本文介绍一种从无疣星虫（Sipunculus nudus）中分离纤溶酶的亲和纯化方法，该方法简便、经济且高效。
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本文内容
摘要
摘要
Sipunculus nudus来源的纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活为纤溶酶，又能直接降解纤维蛋白，相较于传统溶栓药物具有显著优势。然而，由于缺乏结构信息，目前所有sFE的纯化方案均依赖多步层析纯化，过程过于复杂且成本较高。本文首次基于sFE的晶体结构开发了一种亲和纯化方案，包括粗提样品的制备、赖氨酸/精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱的制备、亲和纯化及纯化后sFE的表征。按照本方案，可在1天内完成一批sFE的纯化。此外，纯化后sFE的纯度和活性分别达到92%和 19,200 U/mL 。因此，该方法是一种简便、经济且高效的sFE纯化策略。本方案的建立对于sFE及其他类似药物的进一步应用具有重要意义。
引言
血栓形成是公共卫生的主要威胁，尤其是在全球新冠疫情之后1,2临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PAs 可将患者体内的纤溶酶原激活为具有活性的纤溶酶，从而降解纤维蛋白。因此，其溶栓效率在很大程度上受限于患者的纤溶酶原状态3,4纤溶药物，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一类临床溶栓药物，还包括纤溶酶类（FE）如纤溶酶，可直接溶解血栓，但会迅速被多种纤溶酶抑制剂失活5随后，有研究报道了一种新型溶栓剂，其不仅可通过激活纤溶酶原转化为纤溶酶来溶解血栓，还能直接降解纤维蛋白6- 来自远古花生虫的纤溶酶 Sipunculus nudus (sFE)6这种双功能特性使sFE相较于传统溶栓药物具有其他优势，尤其是在异常纤溶酶原状态下。与其他双功能纤溶剂相比7,8,9，与非食品来源的药物开发试剂相比，sFE 在药物研发中具有多项优势，尤其是在口服药物方面表现出更高的安全性。这是因为 sFE 具有良好的生物安全性和生物相容性 Sipunculus nudus 已得到充分确立10.
与其他从微生物、蚯蚓和蘑菇中分离得到的天然纤溶酶类似，来自 S. nudus 的sFE纯化过程非常复杂，包含多个步骤，如组织匀浆、硫酸铵沉淀、脱盐、阴离子交换层析、疏水相互作用层析以及分子筛层析10,11,12。该纯化体系不仅依赖熟练的技术和昂贵的材料，而且需要数天时间才能完成整个流程。因此，建立一种简便的sFE纯化方案对其进一步开发具有重要意义。幸运的是，我们已成功获得sFE的两种晶体（PDB: 8HZP；PDB: 8HZO）（见补充文件1和补充文件2）。通过结构分析和分子对接实验，我们发现sFE的催化核心能够特异性结合含有精氨酸或赖氨酸残基的底物。
本文首次提出了一种基于sFE晶体结构的亲和纯化系统。通过遵循本方案，可从粗提物中经单步亲和纯化获得高纯度且高活性的sFE。本研究所建立的方案不仅对sFE的大规模制备具有重要意义，还可能适用于其他纤溶剂的纯化。
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方案
1. 准备
- 样品处理
- 仔细解剖新鲜的 S. nudus（100 g），收集肠道及其内部液体。
- 加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行匀浆（1,000 rpm，60 s）。
- 反复冻融匀浆液 3 次。
- 离心样品（10,956 × g，0.5 h，4 °C），收集上清液。将样品置于 4 °C 保存，待后续使用。
- 蛋白质沉淀
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合，并于 4 °C 静置 12 h。
注意：本步骤可在此暂停，后续继续操作。 - 离心（10,956 × g，0.5 h，4 °C）以获得蛋白质沉淀；将其在 4 °C 保存，供后续使用。
- 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合，并于 4 °C 静置 12 h。
- 蛋白质重悬
- 用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液在 4 °C 保存，供后续使用。
2. 亲和层析
- 溶液过滤
- 将粗蛋白溶液通过 0.22 µm 滤膜过滤。将此样品在 4 °C 下保存以供后续使用。
- 柱子填装
- 通过将适量的赖氨酸-琼脂糖基质介质和精氨酸-琼脂糖基质介质装入 5 mL 空层析柱中，制备赖氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱和精氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。
注意：层析柱可于 2–8 °C 保存，基质需浸没于保存缓冲液（20% 乙醇）中。
