从海蛾中亲和纯化纤维蛋白溶解酶

摘要

在这里，我们提出了一种来自 海蜥蜴 纤维蛋白溶解酶的亲和纯化方法，该方法简单、廉价且高效。

摘要

海蕊纤溶酶（sFE）是一种新型纤溶剂，既能将纤溶酶原激活成 纤 溶酶，又能直接降解纤维蛋白，与传统溶栓剂相比具有很大的优势。然而，由于缺乏结构信息，所有sFE的纯化程序都基于多步色谱纯化，过于复杂和昂贵。本文首次基于sFE的晶体结构开发了sFE亲和纯化方案;它包括粗样品和赖氨酸/精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱的制备、亲和纯化和纯化 sFE 的表征。按照该方案，一批sFE可以在1天内纯化。此外，纯化的sFE的纯度和活性分别增加到92%和19，200 U/mL。因此，这是一种简单、廉价且高效的sFE纯化方法。该方案的开发对于sFE和其他类似药物的进一步利用具有重要意义。

引言

血栓形成是对公共卫生的主要威胁，尤其是在 Covid-19 全球大流行之后^1，2。临床上，许多纤溶酶原激活剂（PAs），如组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶（UK），已被广泛用作溶栓药物。PA可以将患者的纤溶酶原激活为活性纤溶酶以降解纤维蛋白。因此，它们的溶栓效率受到患者纤溶酶原状态^3，4的严重限制。纤维蛋白溶解剂，如金属蛋白酶纤溶酶和丝氨酸纤溶酶，是另一种临床溶栓药物，还包括纤溶酶（FE），如纤溶酶，可直接溶解凝块，但被各种纤溶酶抑制剂迅速灭活⁵。随后，报道了一种新型的纤维蛋白溶解剂，它不仅可以通过将纤溶酶原激活为纤溶酶，还可以直接降解纤维蛋白⁶-来自古代花生蠕虫Sipunculus nudus（^sFE）的纤维蛋白溶解酶6来溶解血栓6。与传统的溶栓药物相比，这种双功能赋予了sFE其他优势，特别是在纤溶酶原状态异常方面。与其他双功能纤维蛋白溶解剂⁷，⁸，⁹相比，sFE在药物开发方面表现出几个优势，包括安全性^，特别是对于口服药物。这是因为海蜥的生物安全性和生物相容性已经确立¹⁰.

与从微生物、蚯蚓和蘑菇中分离的其他天然纤维蛋白溶解剂类似，从裸蚯蚓中纯化sFE非常复杂，包括组织匀浆、硫酸铵沉淀、脱盐、阴离子交换色谱、疏水相互作用色谱和分子筛等多个阶段¹⁰，^11，12.这样的净化系统不仅要依靠熟练的技能和昂贵的材料，还需要几天的时间才能完成整个过程。因此，一个简单的sFE纯化方案对sFE的进一步发展具有重要意义。幸运的是，两个sFE晶体（PDB:8HZP;PDB:8HZO）已成功获得（见补充文件1和补充文件2）。通过结构分析和分子对接实验，我们发现sFE的催化核心可以特异性地与含有精氨酸或赖氨酸残基的靶标结合。

本文首次提出了一种基于sFE晶体结构的亲和纯化系统。通过遵循该方案，可以在单个亲和纯化阶段从粗提取物中纯化高纯度和高活性sFE。这里开发的方案不仅对sFE的大规模制备很重要，而且可用于纯化其他纤维蛋白溶解剂。

方案

1. 准备

1. 样品处理
   1. 仔细解剖新鲜的 裸粒链球菌 （100克）并收集肠道及其内部液体。
   2. 加入 300 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）进行均质化（1，000 rpm，60 s）。
   3. 将匀浆冻融3倍。
   4. 离心样品（10，956× g，0.5小时，4°C）并收集上清液。将样品储存在4°C直至进一步使用。
2. 蛋白质沉淀
   1. 将上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合，让混合物在4°C下静置12小时。
      注意:协议可以在此处暂停，稍后继续。
   2. 离心（10，956× g，0.5小时，4°C）得到蛋白质沉淀;将其储存在4°C以备后用。
3. 蛋白质重悬
   1. 用 30 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 M，pH 7.4）重悬蛋白质沉淀。将此粗蛋白溶液储存在4°C以备后用。

