动。
  3. 软件设置
    1. 确保测试仪通过模块箱、载荷传感器通道以及系统手册中规定的其他要求正确连接到计算机。
    2. 在与力学测试仪配套的软件中，创建一个包含斜坡加载的弯曲测试程序 位移速率 慢到不会引发黏弹性效应0.025 mm/s 常用于使骨骼加载至失效。
    3. A 最低采样频率 的 25 Hz 在创建测试配置文件时也建议使用较高的采样率。
    4. 为每个研究组创建一个文件夹，并将每次测试保存为该文件夹内的独立文件。
  4. 样品的加载与检测
    1. 选择一块已适当解冻的骨骼（参见步骤1.2）。使用游标卡尺测量并记录其全长。
    2. 将样品装载到夹具上，如图所示 图2A 若测试股骨 三点弯曲 和 图2B 若测试胫骨 四点弯曲.
    3. 将文件名更改为反映被测样本的名称。
    4. 将载荷归零（而非位移）。开启系统的驱动装置；确保其未处于载荷或位移控制模式。
    5. 谨慎操作，对骨骼施加最小的预载荷以固定其位置，防止骨骼滚动，但需确保不会影响样本的完整性。目标是达到 预载 约 0.25 N确保在继续操作前保持所需的骨方向。
    6. 用大量生理盐水充分润湿样本。
    7. 通过选择开始弯曲试验 开始 或 运行 在软件中。重要提示：在整个测试过程中需仔细观察样品，并记录出现任何问题的测试（如滚动、打滑）。
      注意：这些问题可能影响数据，有关这些测试的记录在分析过程中将有助于参考。
    8. 观察骨骼开始出现断裂（在受拉侧）。大多数测试将持续至发生断裂失效。此时，测试将通过预设的程序限制自动终止。如果断裂已发生但测试仪仍在继续位移，需手动停止测试，以防止对载荷传感器造成损坏。
    9. 测试完成后，使用卡尺测量从远端到断裂点的长度并记录。
    10. 对每个样本重复步骤 5.4.1 – 5.4.9。

静力学平衡示意图；载荷传感器装置；加载、支撑夹具；力学测试。
图1：力学测试装置示意图。（A）三点弯曲测试和（B）四点弯曲测试。载荷传感器以黄色显示，加载夹具以蓝色显示，支撑夹具以绿色显示。请点击此处查看此图的放大版本。

骨骨折弯曲示意图；比较股骨单点和双点受力情况。
图2：骨骼在夹具间的放置方向。（A）股骨在三点弯曲加载夹具中的正确放置方向，从上至下依次显示股骨在正确位置时的内侧、前侧和后侧视图。加载夹具以橙色表示，支撑夹具以蓝色表示。底部跨距应调整至尽可能包含骨干最直的部分，顶部夹具应居中位于这两个跨距之间。（B）胫骨在四点弯曲测试中的正确放置方向，从上至下依次显示胫骨的前侧、外侧和内侧视图。骨骼应放置成使其内侧面接触底部夹具，外侧面接触顶部夹具。胫骨与腓骨连接处应置于加载跨距之外。跨距应调整至最佳加载跨距与支撑跨距比例为1:3。请点击此处查看此图的放大版本。

6. ROI 选择

  1. 记录下断裂长度后，将旋转后的图像载入用户选择的软件中。图像载入后，定位并记录骨骼的最顶端和最底端层面。
  2. 计算顶端与底端层面之间的差值，将该数值乘以扫描体素尺寸，以确定骨骼的总长度（单位为微米）。
  3. 为在CT扫描图像中定位骨折位置，将记录的断裂长度（单位为微米）除以体素尺寸，得到从扫描远端至断裂点的µCT层面数量。
  4. 在该位置为中心选取一个感兴趣区域（ROI）。首先设定所需ROI的总长度（至少100 µm），将该长度（微米）除以体素尺寸，计算出ROI所包含的总层数。
  5. 为确定ROI的下界，将ROI总层数除以2，再从步骤6.4中已计算出的断裂位置数值中减去该结果。
  6. 将ROI的总层数加至前述计算所得的数值，得到ROI的上界。
  7. 根据计算得出的上下界选取相应的ROI，并保存该区域。

