基于免疫组织化学与数字图像分析的子宫内膜免疫细胞定量检测平台

摘要

本研究开发并验证了一种数字免疫组织化学图像分析平台，用于在胚胎着床窗口期对复发性流产患者的子宫内膜免疫细胞进行定量分析。

摘要

为了评估复发性流产（RM）患者的子宫内膜免疫微环境，本研究开发并验证了一种数字免疫组织化学图像分析平台，用于在黄体中期定量分析子宫内膜免疫细胞。所有子宫内膜样本均于月经周期的黄体中期采集。将包埋在石蜡中的子宫内膜组织切成4 µm厚的切片，并进行免疫组织化学（IHC）染色，以检测子宫内膜免疫细胞，包括CD56+ uNK细胞、Foxp3+ Treg细胞、CD163+ M2型巨噬细胞、CD1a+ 树突状细胞（DCs）以及CD8+ T细胞。全景切片使用数字切片扫描仪进行扫描，并采用商用图像分析系统进行定量分析。子宫内膜免疫细胞百分比通过将免疫细胞数量除以子宫内膜总细胞数计算得出。利用该商用图像分析系统，以往难以或无法通过传统图像分析方法进行分析的子宫内膜免疫细胞，现可被简便且准确地定量分析。该方法可用于定量表征子宫内膜微环境，包括免疫细胞间的相互作用及其在不同生殖失败患者中的异质性。该子宫内膜免疫细胞定量评估平台可能对RM患者的临床诊断与治疗具有重要意义。

引言

复发性流产（RM）是指连续发生两次或以上妊娠丢失，是一种复杂的疾病，近年来受到临床医生的广泛关注。育龄期女性中复发性流产的发病率为1%–5%¹。既往研究结果表明，免疫因素与复发性流产的发病机制密切相关^2,3,4,5。维持母胎界面的免疫稳态对于胚胎着床和发育至关重要。子宫内膜免疫细胞发挥多种调节功能以维持这种稳态，例如促进滋养层细胞侵袭、重塑螺旋动脉以及参与胎盘发育^6,7,8,9。

既往研究已报道复发性流产（RM）女性存在子宫内膜免疫细胞异常。结果表明，子宫自然杀伤细胞（uNKs）密度升高与RM的发生密切相关。^10,11,12据报道，与有活产史的女性相比，复发性流产（RM）女性子宫内膜中的巨噬细胞数量增加¹³调节性T细胞（Treg）在母体对胚胎的免疫耐受中发挥重要作用，其在复发性流产（RM）患者蜕膜中的数量和功能均有所下降¹⁴细胞毒性T细胞（CTL）和树突状细胞（DCs）也在妊娠的免疫调节中发挥作用^15,16因此，对黄体中期局部子宫内膜免疫细胞进行全面的定量分析，有助于更好地理解复发性流产（RM）的发病机制。目前一些针对子宫内膜免疫细胞的定量分析方法采用流式细胞术，该技术可利用多种标记物对免疫细胞进行精确标记。^17,18然而，流式细胞术的临床应用受到限制，因其仅能用于新鲜组织。获取新鲜组织仅在存在大量多余肿瘤组织时才可行，而这种情况在子宫内膜中极为罕见。免疫组织化学可良好地观察组织形态 原位 并且能够标记多种免疫细胞，而传统的免疫组织化学技术无法对免疫细胞进行定量分析。

与传统的免疫组织化学实验相比，对子宫内膜中免疫细胞进行定量免疫组织化学分析具有重要的临床意义。在病理诊断和研究中，免疫组化染色强度评分通常采用四级评分系统，或分为强与弱^19,20,21。然而，这种半定量技术具有主观性强、准确性低的缺点，并且在不同观察者之间以及同一观察者重复判断时均存在显著的变异性²²。一种可能的解决方案是应用机器学习技术，该技术在数字图像分析中具有重要价值^23,24。通过提供定量测量结果，该方法能够更精确地评估免疫细胞在子宫组织中的浸润程度、分布模式及密度。这些定量信息有助于阐明月经周期中以及多种病理状态下免疫细胞群体的动态变化。总体而言，通过免疫组织化学对子宫内膜免疫细胞进行定量分析的能力，为理解子宫局部免疫微环境提供了宝贵的科学依据。

