方法文章

一种高效且可重复的复合植株制备方法 根癌农杆菌基于发根农杆菌的毛状根转化

DOI：

10.3791/65688

⸱

2023年6月30日

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1College of Agriculture, Liaocheng University, 2College of Life Science, Liaocheng University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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在此，我们提供了一种由介导的一步法转化详细实验方案 根癌农杆菌 以生成嵌合植株。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用转基因根系与非转基因茎叶培育嵌合植株 根癌农杆菌-介导的毛根转化是研究根部相关生物学的有力工具。毛根转化已在多种双子叶植物及若干单子叶植物中建立，且几乎不受基因型限制。传统的子叶下胚轴注射方法 A. rhizogenes 获得嵌合植株效率低下、耗时长、劳动强度大，且常导致幼嫩的下胚轴植株死亡。一种高效、一步法的毛状根转化由 A. rhizogenes 此前已建立无需在产生毛状根后进行移植的方法。本研究中，切除了部分下胚轴和初生根，并在下胚轴切口处涂抹 A. rhizogenes， 和 然后将下胚轴种植于无菌蛭石中。培养12天后，下胚轴切口处膨大并诱导出新的毛状根。本文提供了由 A. rhizogenes，其有效性已通过成功制备野生大豆的嵌合植株得到验证， Solanum americanum，以及南瓜。

引言

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Agrobacterium rhizogenes 是一种来自根瘤菌科（Rhizobiaceae）的革兰氏阴性土壤细菌。A. rhizogenes 可通过伤口侵染几乎所有双子叶植物、少数单子叶植物以及个别裸子植物，使受侵染植株产生毛状根。该细菌携带 Ri（根诱导）质粒，Ri 质粒的 T-DNA 区域含有冠瘿碱合成基因和 rol 基因（根位点基因）。当 Ri 质粒的 T-DNA 进入植物细胞并整合到宿主染色体中后，rol 基因的表达会诱导毛状根的形成1。将携带目的基因的植物双元表达载体转化至 A. rhizogenes 中，再利用转化后的 A. rhizogenes 侵染植物，可在受侵染植株中诱导产生转基因毛状根，从而获得包含转基因根系与非转基因茎叶芽的嵌合植株。通常可在 14–20 天内获得嵌合植株。A. rhizogenes 介导的毛状根转化在双子叶植物中通常不受基因型限制2。由 A. rhizogenes 侵染产生的毛状根具有生长速度快、遗传稳定性高和操作简便等特点。目前，A. rhizogenes 介导的毛状根转化技术已广泛应用于根系相关生物学研究。此外，毛状根转化还可用于验证和优化 CRISPR/Cas9 系统的基因编辑效率3,4,5 以及蛋白质亚细胞定位研究。因此，毛状根转化是植物基因功能研究、代谢工程以及根系与根际微生物互作研究中的重要工具6,7,8。

通过毛状根转化获得转基因根的嵌合植株已在双子叶植物中广泛制备，尤其是在豆科植物中。传统的子叶下胚轴注射方法 A. rhizogenes 已用于制备复合材料 Lotus corniculatus9，大豆10，番茄11，甘薯12, 以及其他多种植物5,8下胚轴注射法效率较低，且容易导致幼嫩或细小的下胚轴植株死亡。因此，通过切除胚根，并将幼苗切口处涂覆 A. rhizogenes，然后将下胚轴置于无菌培养基上进行生根培养13然而，这些步骤需在无菌环境中进行，操作流程相对繁琐。特别是所获得的复合植株需要进行移栽，增加了工作量。在先前的研究中，一步法 A. rhizogenes介导的（ARM）毛状根转化已在黄瓜、大豆中建立， Lotus japonicus, Medicago truncatula, 和番茄2,14,15,16,17主根和部分下胚轴被切除，剩余下胚轴的切口处涂覆转化后的 A. rhizogenes，然后将幼苗种植到湿润的无菌蛭石中。培养12天后，在切口处产生毛状根。一步法ARM效率高，产生毛状根所需时间较短，且无需在形成毛状根后进行移栽。由于无需移栽可避免微生物污染，一步法ARM在研究植物与微生物之间的相互作用时尤为有用，例如豆科植物与根瘤菌之间的共生固氮作用 根瘤菌，以及植物与丛枝菌根真菌之间的共生关系。本文中，一种详细的一步法 A. rhizogenes介导的 提供毛状根转化实验方案，并以野生大豆中获得的嵌合植株为例。 Solanum americanum，以及南瓜。通过该方案，研究人员可顺利开展一步法ARM转化。