7. 力和位移数据的归一化

注意：力学测试仪仅能生成具有 x 和 y 坐标的点（位移、力）。这些点可通过欧拉-伯努利弯曲应力和应变方程转换为应力和应变，但这些计算需要从 µCT 扫描中获得的几何特性。这些特性的量化可使用用户偏好的软件完成。我们更倾向于使用自定义代码，以便对所有输入、计算和输出进行完全控制。如前所述，如需获取该代码，请直接联系通讯作者，或访问实验室网站 https://bbml.et.iupui.edu/ 以获取更多信息。以下将讨论用于计算应力和应变的方程，以及必须通过 µCT 扫描获取的相应几何特性。

  1. 三点弯曲归一化方程
    1. 用于计算三点弯曲应力的方程如下所示，见公式 1。在此方程中，“F”表示力，“L”表示支点跨距的长度。力值由力学试验机在测试过程中记录。确保在测试前记录支点跨距的长度。“c”和“I”为几何参数，将通过 µCT 扫描计算得出（见第 7.3 节）。
      材料力学应力分析中的应力计算公式 σ=FLc/4I<|endoftext|>     (1)
    2. 用于计算应变的方程如下所示，见公式 2；其中“c”和“L”在应力和应变计算中代表相同的参数。“d”表示力学试验机在测试过程中记录的位移值。
      静力学平衡公式 ε=12cd/L²；结构分析中的关键方程。     (2)
  2. 四点弯曲归一化方程
    1. 四点弯曲应力的计算方程如下所示，见公式 3。“F”和“I”与步骤 7.1.1 中讨论的变量相同。在测试前，根据支点跨距和加载跨距的测量值计算“a”。若采用推荐的四点弯曲支点跨距与加载跨距之比 3:1，则“a”为支点跨距长度的三分之一。
      弹性力学公式 σ=Fac/2l，物理学中表示应力的数学符号，方程。     (3)
    2. 四点弯曲应变的计算方程如下所示，见公式 4。“c”和“a”在应力和应变计算中代表相同的参数。“d”表示力学试验机在测试过程中记录的位移值。
      静力学平衡方程 ε=6cd/a(3L-4a)；物理学概念分析。     (4)
  3. 从 µCT 扫描中计算几何参数
    1. 变量“c”表示从中性轴到受拉骨表面的距离。因此，需确定 µCT 扫描中每个横截面的形心，因为中性轴通过形心。
      1. 若采用步骤 5.2.6 中描述的股骨三点弯曲测试方向，则应相对于前表面测量“c”。
      2. 若采用步骤 5.2.7 中描述的胫骨测试方向，则应相对于骨的内侧表面测量“c”。
    2. 变量“I”表示关于弯曲轴（股骨为内外侧轴，胫骨为前后轴）的截面惯性矩。使用公式 5计算该值。在此方程中，“dA”表示 µCT 扫描中每个像素的面积，而 y 表示每个像素到中性轴的计算距离。
      惯性矩积分方程；用于物理学研究中旋转动力学计算的公式。     (5)