因此，本方案旨在建立并验证一种数字免疫组织化学图像分析平台，用于定量分析复发性流产（RM）患者在黄体中期子宫内膜中的免疫细胞，包括子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）、调节性T细胞（Tregs）、巨噬细胞、树突状细胞（DCs）以及细胞毒性T细胞。

方案

该研究内容和方案已通过深圳中山泌尿外科医院研究伦理委员会的伦理审查和批准。所有参与研究的女性（20至40岁）均对样本采集和使用签署了知情同意书。

1. 病理组织的获取

1. 准备组织采集所需的工具，包括测量尺、镊子、包埋盒、包埋纸和组织篮。
2. 观察使用吸管导管标准方法采集的子宫内膜组织量是否足够（大于绿豆大小）。
3. 用镊子将子宫内膜组织从福尔马林中转移至包埋纸上，并用尺子测量其尺寸。
4. 用包埋纸包裹子宫内膜组织后放入包埋盒中。
5. 将包埋盒放入组织篮中以进行脱水处理。

2. 组织脱水

1. 将组织篮放入脱水机的反应室中（参见材料表），并启动常规组织脱水程序：甲醛100分钟；甲醛100分钟；75%酒精60分钟；85%酒精60分钟；95%酒精60分钟；100%酒精60分钟；100%酒精60分钟；100%酒精60分钟；二甲苯35分钟；二甲苯20分钟；二甲苯20分钟；石蜡80分钟；石蜡80分钟；石蜡80分钟。该过程约需15小时。
2. 组织脱水程序结束后，打开脱水机的反应室，取出组织篮。

3. 组织包埋

1. 根据标本大小取出合适的包埋模具，并加入70 °C的石蜡。
2. 迅速将组织放入模具中，并仔细调整，使组织位于模具中央。
3. 平稳地将模具移至冷却板上，在底部石蜡凝固过程中轻轻按压组织。
4. 将包埋盒盖在模具上方，并补充更多石蜡。
5. 将模具置于冷却板上，待石蜡完全凝固后，将带有包埋盒的蜡块从模具中取出。

4. 组织切片

1. 将样品块安装在切片机的样品夹上，将刀片放入刀架中，调整样品块平面与刀片之间的角度，将切片厚度调节至 4 µm，转动转轮，开始切片。
2. 通过从样品块上切去几层薄片，暴露出合适的组织面。用毛笔取出连续且完整的切片。
3. 当切得足够数量的切片后，停止转动转轮，用镊子去除前端不合格的切片，并用镊子和毛笔将切片漂浮于水浴中 42 °C 的水面上。
4. 待切片完全展平后，用防脱片载玻片捞取切片，并转移至 65 °C 的载玻片烘箱中烘烤 60 分钟。
5. 烘烤结束后，从载玻片烘箱中取出玻片。

5. 免疫组织化学染色

1. 用抗体稀释液将一抗稀释成工作液。详见表1。
2. 将稀释后的一抗溶液放入专用试剂瓶中，并将检测试剂盒放入自动免疫组化染色仪的试剂仓内（参见材料表）。
3. 将切片置于切片架上，加盖专用盖片，然后插入仪器的实验反应仓中。
4. 待仪器自动识别切片上的试剂及实验信息后，点击开始按钮以启动免疫组化染色程序。实验过程持续约3 h。

6. 载玻片的脱水与封片

1. 免疫组织化学染色后，取出载玻片架，取下专用盖片，将染色后的载玻片放入载玻片架中，并用清水冲洗掉载玻片上残留的染液。
2. 将载玻片架转移至自动封片机（参见材料表），选择并运行脱水和封片程序。
3. 脱水和封片完成后取出载玻片。

