本文介绍了从珊瑚全共生体以及分离的珊瑚宿主组织和虫黄藻细胞组分中提取和制备极性及中等极性代谢物,用于气相色谱-质谱分析的方法。
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本文介绍了从珊瑚全共生体以及分离的珊瑚宿主组织和虫黄藻细胞组分中提取和制备极性及中等极性代谢物,用于气相色谱-质谱分析的方法。
基于气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)的方法已被证明在阐明刺胞动物-甲藻共生关系的代谢基础以及珊瑚对胁迫(例如温度升高引起的白化)的响应方面具有强大能力。对珊瑚全共生体(包含刺胞动物宿主及其相关微生物,如共生甲藻和其他原生生物、细菌、古菌、真菌和病毒)进行的稳态代谢物谱分析,已在常温和胁迫条件下成功应用,以表征珊瑚整体的代谢状态。
然而,要解答有关共生相互作用的问题,必须独立分析珊瑚宿主及其藻类共生体的代谢物谱,而这只能通过物理分离和组织分离来实现,随后进行独立的提取与分析。尽管代谢组学在珊瑚研究领域中的应用相对较新,但研究团队的持续努力已推动了珊瑚代谢物分析的稳健方法的发展,包括珊瑚宿主组织与藻类共生体的分离技术。
本文提供了一种全共生体分离及用于气相色谱-质谱(GC-MS)分析的代谢物提取的逐步操作指南,包括需要考虑的关键优化步骤。我们展示了在分别分析后,两个组分(珊瑚和虫黄藻)的联合代谢物谱与整体(全共生体)的代谢物谱相似;但通过分离组织,我们还能获得关于两个共生伙伴之间代谢过程及其相互作用的关键信息,而这些信息仅通过整体样本无法获取。
代谢物是细胞过程的终产物,而代谢组学——研究特定生物体或生态系统所产生的全套代谢物——能够直接反映生物体的功能状态1。这一点对于探索生态系统、共生相互作用以及恢复工具尤为重要,因为大多数管理策略的目标都是保护(或恢复)特定的生态系统服务功能2。珊瑚礁是一种水生生态系统,展示了代谢组学在阐明共生关系以及将珊瑚生理响应与群落水平和生态系统水平的影响相联系方面的潜在价值3。高通量气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)的应用尤其受到重视,因其能够同时快速分析多种类代谢物,具有高选择性和高灵敏度;在有谱图数据库可用时可实现快速化合物鉴定;并且具有高度的可重复性和准确性,且每样本检测成本相对较低。
珊瑚是全共生体,由珊瑚动物、光合作用的甲藻内共生体(科:Symbiodiniaceae4)以及复杂的微生物组5,6组成。总体而言,全共生体的适应性主要通过小分子和元素的交换来维持,以支持各成员的代谢功能7,8,9,10。代谢组学方法已被证明在阐明珊瑚共生特异性9,11、热应激引起的白化反应7,8,12,13、疾病响应14、污染物暴露响应15、光适应16以及化学信号传导17等方面特别有效,同时也助力于生物标志物的发现18,19。此外,代谢组学还可为基于DNA和RNA技术所得出的结论提供有价值的验证9,20。因此,代谢组学在评估珊瑚礁健康状况和开发珊瑚礁保护工具方面具有巨大潜力3,例如通过检测应激的代谢生物标志物18,19,以及评估主动管理策略(如营养补充)的可行性21。
将宿主细胞与共生细胞分离,并分别分析它们的代谢物谱,而不是将全共生体(holobiont)作为一个整体进行分析,能够更深入地揭示共生双方的相互作用、各自独立的生理与代谢状态,以及潜在的分子适应机制11,12,22,23,24。如果不将珊瑚与其共生的Symbiodiniaceae藻类分离,则几乎无法独立解析珊瑚和/或Symbiodiniaceae各自的代谢贡献与代谢过程,除非借助复杂的基因组重建和代谢建模方法25,但该方法尚未应用于珊瑚-甲藻共生体系。此外,试图从全共生体的代谢物谱中推断宿主或藻类共生体各自的代谢信息,可能导致错误解读。