2. 亲和色谱

1. 溶液过滤
   1. 通过0.22μm滤膜过滤粗蛋白溶液。将此样品储存在4°C以备后用。
2. 色谱柱填料
   1. 将适量的赖氨酸-琼脂糖基质培养基和精氨酸-琼脂糖基质上样到5 mL空色谱柱中，将精氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱装入5 mL空色谱柱中。
      注意:色谱柱可以储存在2-8°C，基质浸入储存缓冲液（20%乙醇）中。
3. 亲和纯化
   1. 首先用ddH₂O平衡亲和色谱柱（1 mL/min，10柱体积），然后使用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，1 mL/min，5柱体积）。
   2. 将蛋白质溶液样品加载到预平衡柱（1 mL/min，1/3柱体积）上。
      注意:样品上样量取决于sFE的浓度。
   3. 用Tris-HCl缓冲液（0.02 M，pH 8.0，五柱体积）洗涤色谱柱。
   4. 依次用0.15 M、0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl（1 mL/min，5 个色谱柱体积）洗脱色谱柱。
   5. 寻找应出现在0.15 M NaCl洗脱中的洗脱峰，然后将馏分收集在5 mL管中。
   6. 使用3 kD超离心过滤器（3，944 × g，1.5小时，4°C）浓缩洗脱样品。将此样品储存在-80°C以备后用。

3. 纯度评估

1. 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶制备
   1. 根据Laemmli的方法使用5%浓缩凝胶和12%分离凝胶¹³制备SDS-PAGE凝胶。
2. 电泳
   1. 将样品（15μL）与5x SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（1/4体积）混合，在沸水中加热5分钟，上样到SDS-PAGE凝胶上，并在80 V，60 mA下运行凝胶1.5小时。
3. 分析
   1. 电泳后，根据制造商的方案用银染试剂盒对凝胶进行染色，并使用化学发光成像系统观察染色凝胶。
   2. 使用以下公式分析目标蛋白质的纯度:目标蛋白质的纯度=目标蛋白质的强度值/总蛋白质的强度值。

4. 纤维蛋白溶解活性评估

1. 纤维蛋白板制备
   1. 通过将25mg纤维蛋白原与1.25mL生理盐水混合来制备纤维蛋白原溶液。
   2. 通过将100U凝血酶与1.05mL生理盐水完全混合来制备凝血酶溶液。
   3. 通过将 0.5 g 琼脂糖加入 22.5 mL Tris-HCl 缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）中来制备琼脂糖溶液。混合并在100°C下加热琼脂糖溶液，直到完全溶解。
   4. 将琼脂糖溶液冷却至约50°C并加入纤维蛋白原溶液。然后，立即加入凝血酶溶液，快速混合，并将它们倒入60毫米培养皿中。
2. 装载
   1. 使用无菌钻孔器在准备好的纤维蛋白板上打孔 3 mm 孔，并用 10 μL 样品填充孔。
3. 分析
   1. 在37°C孵育18小时后，通过计算其降解区的大小来测量纤维蛋白溶解活性。纤维蛋白溶解活性=（样品的区域大小/尿激酶的区域大小）x 100U.区域大小=直径x直径。
      注意:生理盐水缓冲液，粗蛋白（在方案步骤1.3.1中获得的样品）和尿激酶分别用于空白，阴性对照和阳性对照。与尿激酶相比，我们发现纯化的sFE的纤维蛋白溶解活性为~19，200 U / mL。

结果

按照该方案，提取粗组织裂解物，建立精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖基质亲和色谱柱，得到纯化的sFE，分别用SDS-PAGE和纤维蛋白板测定纯化sFE的纯度和纤维蛋白溶解活性。

离心后，收集的上清液为透明的棕褐色粘稠液体。当该上清液与饱和硫酸铵溶液（九体积）混合时开始沉淀。静置12 h后，在管底形成重沉淀。当用Tris-HCl缓冲液重悬时，蛋白质沉淀迅速消失并溶解在缓冲液中，呈透明的淡黄色液体。