- 通过将适量的赖氨酸-琼脂糖基质介质和精氨酸-琼脂糖基质介质装入 5 mL 空层析柱中，制备赖氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱和精氨酸-琼脂糖基质亲和层析柱。
- 亲和纯化
- 先用 ddH2O 平衡亲和层析柱（1 mL/min，10 个柱体积），随后用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 8.0，1 mL/min，5 个柱体积）继续平衡。
- 将蛋白溶液样品上样至预先平衡好的层析柱中（1 mL/min，1/3 柱体积）。
注意：上样体积取决于 sFE 的浓度。 - 用 Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 8.0）洗涤层析柱（5 个柱体积）。
- 依次用 0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M 和 0.65 M NaCl 溶液（1 mL/min，各 5 个柱体积）进行梯度洗脱。
- 观察应在 0.15 M NaCl 洗脱组分中出现的洗脱峰，并将各组分收集至 5 mL 离心管中。
- 使用 3 kD 超滤离心管对洗脱样品进行浓缩（3,944 × g，1.5 小时，4 °C）。将浓缩后的样品于 -80 °C 保存以供后续使用。
3. 纯度评估
- 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备
- 根据 Laemmli 方法制备 SDS-PAGE 凝胶，使用 5% 浓缩胶和 12% 分离胶13。
- 电泳
- 将样品（15 µL）与 5 倍浓度的 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（1/4 体积）混合，在沸水中加热 5 分钟，上样至 SDS-PAGE 凝胶，以 80 V、60 mA 电压电流条件电泳运行 1.5 小时。
- 分析
- 电泳结束后，按照试剂盒生产商的说明书使用银染试剂盒对凝胶进行染色，并使用化学发光成像系统观察染色后的凝胶。
- 使用以下公式分析目标蛋白的纯度：目标蛋白纯度 = 目标蛋白强度值 / 总蛋白强度值。
4. 纤溶活性评价
- 纤维蛋白平板制备
- 通过将 25 mg 纤维蛋白原与 1.25 mL 生理盐水混合，制备纤维蛋白原溶液。
- 通过将 100 U 凝血酶与 1.05 mL 生理盐水充分混合，制备凝血酶溶液。
- 将 0.5 g 琼脂糖加入 22.5 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）中，制备琼脂糖溶液。混合后在 100 °C 加热琼脂糖溶液，直至完全溶解。
- 将琼脂糖溶液冷却至约 50 °C，加入纤维蛋白原溶液。然后立即加入凝血酶溶液，迅速混合，并倒入 60 mm 培养皿中。
- 加样
- 使用无菌打孔器在制备好的纤维蛋白平板上打 3 mm 孔，每孔加入 10 µL 样品。
- 分析
- 在 37 °C 培养 18 小时后，通过计算样品降解区的大小来测定纤溶活性。纤溶活性 =（样品降解区大小 / 尿激酶降解区大小）× 100 U。降解区大小 = 直径 × 直径。
注：生理盐水缓冲液、粗提蛋白（方案步骤 1.3.1 获得的样品）和尿激酶分别用作空白对照、阴性对照和阳性对照。与尿激酶相比，我们发现纯化的 sFE 的纤溶活性约为 19,200 U/mL。
- 在 37 °C 培养 18 小时后，通过计算样品降解区的大小来测定纤溶活性。纤溶活性 =（样品降解区大小 / 尿激酶降解区大小）× 100 U。降解区大小 = 直径 × 直径。
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结果
按照本方案，提取了粗组织裂解液，构建了精氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱和赖氨酸-琼脂糖凝胶亲和层析柱，获得了纯化的sFE，并分别通过SDS-PAGE和纤维蛋白平板法检测了纯化sFE的纯度和纤溶活性。
离心后，收集的上清液为透明的浅褐色黏稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九倍体积）混合时开始出现沉淀。静置12小时后，试管底部形成大量沉淀。将沉淀用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解于缓冲液中，呈现为透明的淡黄色液体。
当蛋白溶液上样至精氨酸-琼脂糖亲和层析柱时，约40分钟时出现一个明显的峰（峰1，穿流峰），至约66分钟时停止洗脱。在梯度洗脱阶段，使用0.15 M NaCl洗脱时，约94分钟时出现一个明显的峰（峰2，洗脱峰），至约110分钟时停止洗脱。在后续的洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中未出现明显的洗脱峰（图1A）。本研究中，我们重复使用精氨酸-琼脂糖亲和层析柱多达10次，发现柱子的性能未发生...