例如,直到最近,人们认为珊瑚和全共生体组织提取物中存在C18:3n-6、C18:4n-3和C16多不饱和脂肪酸,这些成分源自藻类共生体,因为珊瑚被认为缺乏合成omega-3(ω3)脂肪酸所必需的ωx去饱和酶;然而,近期的基因组证据表明,多种刺胞动物具备合成ω3多不饱和脂肪酸(PUFA)的能力 从头合成 并进一步生物合成ω3长链多不饱和脂肪酸26结合气相色谱-质谱法与稳定同位素标记(例如, 13C-碳酸氢钠,NaH13CO3可用于在对照条件及对外部胁迫的响应中,追踪光合作用固定的碳在珊瑚全生物体代谢网络中的去向27,28然而,追踪过程中的一个关键步骤是 13珊瑚组织与藻类细胞分离后,才能确定C的命运 13珊瑚宿主组分中检测到的C标记化合物可明确归因于由共生虫黄藻(Symbiodiniaceae)产生并转运至珊瑚的代谢物,或为已转运的标记化合物的下游代谢产物。该技术已展现出其重要价值,通过实验证据挑战了长期以来认为甘油是光合产物从共生体向宿主转运主要形式的假设。29,以及阐明在白化过程中伙伴间的营养流动如何变化27,28 以及对不相容的Symbiodiniaceae物种的响应11.
尽管组织分离的决定主要取决于研究问题,但该方法的可行性、可靠性及其潜在的代谢影响也需加以考虑。本文提供了从全共生体以及分别从宿主和共生体组分中提取代谢物的详细且经示范的方法。我们分别比较了宿主与共生体的代谢物谱,并分析了这些代谢物谱与全共生体代谢物谱之间的异同。
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注意:实验设计、样品采集与保存已在其他文献中详细描述2,30,31。在采集和实验前,必须获得采集野生珊瑚的许可批准。本研究所用样品采自 Batavia Coral Farms(西澳大利亚杰拉尔顿)进口的Montipora mollis(绿色色型)珊瑚群体,原始采集地点为阿布罗略斯群岛附近海域(西澳大利亚;28°52'43.3"S 114°00'17.0"E),水深1米,采集依据水产养殖许可证AQ1643。取样前,珊瑚群体在800 L水族箱中驯养3个月,条件为盐度35 PSU、蓝白光光照强度150 µmol photons·m−2·s−1、温度25 °C ± 0.5 °C。珊瑚片段(约5 cm2,N = 6)经液氮速冻后,于−80 °C保存直至处理。
1. 提取溶液和设备的准备
2. 珊瑚代谢淬灭
注意:实验设计、样品采集与保存已在其他文献中详细描述2,30,31。但需注意,终止代谢所需的时间(即珊瑚样品采集至保存之间的时间)对于捕获原始生理响应至关重要30。采集样品后应尽快保存,以防止因样品降解或非靶向的生理反应导致代谢物组成发生变化32。
3. 从骨骼上移除珊瑚组织
注意:样品应始终置于冰上(4 °C),以确保其保持液态并防止持续的代谢活动。
4. 可选的匀浆步骤
注意:某些珊瑚物种比其他物种更具黏性,这意味着气动刷洗会以团块而非匀浆的形式去除组织。如果在气动刷洗的匀浆中可见组织团块,可对所有样品在 4 °C 下增加一个匀浆步骤。
5. 用于归一化的样品采集
6. 可选的珊瑚宿主组织-虫黄藻细胞分离
7. 样品干燥
8. 胞内代谢物提取
9. 代谢物提取物的纯化
10. 代谢物衍生化
注意:采用两步在线衍生化过程对极性代谢物进行甲氧基化和三甲基硅烷化。
11. 气相色谱-质谱分析
注意:应使用三(全氟丁基)胺(CF43)根据制造商的推荐对质谱仪进行调谐。
12. Symbiodiniaceae 细胞计数、珊瑚宿主组织蛋白含量分析及叶绿素 a 含量测定
13. 代谢物提取后用于归一化的细胞生物量定量
注意:以下介绍了两种细胞生物量定量方法:一种是采用改良的布拉福德比色法测定与生物量相关的蛋白质含量,另一种是测定细胞残渣的干重。这两种方法均可用于准确测定细胞生物量。
14. 数据分析
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本研究产生的所有数据均可在补充信息中获取。
宿主-共生体分离

图1珊瑚宿主组织与共生甲藻细胞分离的建立与验证 (A用于从珊瑚骨骼上清除珊瑚组织的气枪装置。用电气胶带将移液器吸头固定在气枪上,并从吸头末端切下约5 mm的小段,以允许更多空气逸出,同时避免吸头脱落。B) 全共生体以及分离的宿主组织(上清液)和虫黄藻细胞(沉淀)示例。数值表示离心步骤的次...