当将蛋白质溶液上样到精氨酸-琼脂糖基质亲和柱上时，~40 min处出现明显的峰（峰1，流出峰），并在~66 min停止洗脱。在梯度洗脱阶段，当用0.15 M NaCl洗脱时，在~94 min处出现明显的峰（峰2，洗脱峰），并在~110 min停止洗脱。在剩余的洗脱阶段（0.25 M、0.35 M、0.45 M、0.55 M和0.65 M NaCl）中没有出现明显的洗脱峰（图1A）。在这项研究中，我们重复使用精氨酸-琼脂糖基质亲和柱多达10次，发现色谱柱的性能没有显着变化。

讨论

由于sFE的确切基因序列不可用，目前使用的sFE是从新鲜 的S. nudus¹⁴中提取的。此外，文献报道的sFE纯化程序复杂且昂贵，因为它们基于sFE的一些一般特征，如分子量，等电点，离子强度和极性^15，16。迄今为止，尚未报道sFE的亲和纯化方案。本研究基于sFE晶体结构知识，成功开发了sFE亲和纯化方案。与报道的纯化方法相比，该亲和纯化方法操作简便、价格低廉且用户友好。此外，使用该方法观察到活性sFE的回收率相当高。

尽管已经报道了许多纤维蛋白溶解酶的亲和纯化方法，但它们基于抗体¹⁷，抑制剂18，配体和受体¹⁶。这些抗体、抑制剂、配体和受体的制备在技术上具有挑战性且费力。此外，将这些分子与基质结合需要额外的努力。相比之下，精氨酸-琼脂糖基质和赖氨酸-琼脂糖...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺 （29：1）	Biosharp
2-巯基乙醇	Solarbio
琼脂糖 G-10	Biowest
过硫酸铵	SINOPHARM
精氨酸-琼脂糖 4B	Solarbio	精氨酸-琼脂糖基质
溴氧甲酚蓝 （BPB）	Solarbio
Fast Silver Stain Kit	Beyotime
纤维蛋白原	Merck
甘氨酸	Solarbio
盐酸	SINOPHARM
激酶	RHAWN
赖氨酸-琼脂糖凝胶 4B	Solarbio	赖氨酸-琼脂糖基质
N，N，N'，N'-四甲基乙二胺 （TEMED）	Sigma-Aldrich
预染彩色蛋白标志物 （10-170 kD）	Beyotime
氯化钠	SINOPHARM
十二烷基磺酸钠 （SDS）	Sigma-Aldrich
氢氧化	钠中药
凝血酶	美伦生物
三（羟甲基） 氨基甲烷	Solarbio
三（羟甲基） 氨基甲烷盐酸盐	Solarbio
设备
AKT 无蛋白纯化系统 纯	GE
自动立式压力蒸汽灭菌器 MLS-3750	三洋
化学发光成像系统	GE
恒流泵 BT-100	QITE
恒温培养箱	精宏
台式冷冻离心机 3-30KS	SIGMA
DHG 系列 加热干燥箱DGG-9140AD	SENXIN
电动玻璃均质机 DY89-II	SCIENTZ
电子分析天平	DENVER
电热恒温水浴 DK-S12	SENXIN
卧式脱色摇	Kylin-Bell
制冰机 AF 103	Scotsman
KQ-500E 超声波清洗	舒美
磁力搅拌器	智伟
微量冷冻离心机 H1650-W	Cence
微波炉	格兰仕
Milli-Q 参考	Millipore
移液器	Thermo Fisher Scientific
精密台式 pH 计	Sartorious
小型涡旋振荡器	Kylin-Bell
垂直电泳系统	Bio-Rad
消耗材料
200 和微;L PCR 管 （200 µL）	Axygene
离心管 （1.5 mL）	Biosharp
离心管 （5 mL）	Biosharp
离心管 （50 mL）	NEST
离心管 （7 mL）	Biosharp
培养皿 （60 mm）	NEST
滤膜 （0.22 µm）	Millex GP
Parafilm	Bemis
移液器吸头 （1 mL）	KIRGEN
移液器吸头 （10 µL）	Axygene
移液器吸头 （200 µL）	Axygene
特殊指示纸	TZAKZY
Ultra 离心过滤装置 （15 mL 3 KDa）	Millipore
Ultra 离心过滤装置 （4 mL 3 KDa）	Millipore
通用型 pH 指示剂	SSS 试剂