社会威胁-安全测试揭示心理社会应激相关表型

摘要

社会威胁-安全测试能够同时评估社交回避行为的发展，以此作为厌恶性条件学习的测量指标，以及社会威胁-安全辨别能力，这两项指标均用于在单一群体的慢性社会挫败雄性小鼠中识别出应激易感型和应激抵抗型个体。

摘要

社会压力是导致精神障碍发生的主要因素。为了提高临床前研究的转化价值，小鼠所经历的社会压力及其行为影响应与人类具有可比性。慢性社会挫败（CSD）是一种利用身体攻击和感官威胁等社会压力来诱导类似人类情感障碍的心理功能异常的方法。为增强CSD中的心理社会成分，采用为期10天的CSD方案，其中每日的身体攻击被标准化为3次、每次10秒的攻击事件，随后进入24小时的感官威胁阶段。经过10天^th 感觉阶段，CSD方案之后采用一种称为社会威胁-安全测试（STST）的优化行为学检测方法。应激后行为学检测需明确社会应激源在何种程度上以及以何种方式影响了动物行为。STST使经历慢性社会挫败的雄性小鼠与两个新的雄性个体（社会目标）进行互动：其中一个来自CSD期间遭遇的攻击品系，另一个来自新的品系。这两个社会目标被同时放置于三室测试装置的不同隔间中。该测试可同时评估社会回避行为的发展，以衡量厌恶性条件学习的成功程度以及社会威胁与安全的辨别能力。对两个品系均出现社会回避，反映的是泛化的厌恶反应，因而作为应激易感性的测量指标；而仅对攻击品系产生社会回避，则反映威胁与安全的辨别能力，因而作为应激韧性的测量指标。最后，对攻击品系未表现出社会回避，则提示厌恶性条件学习受损。本方案旨在通过引入具有转化意义的评估标准——即威胁-安全辨别能力和厌恶反应泛化——对目前使用的慢性社会挫败小鼠模型进行优化，从而将一组经历慢性社会挫败的动物进一步细分为韧性与易感亚群，最终推动未来转化医学研究的发展。

引言

应激（stress）是指由生理或心理刺激引起的稳态失衡¹。应激是导致创伤后应激障碍、抑郁症和焦虑症等精神疾病发生的重要已知风险因素^2,3。特别是社会性应激，被认为是与应激相关精神疾病发展密切相关的主要风险因素⁴。在研究中备受关注的一种社会性应激类型是社会从属应激（social subordination stress）⁵。与人类相似，小鼠能够表现出丰富多样的社会行为⁶，因此适用于涉及社会应激的研究。在实验室环境中，当成年小鼠群养时，它们会建立起包含等级结构的社会体系⁷。基于此，研究人员设计了群体模型（colony model），用于研究混合性别小鼠群体中自然形成的社会等级结构的影响⁸。多年来，为利用社会从属应激，已发展出多种群体模型的变体，包括同性别群体模型、社会不稳定模型以及入侵者-群体模型。然而近年来，一种被称为“雄性定居者-入侵者模型”（male resident-intruder model）的特定变体在文献中被广泛采用，该模型将社会复杂性简化为仅包含两只小鼠：一只定居者（resident）和一只入侵者（intruder）。实验关注的对象即“入侵者”，被放入一只体型更大、年龄更长且已退役的种鼠笼中，后者被称为“定居者”或“攻击者”。定居者会通过身体攻击入侵者以确立社会等级，从而形成定居者为优势个体、入侵者为从属个体的社会结构。若此类对抗为单次事件，则归类为"急性"（即"急性社会挫败模型"）；而持续数天（通常为10天）的重复性对抗则被称为"慢性"（即"慢性社会挫败模型"）。在慢性社会挫败（CSD）模型中，攻击是间歇性的，通常限制在每次5-10分钟⁹，这一阶段称为“身体接触阶段”（physical phase）。在身体接触阶段结束后，入侵者与定居者在夜间仍被共同饲养于同一笼具中，但通过网状隔板将笼子一分为二，允许除直接身体接触外的所有形式互动。这种设置被称为“感官阶段”（sensory phase），其通过持续存在的威胁性刺激而非直接身体对抗来诱导应激反应。2018年，van der Kooij 及其同事提出了一种改良的慢性社会挫败处理方法，通过标准化并严格限制身体接触阶段的时间，以更聚焦于模型中的心理社会成分¹⁰。该改良模型将身体攻击限制为三次、每次10秒的短暂接触，每次由不同的定居者执行，且两次攻击之间间隔15分钟的感官阶段。在第三次身体接触后，感官阶段持续整个夜晚。此循环连续重复10天，每天使用新的定居者。这种改良处理增强了慢性社会挫败模型的转化有效性，因为入侵者所遭受的身体伤害被最小化，同时因身体攻击持续时间差异导致的结果变异性也得以降低。

