本文介绍一种从无疣星虫（Sipunculus nudus）中分离纤溶酶的亲和纯化方法，该方法简便、经济且高效。
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本文内容
摘要
摘要
Sipunculus nudus来源的纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活为纤溶酶，又能直接降解纤维蛋白，相较于传统溶栓药物具有显著优势。然而，由于缺乏结构信息，目前所有sFE的纯化方案均依赖多步层析纯化，过程过于复杂且成本较高。本文首次基于sFE的晶体结构开发了一种亲和纯化方案，包括粗提样品的制备、赖氨酸/精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备、亲和纯化及纯化后sFE的表征。按照本方案，可在1天内完成一批sFE的纯化。此外，纯化后sFE的纯度和活性分别达到92%和 19,200 U/mL 。因此，该方法是一种简便、经济且高效的sFE纯化策略。本方案的建立对于sFE及其他类似药物的进一步应用具有重要意义。
引言
血栓形成是公共卫生的主要威胁，尤其是在全球新冠疫情之后1,2临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PAs 可将患者体内的纤溶酶原激活为具有活性的纤溶酶，从而降解纤维蛋白。因此，其溶栓效率在很大程度上受限于患者的纤溶酶原状态3,4纤溶药物，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一类临床溶栓药物，还包括纤溶酶类（FE）如纤溶酶，可直接溶解血栓，但会迅速被多种纤溶酶抑制剂失活5随后，有研究报道了一种新型溶栓剂，其不仅可通过激活纤溶酶原转化为纤溶酶来溶解血栓，还能直接降解纤维蛋白6- 来自远古花生虫的纤溶酶 Sipunculus nudus (sFE)6这种双功能特性使sFE相较于传统溶栓药物具有其他优势，尤其是在异常纤溶酶原状态下。与其他双功能纤溶剂相比7,8,9，与非食品来源的药物开发试剂....
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方案
1. 准备
- 样品处理
- 仔细解剖新鲜的 S. nudus（100 g），收集肠道及其内部液体。
- 加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行匀浆（1,000 rpm，60 s）。
- 反复冻融匀浆液 3 次。
- 离心样品（10,956 × g，0.5 h，4 °C），收集上清液。将样品置于 4 °C 保存，待后续使用。
- 蛋白质沉淀
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合，并于 4 °C 静置 12 h。
注意：本步骤可在此暂停，后续继续操作。 - 离心（10,956 × g，0.5 h，4 °C）以获得蛋白质沉淀；将其在 4 °C 保存，供后续使用。
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合，并于 4 °C 静置 12 h。
- 蛋白质重悬
- 用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液在 4 °C 保存，供后续使用。
2. 亲和层析
- 溶液过滤
- 将粗蛋白溶液通过 0.22 µm ....
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结果
按照本方案，提取了粗组织裂解液，构建了精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱和赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱，获得了纯化的sFE，并分别通过SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测了纯化sFE的纯度和纤溶活性。
离心后，收集的上清液为透明的浅褐色黏稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合时开始出现沉淀。静置12小时后，试管底部形成大量沉淀。将沉淀用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解于缓冲液中，呈现为透明的淡黄色液体。
当蛋白溶液上样至精氨酸-琼脂糖亲和层析柱时，约40分钟时出现一个明显的峰（峰1，穿流峰），至约66分钟时停止洗脱。在梯度洗脱阶段，使用0.15 M NaCl洗脱时，约94分钟时出现一个明显的峰（峰2，洗脱峰），至约110分钟时停止洗脱。在后续的洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中未出现明显的洗脱峰（图1A）。本研究中，我们重复使用精氨酸-琼脂糖亲和层析柱多达10次，发现柱子的性能未发生.......
