从海蛾中亲和纯化纤维蛋白溶解酶
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Summary
在这里，我们提出了一种来自 海蜥蜴 纤维蛋白溶解酶的亲和纯化方法，该方法简单、廉价且高效。
Abstract
海蕊纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活成 纤 溶酶，又能直接降解纤维蛋白，与传统溶栓剂相比具有很大的优势。然而，由于缺乏结构信息，所有sFE的纯化程序都基于多步色谱纯化，过于复杂和昂贵。本文首次基于sFE的晶体结构开发了sFE亲和纯化方案;它包括粗样品和赖氨酸/精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱的制备、亲和纯化和纯化 sFE 的表征。按照该方案，一批sFE可以在1天内纯化。此外，纯化的sFE的纯度和活性分别增加到92%和19，200 U/mL。因此，这是一种简单、廉价且高效的sFE纯化方法。该方案的开发对于sFE和其他类似药物的进一步利用具有重要意义。
Introduction
血栓形成是对公共卫生的主要威胁，尤其是在 Covid-19 全球大流行之后1，2。临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PA可以将患者的纤溶酶原激活为活性纤溶酶以降解纤维蛋白。因此，它们的溶栓效率受到患者纤溶酶原状态3，4的严重限制。纤维蛋白溶解剂，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一种临床溶栓药物，还包括纤溶酶（FE），如纤溶酶，可直接溶解凝块，但被各种纤溶酶抑制剂迅速灭活5。随后，报道了一种新型的纤维蛋白溶解剂，它不仅可以通过将纤溶酶原激活为纤溶酶，还可以直接降解纤维蛋白6-来自古代花生蠕虫Sipunculus nudus（sFE）的纤维蛋白溶解酶6来溶解血栓6。与传统的溶栓药物相比，这种双功能赋予了sFE其他优势，特别是在纤溶酶原状态异常方面。与其他双功能纤维蛋白溶解剂7，8，9相比，sFE在药物开发方面表现出几个优势，包括安全性，特别是对于口服药物。这是因为海蜥的生物安全性和生物相容性已经确立10.
与从微生物、蚯蚓和蘑菇中分离的其他天然纤维蛋白溶解剂类似，从裸蚯蚓中纯化sFE非常复杂，包括组织匀浆、硫酸铵沉淀、脱盐、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和分子筛等多个阶段10，11，12.这样的净化系统不仅要依靠熟练的技能和昂贵的材料，还需要几天的时间才能完成整个过程。因此，一个简单的sFE纯化方案对sFE的进一步发展具有重要意义。幸运的是，两个sFE晶体（PDB:8HZP;PDB:8HZO）已成功获得（见补充文件1和补充文件2）。通过结构分析和分子对接实验，我们发现sFE的催化核心可以特异性地与含有精氨酸或赖氨酸残基的靶标结合。
本文首次提出了一种基于sFE晶体结构的亲和纯化系统。通过遵循该方案，可以在单个亲和纯化阶段从粗提取物中纯化高纯度和高活性sFE。这里开发的方案不仅对sFE的大规模制备很重要，而且可用于纯化其他纤维蛋白溶解剂。
Protocol
1. 准备 样品处理仔细解剖新鲜的 裸粒链球菌 （100克）并收集肠道及其内部液体。 加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行均质化（1，000 rpm，60 s）。 将匀浆冻融3倍。 离心样品（10，956× g，0.5小时，4°C）并收集上清液。将样品储存在4°C直至进一步使用。 蛋白质沉淀将上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合，让混合物在4°C下静置12小时。注意:协议可以在此处暂停，稍后继续。 离心（10，956× g，0.5小时，4°C）得到蛋白质沉淀;将其储存在4°C以备后用。 蛋白质重悬用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液储存在4°C以备后用。 2. 亲和色谱 溶液过滤通过0.22μm滤膜过滤粗蛋白溶液。将此样品储存在4°C以备后用。 色谱柱填料将适量的赖氨酸-琼脂糖基质培养基和精氨酸-琼脂糖基质上样到5 mL空色谱柱中，将精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱装入5 mL空色谱柱中。注意:色谱柱可以储存在2-8°C，基质浸入储存缓冲液（20%乙醇）中。 亲和纯化首先用ddH2O平衡亲和色谱柱（1 mL/min，10柱体积），然后使用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，1 mL/min，5柱体积）。 将蛋白质溶液样品加载到预平衡柱（1 mL/min，1/3柱体积）上。注意:样品上样量取决于sFE的浓度。 用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，五柱体积）洗涤色谱柱。 依次用0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl（1 mL/min，5 个色谱柱体积）洗脱色谱柱。 寻找应出现在0.15 M NaCl洗脱中的洗脱峰，然后将馏分收集在5 mL管中。 使用3 kD超离心过滤器（3，944 × g，1.5小时，4°C）浓缩洗脱样品。将此样品储存在-80°C以备后用。 3. 纯度评估 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备根据Laemmli的方法使用5%浓缩凝胶和12%分离凝胶13制备SDS-PAGE凝胶。 电泳将样品（15μL）与5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1/4体积）混合，在沸水中加热5分钟，上样到SDS-PAGE凝胶上，并在80 V，60 mA下运行凝胶1.5小时。 分析电泳后，根据制造商的方案用银染试剂盒对凝胶进行染色，并使用化学发光成像系统观察染色凝胶。 使用以下公式分析目标蛋白质的纯度:目标蛋白质的纯度=目标蛋白质的强度值/总蛋白质的强度值。 4. 纤维蛋白溶解活性评估 纤维蛋白板制备通过将25mg纤维蛋白原与1.25mL生理盐水混合来制备纤维蛋白原溶液。 通过将100U凝血酶与1.05mL生理盐水完全混合来制备凝血酶溶液。 通过将 0.5 g 琼脂糖加入 22.5 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）中来制备琼脂糖溶液。混合并在100°C下加热琼脂糖溶液，直到完全溶解。 将琼脂糖溶液冷却至约50°C并加入纤维蛋白原溶液。然后，立即加入凝血酶溶液，快速混合，并将它们倒入60毫米培养皿中。 装载使用无菌钻孔器在准备好的纤维蛋白板上打孔 3 mm 孔，并用 10 μL 样品填充孔。 分析在37°C孵育18小时后，通过计算其降解区的大小来测量纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白溶解活性=（样品的区域大小/尿激酶的区域大小）x 100U.区域大小=直径x直径。注意:生理盐水缓冲液，粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）和尿激酶分别用于空白，阴性对照和阳性对照。与尿激酶相比，我们发现纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性为~19，200 U / mL。