由于CSD模型被用于研究与压力相关的疾病（例如抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍），因此常选择行为学检测作为后续分析手段，包括但不限于攻击性、记忆和快感缺失等行为检测。近年来，小鼠在经历CSD处理后的行为检测通常用于评估社交能力受到的影响程度及其表现方式⁹。社交性（sociability）被定义为小鼠倾向于与同种个体进行社交互动而非回避社交的先天偏好。由于社交性易受压力影响，因此已建立专门用于评估社交回避发展的行为检测方法。由压力诱导的社交回避具有临床转化意义，因为它模拟了人类社交焦虑症和抑郁症的主要行为症状之一¹¹。与人类相似，并非所有小鼠在经历CSD处理后都会表现出社交回避，这提示个体在应激反应中存在差异性。Cohen及其同事提出，采用行为学阈值标准是研究个体差异神经生物学机制的一种有前景的方法¹²。根据行为表现对动物进行筛选并分组，为基因-环境交互研究提供了基础。随后，不同亚群常表现出特定遗传变异/修饰的显著富集，这些遗传特征可在不同环境条件下进一步研究¹³。因此，依据个体在社交回避发展上的差异性，可将一组长期遭受社交挫败的雄性小鼠划分为两个亚群：应激易感型（表现为社交回避）和应激抵抗型（表现为无社交回避^9,14）。然而，将小鼠社交回避表型解释为适应不良或适应性行为时，应结合整体实验处理（此处为CSD）及后续行为检测的具体情境进行综合判断。此外，理想的后续行为检测应不仅限于评估社交回避的发展，还应涵盖社交性的其他方面。我们近期的研究揭示了条件学习在CSD诱导的社交回避中的作用¹⁵。具体而言，CSD诱导的社交回避是一种对“居民鼠”品系特征形成的厌恶性条件化反应，其中“居民鼠”的特征作为条件刺激，而其攻击行为则作为非条件刺激。此外，在社交回避亚群中，部分个体能够区分厌恶性“居民鼠”品系的特征与其它安全新奇品系的特征，而另一些个体则对两种品系均表现出泛化的社交回避。本文提出一种改进的CSD后行为检测方法：社交威胁-安全测试（Social Threat-Safety Test, STST）¹⁵。与其它社交互动测试⁹不同，STST能够在同一实验中同时评估社交回避的发展（作为厌恶性条件化反应正确形成的指标，即条件学习成功）以及社交威胁-安全辨别能力，这两项指标共同用于在一组长期遭受社交挫败的雄性小鼠中识别应激易感型与应激抵抗型个体。通过评估社交威胁-安全辨别能力与厌恶反应泛化之间的差异，可进一步拓展用于将慢性社交挫败动物群体划分为抵抗型与易感型亚群的转化医学分类标准。

方案

所有操作均按照欧洲共同体关于实验动物护理和使用的理事会指令进行，并经当地主管部门（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz）批准。图1展示了示意图时间线。