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讨论
由于无法获得sFE的精确基因序列，目前使用的sFE是从新鲜的S. nudus14中提取的。此外，文献中报道的sFE纯化流程较为复杂且成本较高，这些方法基于sFE的一些通用特性，如分子量、等电点、离子强度和极性15,16。迄今为止，尚未有sFE的亲和纯化方案被报道。在本研究中，基于sFE晶体结构的知识，成功开发了一种亲和纯化方案。与已报道的纯化方法相比，该亲和纯化方法操作简便、成本低廉且易于使用。此外，采用该方法可显著提高活性sFE的回收率。
尽管已有多种纤溶酶亲和纯化方法的报道，但这些方法均基于抗体17、抑制剂18、配体和受体16。这些抗体、抑制剂、配体和受体的制备在技术上具有挑战性且费时费力。此外，还需额外步骤将这些分子偶联到基质上。相比之下，精氨酸-琼脂糖.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术厅（编号：2019J01070，编号：2021Y0027）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（29:1） | Biosharp | ||
| 2-巯基乙醇 | Solarbio | ||
| 琼脂糖 G-10 | Biowest | ||
| 过硫酸铵 | SINOPHARM | ||
| 硫酸铵 | SINOPHARM | ||
| 精氨酸-Sepharose 4B | Solarbio | 精氨酸-琼脂糖基质 | |
| 溴酚蓝（BPB） | Solarbio | ||
| 快速银染试剂盒 | Beyotime | ||
| 纤维蛋白原 | Merck | ||
| 甘氨酸 | Solarbio | ||
| 盐酸 | SINOPHARM | ||
| 激酶 | RHAWN | ||
| 赖氨酸-Sepharose 4B | Solarbio | 赖氨酸-琼脂糖基质 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma-Aldrich | ||
| 预染彩色蛋白质 Marker（10–170 kD） | Beyotime | ||
| 氯化钠 | SINOPHARM | ||
| 十二烷基磺酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | ||
| 氢氧化钠 | SINOPHARM | ||
| 凝血酶 | Meilunbio | ||
| 三（羟甲基）氨基甲烷 | Solarbio | ||
| 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐 | Solarbio | ||
| 仪器 | |||
| AKT Aprotein 纯化系统 pure | GE | ||
| MLS-3750 自动立式压力蒸汽灭菌器 | SANYO | ||
| 化学发光成像系统 | GE | ||
| BT-100 恒流泵 | QITE | ||
| 恒温培养箱 | JINGHONG | ||
| 3-30KS 台式冷冻离心机 | SIGMA | ||
| DGG-9140AD DHG 系列加热干燥烘箱 | SENXIN | ||
| DY89-II 电动玻璃匀浆器 | SCIENTZ | ||
| 电子分析天平 | DENVER | ||
| DK-S12 电热恒温水浴锅 | SENXIN | ||
| 水平脱色摇床 | Kylin-Bell | ||
| AF 103 制冰机 | Scotsman | ||
| KQ-500E 超声波清洗机 | ShuMei | ||
| 磁力搅拌器 | Zhi wei | ||
| H1650-W 微型冷冻离心机 | Cence | ||
| 微波炉 | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| 移液器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 精密台式 pH 计 | Sartorious | ||
| 小型旋涡振荡器 | Kylin-Bell | ||
| 垂直电泳系统 | Bio-Rad | ||
| 耗材 | |||
| 200 µL PCR 管（200 µL） | Axygene | ||
| 离心管（1.5 mL） | Biosharp | ||
| 离心管（5 mL） | Biosharp | ||
| 离心管（50 mL） | NEST | ||
| 离心管（7 mL） | Biosharp | ||
| 培养皿（60 mm） | NEST | ||
| 滤膜（0.22 µm） | Millex GP | ||
| 封口膜（Parafilm） | Bemis | ||
| 移液器吸头（1 mL） | KIRGEN | ||
| 移液器吸头（10 µL） | Axygene | ||
| 移液器吸头（200 µL） | Axygene | ||
| 专用指示试纸 | TZAKZY | ||
| 超滤离心管（15 mL，3 KDa） | Millipore | ||
| 超滤离心管（4 mL，3 KDa） | Millipore | ||
| 通用 pH 指示剂 | SSS Reagent |
参考文献
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
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重印与许可
