基于气相色谱-质谱法的硬珊瑚样品靶向代谢组学

摘要

本文介绍了从珊瑚全共生体以及分离的珊瑚宿主组织和虫黄藻细胞组分中提取和制备极性及中等极性代谢物，用于气相色谱-质谱分析的方法。

摘要

基于气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的方法已被证明在阐明刺胞动物-甲藻共生关系的代谢基础以及珊瑚对胁迫（例如温度升高引起的白化）的响应方面具有强大能力。对珊瑚全共生体（包含刺胞动物宿主及其相关微生物，如共生甲藻和其他原生生物、细菌、古菌、真菌和病毒）进行的稳态代谢物谱分析，已在常温和胁迫条件下成功应用，以表征珊瑚整体的代谢状态。

然而，要解答有关共生相互作用的问题，必须独立分析珊瑚宿主及其藻类共生体的代谢物谱，而这只能通过物理分离和组织分离来实现，随后进行独立的提取与分析。尽管代谢组学在珊瑚研究领域中的应用相对较新，但研究团队的持续努力已推动了珊瑚代谢物分析的稳健方法的发展，包括珊瑚宿主组织与藻类共生体的分离技术。

本文提供了一种全共生体分离及用于气相色谱-质谱（GC-MS）分析的代谢物提取的逐步操作指南，包括需要考虑的关键优化步骤。我们展示了在分别分析后，两个组分（珊瑚和虫黄藻）的联合代谢物谱与整体（全共生体）的代谢物谱相似；但通过分离组织，我们还能获得关于两个共生伙伴之间代谢过程及其相互作用的关键信息，而这些信息仅通过整体样本无法获取。

引言

代谢物是细胞过程的终产物，而代谢组学——研究特定生物体或生态系统所产生的全套代谢物——能够直接反映生物体的功能状态¹。这一点对于探索生态系统、共生相互作用以及恢复工具尤为重要，因为大多数管理策略的目标都是保护（或恢复）特定的生态系统服务功能²。珊瑚礁是一种水生生态系统，展示了代谢组学在阐明共生关系以及将珊瑚生理响应与群落水平和生态系统水平的影响相联系方面的潜在价值³。高通量气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的应用尤其受到重视，因其能够同时快速分析多种类代谢物，具有高选择性和高灵敏度；在有谱图数据库可用时可实现快速化合物鉴定；并且具有高度的可重复性和准确性，且每样本检测成本相对较低。

珊瑚是全共生体，由珊瑚动物、光合作用的甲藻内共生体（科：Symbiodiniaceae⁴）以及复杂的微生物组^5,6组成。总体而言，全共生体的适应性主要通过小分子和元素的交换来维持，以支持各成员的代谢功能^7,8,9

方案

注意：实验设计、样品采集与保存已在其他文献中详细描述^2,30,31。在采集和实验前，必须获得采集野生珊瑚的许可批准。本研究所用样品采自 Batavia Coral Farms（西澳大利亚杰拉尔顿）进口的Montipora mollis（绿色色型）珊瑚群体，原始采集地点为阿布罗略斯群岛附近海域（西澳大利亚；28°52'43.3"S 114°00'17.0"E），水深1米，采集依据水产养殖许可证AQ1643。取样前，珊瑚群体在800 L水族箱中驯养3个月，条件为盐度35 PSU、蓝白光光照强度150 µmol photons·m⁻²·s⁻¹、温度25 °C ± 0.5 °C。珊瑚片段（约5 cm²，N = 6）经液氮速冻后，于−80 °C保存直至处理。

1. 提取溶液和设备的准备

1. 至少在珊瑚组织取样前1天，准备好提取溶液和设备。
2. 将超纯水在洁净、无洗涤剂的玻璃器皿中预冷至4℃ °C.
3. 将100%色谱级甲醇与10 µg·mL⁻¹ 适当内标物的终浓度（例....

结果

本研究产生的所有数据均可在补充信息中获取。

宿主-共生体分离

图1珊瑚宿主组织与共生甲藻细胞分离的建立与验证 (A用于从珊瑚骨骼上清除珊瑚组织的气枪装置。用电气胶带将移液器吸头固定在气枪上，并从吸头末端切下约5 mm的小段，以允许更多空气逸出，同时避免吸头脱落。B) 全共生体以及分离的宿主组织（上清液）和虫黄藻细胞（沉淀）示例。数值表示离心步骤的次.......

讨论

宿主与共生体的分离可轻松且快速地实现 通过 简单的离心分离，此处结果表明，分离不同组分可提供有价值的信息，用以指示珊瑚全共生体中特定成员的贡献，从而有助于珊瑚健康的功能分析。在成体珊瑚中，脂质合成主要由定居的共生藻类完成⁴⁰，提供脂质（例如，三酰甘油和磷脂）⁴¹ 以及能够促进应激恢复的脂肪酸^11,42在共生体中丰度较高的13种代谢物 与 本研究中的宿主特征谱包含9种脂肪酸，包括在珊瑚-虫黄藻共生关系中参与跨生物界应激信号传导的具有重要生物学意义的二十碳五烯酸（DHA，C22:6[ω-6]）、二十碳五烯酸（EPA，C20:5[ω-6]）和花生四烯酸（ARA，C20:4[ω-6]）^9,10肌醇磷酸在多种细胞功能中发挥关键作用，包括细胞生长、凋亡、内吞作用和细胞分化。在共生功能障碍.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100% 色谱级甲醇	Merck	439193	色谱级必需品
2 mL 聚丙烯微量离心管	Eppendorf	30121880	聚丙烯材料具有高耐化学性、机械应力和极端温度的能力
2030 岛津气相色谱仪	Shimadzu	GC-2030
710–1180 µm 酸洗玻璃珠	Merck	G1152	该尺寸最适合破碎虫黄藻细胞
AOC-6000 Plus 多功能自动进样器	Shimadzu	AOC6000
Bradford 试剂	Merck	B6916	任何蛋白质比色试剂均可接受
压缩空气枪	Ozito	6270636	类似设计可接受，关键是要有适配器可安装1 mL吸头
内径0.25 mm、膜厚1 µm 的DB-5色谱柱	Agilent	122-5013
DMF	Merck	RTC000098
D-山梨醇-6-13C 和/或 13C5–15N 缬氨酸	Merck	605514/ 600148	可将其中一种或两种内标加入甲醇中
平底96孔板	Merck	CLS3614
玻璃闪烁瓶	Merck	V7130	20 mL，带非塑料密封盖
免疫球蛋白G	Merck	56834	若无法获得，可使用牛血清白蛋白替代
引物		v4
R		v4.1.2
岛津LabSolutions Insight软件		v3.6
氢氧化钠	Merck	S5881	制成1 M溶液用的颗粒
tidyverse		v1.3.1	R语言程序包
TissueLyser LT组织研磨仪	Qiagen	85600	或类似设备
TQ8050NX三重四极杆质谱仪	Shimadzu	GCMS-TQ8050 NX
紫外透光96孔板	Greiner	M3812
Whirl-Pak样品袋	Merck	WPB01018WA	样品采集袋；尺寸：足以容纳约5 cm的珊瑚碎片，但不宜过大以免水体过于分散