1. 处理

1. 目标动物：获取7周龄的C57BL6/J雄性小鼠，到达后置于温度和湿度受控的环境中单独饲养，光照-黑暗周期为12小时（光照开启：8:00；光照关闭：20:00；23 °C；38%湿度），自由摄食和饮水。
2. 慢性社交挫败（CSD）
   1. 治疗组
      1. 经过1周的适应期后，使用CD-1品系作为攻击者品系，连续10天进行CSD处理（详细方案请参见慢性社会挫败）⁹ 以及改良的慢性社交挫败处理¹⁰).
      2. 将C57BL/6J小鼠放入CD-1小鼠的笼中，记录其10秒内的身体攻击行为。重复该过程三次，每次使用不同的CD-1小鼠，并以15分钟的间隔分开各次实验。
      3. 在这些时间段内，在C57BL6/J小鼠与CD-1小鼠之间放置网状隔板，仅允许感官接触。在第三次刺激事件后，将C57BL6/J小鼠在CD-1小鼠的笼内过夜饲养，两者之间用网状隔板分隔。重复此操作10天。
         注意：CD-1小鼠数量 = C57BL6/J小鼠数量 + 1。若经处理的C57BL6/J小鼠数量少于10只，则仍需至少10只CD-1小鼠，以确保在10天处理期间，每天最后一个感觉阶段（持续过夜）均与一只新的CD-1小鼠进行。
      4. 在10天内密切评估动物的生理健康状况。若动物遭受严重损伤，出于伦理及科学原因（治疗后测试中的活动能力/行为表现），应将其排除在实验之外。 表1 提供一份健康状况检查清单。
   2. 对照组
      1. 到达后，将同龄小鼠置于与处理组相同的条件下饲养。
      2. 经过1周的适应期后，将对照组动物放入一个空笼中持续90秒，随后将其放回由金属网壁隔开的单独笼具中（单只饲养），网壁与处理组所用的相同。此操作需在10天处理期间每日与处理组同步进行。
         注意：建议将对照组和处理组分别饲养在不同的房间。
3. 最后一次（10^th) 感觉期：将所有小鼠单只饲养于新笼具中，环境条件与到达后所述条件相似，静置过夜。
   注意：最后的感觉阶段应持续24小时，随后将动物单只饲养。

2. 治疗后测试：社会威胁-安全测试（图2）

1. 在CSD处理后，将所有小鼠（处理组和对照组）单独饲养于新笼子中，环境条件应与到达时所述条件相似，并让其过夜休息。
2. 在上午时段（8:00–13:30），用5%乙醇清洁三室行为箱（矩形，总尺寸为60 cm × 40 cm，由透明亚克力壁和光滑地板构成），将其置于摄像机下，光照条件为37 lux。确保整个行为箱区域均可见。
3. 用5%乙醇清洁金属或亚克力材质的网状围栏（笼状结构），并按照图1A所示将其放置于角落位置。
4. 适应期阶段：将待测动物置于行为箱中央，允许其自由探索6分钟，随后将其放回原饲养笼中。
5. 在其中一个网状围栏下放置新的（未知的）CD-1社交目标动物（同种个体），在另一个网状围栏下放置新的129/Sv社交目标动物。
   注意：应使用未知的129/Sv同种个体，以避免熟悉性偏差。建议每个行为箱配备4个网状围栏：其中2个用于适应期，另2个用于测试期。
6. 测试阶段：立即将待测动物重新置于行为箱中央，允许其自由探索6分钟。
7. 实验结束后将所有动物放回其原饲养笼。在测试不同动物之间，需用5%乙醇清洁行为箱和网状围栏；但在对同一动物的观察过程中不得清洁，即在适应期与测试期之间不得进行清洁。
8. 在不同动物之间交替网状围栏的位置（但同一动物的两个阶段之间不得更换位置），以控制可能存在的位置偏好偏差。

3. 评分与分析

注意：仅对压力后处理测试（即 STST）进行评分和分析（不包括 CSD 压力处理）。

1. 将相互作用区域定义为网箱边界周围2 cm的范围。
2. 记录动物在适应阶段中，当其鼻部位于互动区域内时，探索网格围栏所花费的时间。
3. 记录测试阶段动物鼻部位于互动区域时与社交目标互动所花费的时间。
   注意：检测可通过手动（使用计时器或手动评分软件）或自动方式进行。无论采用何种检测方法，均应以鼻尖点作为探索行为和社会互动测量的参考点，以身体中心点作为活动相关指标（如移动距离）的测量参考点。
4. 社会互动指数的计算方法如下：测试阶段探索每个社交目标所用时间 / 适应阶段探索两个空金属网格围栏所用时间的平均值图2B).
5. 将处理组分为以下3个亚组：与CD-1社交目标的社交互动指数≥1的动物为非回避型，社交互动指数＜1且＞0的动物为部分回避型，社交互动指数为0的动物为完全回避型。 <1 与 两者 社交目标为无差别回避型，即社交互动指数 ≥1 的动物 仅 与129/Sv社交目标相处时表现出回避倾向图 2C- D).
   注意：三个亚组中每组的动物数量在不同的动物批次间可能有所不同（接受CSD处理的所有动物中，约有1/3会表现出三个亚组之一的表型特征）。
6. 通过统计分析处理组与对照组之间与CD-1社交目标小鼠的社交互动指数（采用参数检验的两样本t检验或非参数检验的Mann-Whitney检验），评估应激效应。