8. 关注的机械测试性能

  1. 在计算任何力学性能之前，生成力-位移曲线和应力-应变曲线（理想曲线如下文图3所示，并附有重要性能参数）。
    注意：生物样本的测试并不总是产生与这些理想化示例相似的曲线，但这些曲线仍可作为有用的参考。
  2. 在分析前检查这些曲线，以发现测试中的错误，例如骨骼发生滚动或滑动。此类错误通常会在曲线初始线性部分引起突起或平坦区域。此时应去除多余数据，包括测试装置接触骨骼之前或样本断裂后采集的数据。
  3. 在确认绘制的曲线质量良好后，开始分析关键性能参数。
    1. 刚度与弹性模量
      1. 仅使用力-位移曲线的弹性阶段计算刚度。该区域曲线的斜率即为刚度。
      2. 仅使用应力-应变曲线弹性部分的斜率计算弹性模量。
    2. 屈服点
      注意：存在两个屈服点，一个在力-位移曲线上，另一个在应力-应变曲线上。力-位移曲线上的（x, y）值称为屈服位移和屈服力，而应力-应变曲线上的对应值称为屈服应变和屈服应力。这些点代表曲线弹性阶段的终点，可通过以下方法确定。
      1. 应力-应变曲线法：从（0,0）点开始，沿应变方向偏移0.2%（即2,000微应变），作一条与弹性模量斜率相同的直线。将该直线绘制在应力-应变图上；该直线与应力-应变曲线的交点即定义为屈服点。利用该屈服应力和屈服应变坐标，可求得对应的力和位移值；这些值即代表屈服力和屈服位移。
      2. 割线法：根据力-位移曲线计算刚度，并将刚度降低一个选定的百分比（5–10%）。绘制一条从（0,0）点出发、斜率为降低后刚度的直线，使其与力-位移曲线相交。交点的坐标（屈服位移，屈服力）即为所求屈服点。
        注意：割线法可在无应力-应变数据的情况下用于确定屈服点。
    3. 极限力与极限应力
      1. 通过查找相应数据集中的最大值来计算极限力和极限应力。
    4. 位移与应变参数
      1. 屈服位移和屈服应变表示到达屈服点时的位移或应变值。可通过步骤8.3.2所述方法确定屈服点以获取这些值。
      2. 总位移和总应变表示样本在整个测试过程中经历的总位移或总应变，对应于断裂点。
      3. 屈服后位移与屈服后应变：屈服后位移常被报告，可通过从总位移中减去屈服位移计算得到。屈服后应变可通过从总应变中减去屈服应变计算，但应谨慎报告，因为应变的计算最初基于材料在线弹性阶段（屈服前）的假设，这使得屈服后应变的测量可能无效。
    5. 能量参数
      1. 通过计算力-位移曲线或应力-应变曲线下方的面积来确定能量。
      2. 力-位移曲线下方的面积称为功。在屈服前部分（即弹性区域）曲线下方计算的面积称为弹性功或弹性能量。在屈服点之后（即塑性区域）曲线下方计算的面积称为屈服后功或塑性功，也称耗散能。
      3. 应力-应变曲线下方的总面积称为韧性或韧度模量，而从起始点到屈服点之间曲线下方的面积称为回弹能。与屈服后应变类似，屈服后韧性通常不被报告，因为该参数超出了应变方程所基于的假设范围。

显示刚度、弹性/塑性区域、屈服点的力-位移和应力-应变图
图3：力-位移和应力-应变曲线。（A）理想的力-位移曲线；（B）理想的应力-应变曲线，其中采用0.2%偏移法计算屈服点的直线以红色显示（注意该直线的斜率与曲线弹性区域的斜率相同）。从力-位移曲线中可获得的关键参数包括屈服力、极限力、屈服时的位移、总位移和做功量。从应力-应变曲线中可获得的组织水平参数包括屈服应力、极限应力、屈服时的应变、总应变、回弹性和韧性。请点击此处查看该图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

CT扫描完成后，大多数不合格的扫描图像可在重建过程中被发现。通常，质量较差的扫描图像会表现出较高的错位补偿值，这是扫描过程中出现错误的明显指标。然而，其他步骤中也可能发生错误，并导致数据不准确。这些错误通常可在逐一检查计算所得的结构参数时被发现。如果某个数值明显超出同组其他样本的正常范围，应重新检查扫描图像、感兴趣区域（ROI）以及参数计算方法。