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方案

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1. 植物生长条件与A. rhizogenes 培养

  1. 种子播种
    注意：野生大豆种子采自中国山东省聊城市阳谷县；种子的 S. americanum 以及南瓜地方品种Yinsu均购自市场。
    1. 采集野生大豆种子， S. americanum，以及当地品种的南瓜，将其播种于蛭石中，深度为1 cm，并充分浇水。将20粒种子种植在8 cm × 11 cm × 9 cm的塑料盒中。在培养箱中于24 ± 2 °C条件下培养，光照周期为16小时光照/8小时黑暗，相对湿度约为70%。
      注意：播种前必须破坏野生大豆种子的种皮。如果研究问题聚焦于植物与微生物之间的相互作用，则种子、蛭石、塑料盒和水在使用前必须进行灭菌处理。
    2. 激活与培养 A. rhizogenes K599
      注意：A. rhizogenes K599 菌株含有一个双元载体 pRed13052 携带红色荧光报告基因 DsRed2
      1. 移除 A. rhizogenes 从-80 °C冰箱中取出K599菌株，在含50 mg/L卡那霉素和50 mg/L链霉素的固体LB培养基上于28 °C活化48 h。
      2. 挑取一株K599菌株的单克隆，接种于1 mL含抗生素的LB液体培养基中，培养12小时。
      3. 将500 µL细菌悬液均匀涂布于含抗生素的固体LB培养基上，随后在28 °C下培养24 h。

2. 一步法 A. rhizogenes 介导的毛状根转化方法

  1. 下胚轴切口
    1. 播种后第7天（以播种当天为第0天），幼苗子叶刚刚展开（图1A），使用已灭菌的锋利解剖刀在下胚轴处切开约0.5–1 cm的切口（图1B）。弃去主根及部分下胚轴组织。
      注意：使用解剖刀时需小心操作。
  2. K599菌液接种
    1. 将K599农杆菌涂抹于下胚轴切口处（图1C）。
    2. 将幼苗种植于湿润的蛭石中（图1D）。
    3. 通过根癌农杆菌（A. rhizogenes）介导的毛状根转化法，对每种植物各感染30株。每株植物浇灌5 mL重悬的K599菌液（在1/4浓度（0.25×）Gamborg B-5基础培养基中，OD600 = 0.5–0.6）（图1E）。
    4. 用高度透明的塑料袋覆盖花盆（图1F），并将其置于人工气候室中培养。

3. 毛状根的制备

  1. 接种后培养植株约12天，新的毛状根将在切口处被诱导并生成。15天后，毛状根长度通常可达2-5 cm（图2）。
  2. 为确定所生成的毛状根是否为转基因，需检测依赖于K599中转化载体的报告基因表达情况。
    1. 使用化学发光成像系统，在540 nm绿光激发、600 nm发射条件下检测报告基因DsRed2的表达（图2B、图2D和图2F）。

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结果

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高效一步法 A. rhizogenes介导的毛状根转化
接种工程菌K599后12天，在下胚轴切口处产生毛状根。转基因毛状根的鉴定依据为双元载体中报告基因的表达。转化了报告基因的转基因根 DsRed2 复合野生大豆 S. americanum，南瓜在自然条件下被观察到（图2A, 图 2C，以及 图2E）和绿色激发光（图2B, 图 2D, 和 图 2F).

当一个复合植株包含至少一个转基因根时，该植株即被定义为转基因复合植株。在三种物种各...

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讨论

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一步法 A. rhizogenes-介导的 毛状根方法比子叶节注射法更简单、更高效，用于制备复合植株。该一步法ARM显著提高了毛状根转化效率，缩短了毛状根生成时间，增加了毛状根数量，并减少了操作工作量。改进后的转化方案特别适用于豆科植物与根瘤菌以及植物与丛枝菌根真菌之间共生关系的研究。这主要是因为毛状根生成后无需进行复合植株的移栽，从而避免了移栽过程中可能发生的未接种菌株污染。此外，在一种植物物种（南瓜）中，转化效率达到了100%。

以下原因可能解释为何一步ARM法在毛状根转化中比下胚轴注射法更高效。首先，尽管切除了主根，但幼苗的蒸腾作用仍然保持，因此蒸腾拉力促进了A. rhizogenes侵入下胚轴切口处的细胞。其次，下胚轴切口造成的伤口面积大于下胚轴注射法所造成的伤口，因而有更多的植物细胞被A. rhizogenes感染。最后，在切除主根后，下胚轴切口被埋入黑暗且湿润的蛭石中，这种环境有利于根的生成18。

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作由聊城大学科研基金（318012028）和山东省自然科学基金（ZR2020MC034）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卡那霉素生工生物工程（上海）股份有限公司A506636
LB培养基生工生物工程（上海）股份有限公司B540113
塑料盒辽苏8 cm x 11 cm x 9 cm
南瓜本地品种银粟
链霉素生工生物工程（上海）股份有限公司A610494 
Tanon-5200Multi仪器天能科技有限公司，中国5200Multi化学发光成像系统
番茄本地品种中蔬4号
野生大豆采自中国聊城市阳谷县

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
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