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讨论
由于无法获得sFE的精确基因序列，目前使用的sFE是从新鲜的S. nudus14中提取的。此外，文献中报道的sFE纯化流程较为复杂且成本较高，这些方法基于sFE的一些通用特性，如分子量、等电点、离子强度和极性15,16。迄今为止，尚未有sFE的亲和纯化方案被报道。在本研究中，基于sFE晶体结构的知识，成功开发了一种亲和纯化方案。与已报道的纯化方法相比，该亲和纯化方法操作简便、成本低廉且易于使用。此外，采用该方法可显著提高活性sFE的回收率。
尽管已有多种纤溶酶亲和纯化方法的报道，但这些方法均基于抗体17、抑制剂18、配体和受体16。这些抗体、抑制剂、配体和受体的制备在技术上具有挑战性且费时费力。此外，还需额外步骤将这些分子偶联到基质上。相比之下，精氨酸-琼脂糖...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究由厦门市科学技术局（3502Z20227197）和福建省科学技术厅（编号：2019J01070，编号：2021Y0027）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺（29:1） | Biosharp | ||
| 2-巯基乙醇 | Solarbio | ||
| 琼脂糖 G-10 | Biowest | ||
| 过硫酸铵 | SINOPHARM | ||
| 硫酸铵 | SINOPHARM | ||
| 精氨酸-Sepharose 4B | Solarbio | 精氨酸-琼脂糖基质 | |
| 溴酚蓝（BPB） | Solarbio | ||
| 快速银染试剂盒 | Beyotime | ||
| 纤维蛋白原 | Merck | ||
| 甘氨酸 | Solarbio | ||
| 盐酸 | SINOPHARM | ||
| 激酶 | RHAWN | ||
| 赖氨酸-Sepharose 4B | Solarbio | 赖氨酸-琼脂糖基质 | |
| N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED） | Sigma-Aldrich | ||
| 预染彩色蛋白质 Marker（10–170 kD） | Beyotime | ||
| 氯化钠 | SINOPHARM | ||
| 十二烷基磺酸钠（SDS） | Sigma-Aldrich | ||
| 氢氧化钠 | SINOPHARM | ||
| 凝血酶 | Meilunbio | ||
| 三（羟甲基）氨基甲烷 | Solarbio | ||
| 三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐 | Solarbio | ||
| 仪器 | |||
| AKT Aprotein 纯化系统 pure | GE | ||
| MLS-3750 自动立式压力蒸汽灭菌器 | SANYO | ||
| 化学发光成像系统 | GE | ||
| BT-100 恒流泵 | QITE | ||
| 恒温培养箱 | JINGHONG | ||
| 3-30KS 台式冷冻离心机 | SIGMA | ||
| DGG-9140AD DHG 系列加热干燥烘箱 | SENXIN | ||
| DY89-II 电动玻璃匀浆器 | SCIENTZ | ||
| 电子分析天平 | DENVER | ||
| DK-S12 电热恒温水浴锅 | SENXIN | ||
| 水平脱色摇床 | Kylin-Bell | ||
| AF 103 制冰机 | Scotsman | ||
| KQ-500E 超声波清洗机 | ShuMei | ||
| 磁力搅拌器 | Zhi wei | ||
| H1650-W 微型冷冻离心机 | Cence | ||
| 微波炉 | Galanz | ||
| Milli-Q Reference | Millipore | ||
| 移液器 | Thermo Fisher Scientific | ||
| 精密台式 pH 计 | Sartorious | ||
| 小型旋涡振荡器 | Kylin-Bell | ||
| 垂直电泳系统 | Bio-Rad | ||
| 耗材 | |||
| 200 µL PCR 管（200 µL） | Axygene | ||
| 离心管（1.5 mL） | Biosharp | ||
| 离心管（5 mL） | Biosharp | ||
| 离心管（50 mL） | NEST | ||
| 离心管（7 mL） | Biosharp | ||
| 培养皿（60 mm） | NEST | ||
| 滤膜（0.22 µm） | Millex GP | ||
| 封口膜（Parafilm） | Bemis | ||
| 移液器吸头（1 mL） | KIRGEN | ||
| 移液器吸头（10 µL） | Axygene | ||
| 移液器吸头（200 µL） | Axygene | ||
| 专用指示试纸 | TZAKZY | ||
| 超滤离心管（15 mL，3 KDa） | Millipore | ||
| 超滤离心管（4 mL，3 KDa） | Millipore | ||
| 通用 pH 指示剂 | SSS Reagent |
参考文献
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