Representative Results
按照该方案，提取粗组织裂解物，建立精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱，得到纯化的sFE，分别用SDS-PAGE和纤维蛋白板测定纯化sFE的纯度和纤维蛋白溶解活性。 离心后，收集的上清液为透明的棕褐色粘稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合时开始沉淀。静置12 h后，在管底形成重沉淀。当用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解在缓?…
Discussion
由于sFE的确切基因序列不可用，目前使用的sFE是从新鲜 的S. nudus14中提取的。此外，文献报道的sFE纯化程序复杂且昂贵，因为它们基于sFE的一些一般特征，如分子量，等电点，离子强度和极性15，16。迄今为止，尚未报道sFE的亲和纯化方案。本研究基于sFE晶体结构知识，成功开发了sFE亲和纯化方案。与报道的纯化方法相比，该亲?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究由厦门市科技局（3502Z20227197）和福建省科技局（编号:2019J01070，No.2021Y0027）资助。
Materials
| 30% Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Ammonium persulfate | SINOPHARM | ||
| Ammonium sulfate | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Arginine-agarose matrix | |
| Bromoxylenol Blue (BPB) | Solarbio | ||
| Fast Silver Stain Kit | Beyotime | ||
| Fibrinogen | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Hydrochloric acid | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | Lysine-agarose matrix | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| Prestained Color Protein Marker (10-170 kD) | Beyotime | ||
| Sodium chloride | SINOPHARM | ||
| Sodium Dodecyl Sulfonate (SDS) | Sigma-Aldrich | ||
| Sodium hydroxide | SINOPHARM | ||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride | Solarbio | ||
| <strong>Equipment</strong> | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer MLS-3750 | SANYO | ||
| Chemiluminescence Imaging System | GE | ||
| Constant Flow Pump BT-100 | QITE | ||
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | ||
| Desktop Refrigerated Centrifuge 3-30KS | SIGMA | ||
| DHG Series Heating and Drying Oven DGG-9140AD | SENXIN | ||
| Electric Glass Homogenizer DY89-II | SCIENTZ | ||
| Electronic Analytical Balance | DENVER | ||
| Electro-Thermostatic Water Bath DK-S12 | SENXIN | ||
| Horizontal Decolorization Shaker | Kylin-Bell | ||
| Ice Machine AF 103 | Scotsman | ||
| KQ-500E Ultrasonic Cleaner | ShuMei | ||
| Magnetic Stirrer | Zhi wei | ||
| Micro Refrigerated Centrifuge H1650-W | Cence | ||
| Microwave Oven | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| Pipettor | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precision Desktop pH Meter | Sartorious | ||
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | ||
| Vertical Electrophoresis System | Bio-Rad | ||
| <strong>Consumable Material </strong> | |||
| 200 µL PCR Tube (200 µL) | Axygene | ||
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (5 mL) | Biosharp | ||
| Centrifuge Tube (50 mL) | NEST | ||
| Centrifuge Tube (7 mL) | Biosharp | ||
| Culture Dish (60 mm) | NEST | ||
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| Pipette Tip (1 mL ) | KIRGEN | ||
| Pipette Tip (10 µL) | Axygene | ||
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | TZAKZY | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Ultra Centrifugal Filter Unit (4 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| Universal pH Indicator | SSS Reagent |
References
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Cite This Article
Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus. J. Vis. Exp. (196), e65631, doi:10.3791/65631 (2023).