弯曲测试完成后，应检查每次测试的力-位移曲线，以识别可能存在缺陷的测试，并考虑将其从数据集中剔除。图中展示了一个存在问题的测试示例（见图4）。图4A中的曲线代表一次正确执行的弯曲测试结果：曲线呈现出明显的线性区域，无低斜率的 toe-in 段，包含屈服点、极限点（最大力）、在位移超过最大力后出现力的下降，以及最终的失效点。在达到极限点之前，加载过程平滑，无突变。因此，该测试所得参数可被准确识别并可靠使用。图4B所示的弯曲测试结果则表现出多个令人关注的异常特征：加...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

在整个扫描和检测过程中，存在需要进行故障排除和优化的环节。第一个需要优化的环节是在使用微计算机断层扫描（µCT）扫描骨骼时。尽管许多系统都配备了一个可固定单个样本进行扫描的支架，但也可以定制专用支架，以实现多个骨骼样本的同时扫描。同时扫描多个骨骼是优化效率的良好策略，但在整个扫描和分析过程中必须谨慎操作，以确保不会引入伪影。由于X射线在每个角度增量下穿过不同厚度的骨组织并被不同程度地衰减，可能导致最终数据出现偏差。

另一个需要排查的问题出现在扫描数据的重建过程中。根据所使用的程序，用户可自行定义用于重建的密度窗，该密度窗由扫描数据的衰减系数值计算得出。衰减系数是一个线性系数，用于表示X射线束穿过物体时被衰减的程度5。某些程序会获取这些密度值，并将其转换为直方图中0到255范围内的灰度值。直方图中将显示两个数值，称为对比度阈值10，必须合理设置该阈值，以便区分骨性与非骨性体素。通常将较低值设为灰度0，而建议将较高的对比度阈值设为感兴趣材料（骨组织）最大衰减值的10%至20%

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本方案的开发工作得到了美国国立卫生研究院 [AR072609] 的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CTAnBrukerNACT 扫描分析软件
DataViewerBrukerNACT 扫描旋转软件
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023aMathWorksNA用于数据分析的编程平台
NReconBrukerNACT 扫描重建软件
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD 检测器，含 3D Suite 软件  Micro Photonics IncSKY-016814微米级 CT 系统，可对物体的每个虚拟切片中最多 209 个 mPs 进行无损成像 

参考文献

  1. Vesper, E. O., Hammond, M. A., Allen, M. R., Wallace, J. M. Even with rehydration, preservation in ethanol influences the mechanical properties of bone and how bone responds to experimental manipulation. Bone. 97, 49-53 (2017).
  2. Jepsen, K. J., Silva, M. J., Vashishth, D., Guo, X. E., van der Meulen, M. C. Establishing biomechanical mechanisms in mouse models: practical guidelines for systematically evaluating phenotypic changes in the diaphyses of long bones. Journal of Bone and Mineral Research. 30 (6), 951-966 (2015).
  3. Basic and Applied Bone Biology. Eds Burr, D. B., Allen, M. R. , Elsevier/Academic Press, London. (2019).
  4. microCT SkyScan 1272 User Manual. , Konitch, Belgium. https://research.rutgers.edu/sites/default/files/2022-02/1272_UserManual_v1_2.pdf (2018).
  5. Kim, Y., Brodt, M. D., Tang, S. Y., Silva, M. J. MicroCT for scanning and analysis of mouse bones. Methods in Molecular Biology. 2230, 169-198 (2021).
  6. Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
  7. Micro-CT specimen scanner, Centre for high-throughput phenogenomics. , https://chtp.ubc.ca/equipment/x-ray-imaging/micro-ct-specimen-scanner (2023).
  8. ASTM International. Standard test method for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials by four-point bending. , https://www.astm.org/d6272-17e01.html (2020).
  9. ASTM International. Standard test methods for flexural properties of unreinforced and reinforced plastics and electrical insulating materials. , https://www.astm.org/d0790-17.html (2017).
  10. Bruker microCT NRecon: An overview. , Konitch, Belgium. https://www.yumpu.com/en/document/read/8764648/nrecon-user-manual-skyscan (2023).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CT

相关文章