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宿主与共生体的分离可轻松且快速地实现 通过 简单的离心分离,此处结果表明,分离不同组分可提供有价值的信息,用以指示珊瑚全共生体中特定成员的贡献,从而有助于珊瑚健康的功能分析。在成体珊瑚中,脂质合成主要由定居的共生藻类完成40,提供脂质(例如,三酰甘油和磷脂)41 以及能够促进应激恢复的脂肪酸11,42在共生体中丰度较高的13种代谢物 与 本研究中的宿主特征谱包含9种脂肪酸,包括在珊瑚-虫黄藻共生关系中参与跨生物界应激信号传导的具有重要生物学意义的二十碳五烯酸(DHA,C22:6[ω-6])、二十碳五烯酸(EPA,C20:5[ω-6])和花生四烯酸(ARA,C20:4[ω-6])9,10肌醇磷酸在多种细胞功能中发挥关键作用,包括细胞生长、凋亡、内吞作用和细胞分化。在共生功能障碍...
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作者声明无利益冲突。
J.L.M. 获得了悉尼科技大学校长研究奖学金的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 100% 色谱级甲醇 | Merck | 439193 | 色谱级必需品 |
| 2 mL 聚丙烯微量离心管 | Eppendorf | 30121880 | 聚丙烯材料具有高耐化学性、机械应力和极端温度的能力 |
| 2030 岛津气相色谱仪 | Shimadzu | GC-2030 | |
| 710–1180 µm 酸洗玻璃珠 | Merck | G1152 | 该尺寸最适合破碎虫黄藻细胞 |
| AOC-6000 Plus 多功能自动进样器 | Shimadzu | AOC6000 | |
| Bradford 试剂 | Merck | B6916 | 任何蛋白质比色试剂均可接受 |
| 压缩空气枪 | Ozito | 6270636 | 类似设计可接受,关键是要有适配器可安装1 mL吸头 |
| 内径0.25 mm、膜厚1 µm 的DB-5色谱柱 | Agilent | 122-5013 | |
| DMF | Merck | RTC000098 | |
| D-山梨醇-6-13C 和/或 13C5–15N 缬氨酸 | Merck | 605514/ 600148 | 可将其中一种或两种内标加入甲醇中 |
| 平底96孔板 | Merck | CLS3614 | |
| 玻璃闪烁瓶 | Merck | V7130 | 20 mL,带非塑料密封盖 |
| 免疫球蛋白G | Merck | 56834 | 若无法获得,可使用牛血清白蛋白替代 |
| 引物 | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| 岛津LabSolutions Insight软件 | v3.6 | ||
| 氢氧化钠 | Merck | S5881 | 制成1 M溶液用的颗粒 |
| tidyverse | v1.3.1 | R语言程序包 | |
| TissueLyser LT组织研磨仪 | Qiagen | 85600 | 或类似设备 |
| TQ8050NX三重四极杆质谱仪 | Shimadzu | GCMS-TQ8050 NX | |
| 紫外透光96孔板 | Greiner | M3812 | |
| Whirl-Pak样品袋 | Merck | WPB01018WA | 样品采集袋;尺寸:足以容纳约5 cm的珊瑚碎片,但不宜过大以免水体过于分散 |
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