结果

社会互动指数作为厌恶性条件反应的测量指标
社会互动指数 ≥1 表示与空网格围栏的探索相比，对相应社会目标的社交互动更多。在基线条件下（此处定义为对特定品系的特征性性状既无趋近性也无厌恶性经历，即对照组对两种社会目标，以及处理组对129/Sv社会目标），与该相同品系的社会互动指数 ≥1 反映了完整的基础社交能力。与此同时，在经历了一次社会性厌恶性条件刺激（此处为CSD处理）后，针对特定品系（此处为居住者品系，即CD-1品系）及其特征性性状作为条件刺激，社交回避行为的发展作为正确厌恶性条件反应的测量指标，表现为与该相同品系的社会互动指数 <1。CSD应激效应首先在整体处理组水平上进行评估（见方案步骤3.6）。具体而言，应激效应表现为处理组对CD-1社会目标的社会互动指数 <1，作为对CD-1品系产生社交回避的测量指标。而对照组完整的基础社交能力则表现为对同一社会目标的社会互动指数 ≥1。这导致两组之间在CD-1社会目标上的社会互动指数存在显著差异（p < 0.05）（图2C）。

讨论

本行为学实验方案描述了社会威胁-安全测试，该方法可用于将在慢性社交挫败（CSD）处理后的单一群体划分为三个不同的亚组，从而研究应激易感性与应激抵抗性的潜在生物学机制，并用于评估潜在的治疗方法。为确保实验设计的严谨性，需仔细考虑其生物学背景和技术细节。

不同的饲养条件可能会改变动物的攻击性和社交水平，从而可能影响治疗后测试结果的准确性^28,29,30。这些条件包括：动物到达后即进行单笼饲养，并在治疗后测试前24小时继续保持单笼饲养，以及在10天治疗期间对对照组动物实施单笼饲养。此外，若对照组动物意外受到应激，慢性社会应激（CSD）效应可能会被干扰。这种情况可能源于在10天治疗期间，对照组暴露于治疗组动物产生的应激相关气味和叫声，或目睹了治疗过程³¹。因此，建议将对照组与治疗组分别饲养在不同的房间内。此外，由于该实验涉及条件化学习过程

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
实验区域	Noldus，社会性笼具，荷兰瓦赫宁恩	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	三室结构，矩形，总尺寸为 60 cm × 40 cm，由丙烯酸透明壁和光滑地板制成
用于视频录制的摄像头	Basler AG，德国 An der Strusbek 60-62 22926 Ahrensburg	ace Classic acA1300-60gc	若使用自动检测程序，请确保摄像头兼容
摄像镜头	KOWA Kowa Optimed Deutschland GmbH Fichtenstr. 123 40233 杜塞尔多夫：LMVZ4411 | 1/1.8" 4.4~11mm 变焦镜头	部件编号 10504
检测程序/计时器	Noldus，EthoVision-XT，荷兰瓦赫宁恩	https://www.noldus.com/ethovision-xt	检测可通过手动（使用计时器或手动评分软件）或自动方式实现
饲养笼具	ZOONLAB GmbH，Hermannstraße 6, 44579 Castrop-Rauxel	3010010	2型笼具：265 mm × 205 mm × 140 mm（长×宽×高），即底部面积360 cm²。由聚碳酸酯（Makrolone©）和聚砜制成，笼盖为不锈钢材质。符合欧洲标准，适用于最多5只小鼠（20–25 g）。可耐受高达134 °C的高压灭菌
网格围栏	属于实验区域套件的一部分：Noldus，社会性笼具，荷兰瓦赫宁恩	https://www.noldus.com/applications/sociability-cage	小型丙烯酸或金属笼状结构，直径100 mm，高200 mm，开孔大小为10 mm。每个实验区域使用两个网格围栏可行，但推荐使用四个（参见实验方案第2.5步）
网格隔板	自制	N/A	丙烯酸或金属材质，每个笼具配备一个。尺寸取决于所用笼具。隔板必须确保两只动物无法发生身体接触
社交目标：CD-1和129/Sv品系小鼠；退役雄性种鼠	小鼠由Charles River提供： 品系名称：CD-1®IGS 小鼠 129S2/SvPasCrl	Crl:CD1(ICR); 129S2/SvPasCrl	CD-1和129/Sv品系的退役雄性种鼠，单独饲养，对目标实验动物而言为陌生（未知）的同种个体。若无法获得退役雄性种鼠，则两种品系中年龄超过1年的雄性小鼠亦可满足要求