7. 扫描玻片

1. 将切片放置于全景病理图像扫描仪的切片架上（参见材料表），然后放入仪器的切片扫描仓中进行全景病理图像扫描。扫描过程耗时2分钟。参见图1。

8. 图像分析

1. 导入图像
   1. 打开病理图像分析软件（参见材料表），创建一个新文件夹，并导入待分析的免疫组织化学图像。
2. 构建组织分类器
   1. 标记多个组织区域和空白区域，分别用于训练并建立识别组织和空白区域的分类器。
   2. 在标记注释过程中使用实时调优功能，实时观察软件的识别能力。若识别不及时，则重新标记注释并再次训练，直至组织识别准确为止。
3. 构建分析算法
   1. 根据实验类型（多重免疫组化）在软件中选择标准算法。
   2. 通过选择典型的阴性和阳性像素来设置细胞识别的颜色参数。
      在此基础上，设置细胞核、细胞质和细胞膜的参数，并实时观察细胞识别情况，直至找到最适合该图像的参数。
   3. 设置阳性细胞识别阈值，并实时观察识别情况，直至调整到合适的阈值。
   4. 在算法中选择组织分类器，并勾选组织分类器中的组织部分，以便基于组织区域进行细胞识别。至此，分析算法的建立完成。
4. 运行图像分析
   1. 选择分析区域，使用已建立的算法对图像进行分析。
5. 软件完成分析后，手动检查图像识别的准确性，包括组织识别、阴性细胞和阳性细胞的识别。
6. 若图像识别不准确，则再次调整算法和参数阈值，重新运行图像分析直至成功，并导出分析结果。参见图1。
7. 其他免疫细胞也可根据上述步骤进行分析（参见图1）。根据不同的子宫内膜免疫标志物实际表达情况设置不同的分析参数（CD56⁺uNK细胞、Foxp3⁺Tregs、CD68+巨噬细胞、CD163⁺M2巨噬细胞、CD1a⁺DCs和CD8⁺T细胞^25,26）。
8. 通过软件计算，获得子宫内膜免疫细胞的比例（参见表2）。利用该结果评估复发性流产患者子宫内膜中各类免疫细胞的水平。

结果

为了对子宫内膜免疫细胞进行定量评估，并减少人为操作误差带来的不稳定性，我们利用自动免疫组化检测与数字定量评估系统，建立了一个子宫内膜免疫细胞的数字化定量分析平台。通过建立免疫组化图像分析平台，对反复流产（RM）患者在种植窗时期的子宫内膜免疫细胞进行定量分析。所有子宫内膜组织均在月经周期的黄体中期采集。将石蜡包埋的子宫内膜组织切片制成厚度为 4 µm 的切片，并进行免疫组化（IHC）染色，以检测子宫内膜免疫细胞，包括 CD56⁺uNK 细胞、Foxp3⁺Tregs、CD163⁺M2 巨噬细胞、CD1a⁺ 树突状细胞（DCs）以及 CD8⁺ T 细胞。使用数字切片扫描仪对全视野切片进行扫描，并通过数字图像分析系统进行定量分析。计算子宫内膜免疫细胞百分比时，将免疫细胞数量除以子宫内膜细胞总数。（图 1 和 图 2）。RM 女性（N=30）中不同子宫内...

讨论

本方案建立了一个数字免疫组织化学图像分析平台，用于对复发性流产（RM）患者子宫内膜免疫细胞进行定量分析。在此，检测了六种 子宫内膜免疫标志物，以评估RM患者子宫内膜的免疫微环境。

在黄体中期，具有容受性的子宫内膜是成功着床和妊娠的关键^27,28。因此，评估子宫内膜中免疫细胞所占百分比在判断子宫内膜容受性方面具有重要作用。通过传统病理学方法进行的子宫内膜免疫细胞分析具有预测性，但无法直接应用于临床实践。目前尚无标准化的方法用于测量免疫细胞的比例，这限制了人们对这些细胞在妊娠过程中作用的理解。传统的免疫组化（IHC）分析依赖于选定的视野和人工计数。由于人工分析具有主观性，易导致观察者偏倚，因此无法通过传统IHC方法精确评估组织的分割及免疫细胞的定位²⁹。

与分析所选视野中免疫细胞分布相比，对组织进行全景分析在评估子宫内膜免疫细胞分布时更为准确。利用基于机器学...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
自动盖片机	Sakuraus	DRS-Prisma-P-JCS&Film-JC2
CD163	GrowGn Biotechnology	NCL-L-CD163
CD1a	Gene Tech	GM357129
CD56	Gene Tech	GT200529
CD8	Novocastra	NCL-L-CD8-4B11
脱水机	Thermo Fisher	Excelsior ES
数字病理学与	Indica labs	HALO
Foxp3	YILIFANG biological	14-477-82
免疫组化染色仪	Leica	BOND III
图像分析平台	Indica labs	HALO
切片扫描仪	Olympus life science	VS200