基于定量聚合酶链反应（qPCR）的幽 门螺杆菌 感染和抗生素耐药快速诊断

幽门螺杆菌 是一种螺旋形、高度运动的革兰氏阴性细菌，主要生活在胃的幽门区域¹。它是一种常见的病原体，感染全球近 50% 的人口²。大多数 幽门螺杆菌 感染者没有临床表现，大多数在感染几年后会发展出不同的疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃溃疡和胃癌³。在几项基于不同人群的研究中，已经证明了消除 幽门螺杆菌 预防胃癌和癌前病变的有效性^4，5。因此，世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除 幽门螺杆菌 作为预防措施⁶。

使用无创方法识别 幽门螺杆菌 感染是大多数无症状消化不良患者治疗的关键组成部分。尿素呼气试验 （UBT）、 幽门螺杆菌 粪便抗原试验 （SAT） 和血清学检测是流行的无创技术。其中，UBT是侵入性最小且最准确的程序。UBT使用幽 门螺杆菌中大量存在的脲酶将同位素标记的尿素水解成氨和二氧化碳（13C或14C）。相比之下，免疫层析（ICA）⁷ 方便、简单且无创取样。但是，测试的准确性受多种因素的影响，例如粪便样本的质量、温度以及样本采集和测试之间的间隔。另一种基于免疫反应的测试是血清 幽门螺杆菌 抗体测试，该测试可检测患者血清中的抗体。然而，该测试不适合治疗后分析，因为抗体在细菌被清除后很长时间仍然存在⁸。另一个主要缺点是这些方法仅诊断 幽门螺杆菌 感染，不允许进行耐药性测试来指导基于敏感性的治疗。

对于侵入性检查方法，需要通过内镜检查取胃活检组织，然后进行组织学，脲酶快速测试和细菌培养。由于多种因素，这些测试方法也非常有限。目前，这些技术仅限于老年患者、癌前或恶性疾病高风险患者以及胃食管反流病或幽门螺杆菌^感染一线治疗失败的患者9。其次，由于幽门螺杆菌独特的生长特性，细菌培养的成功率仅达到50%¹⁰。因此，分子检测方法为克服侵入性检测方法的高要求和指导基于敏感性的治疗提供了新的希望。在分子检测方法中，定量PCR近年来取得了巨大的发展。与传统PCR不同，qPCR不需要凝胶电泳，通过在退火阶段添加引物和探针来准确定量样品中的DNA/RNA。用于检测幽门螺杆菌感染和耐药性的qPCR试剂盒现已上市。然而，每种方法都有其局限性;因此，应结合患者的症状、体征、病史、其他实验室检查和对治疗的反应来考虑患者的临床诊断和治疗。

目前，治疗 幽门螺杆菌 感染的主要方法是服用抗生素，但最近，由于抗生素耐药性的增加，治疗这些感染变得越来越困难。随后，全球观察到 幽门螺杆 菌治疗效果显着下降，使 幽门螺杆 菌根除成为一个主要的公共卫生问题¹¹。

克拉霉素和左氧氟沙星是用于治疗幽门螺杆菌引起的感染的两种广谱抗生素，但一些研究报告了幽门螺杆菌分离株对这两种药物的广泛耐药性。A2143G、A2142G 和 A2142C 是在 2.9 kb 23S rRNA 基因中发现的众多点突变中的三种，它们通过阻止大环内酯类药物结合而导致克拉霉素耐药。同时，左氧氟沙星耐药基因的突变位点主要位于gyrA基因¹²的6个突变位点（A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G）。这些基于基因突变的耐药机制的发现导致幽门螺杆菌的检测逐渐转变为基于培养的研究到分子检测。

总体而言，临床迫切需要一种无创、有效且同步的诊断方法来检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性。采用串试验与qPCR相结合的方法，克服采样困难，达到不同引物探针同时检测 幽门螺杆菌 感染和耐药性的目的。

本研究是根据中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会建立的伦理考虑进行的（批准文号:KY-Q-2022-384-02）。本研究纳入了18-60岁年龄段的患者。检测前2周内服用抗生素、抗菌中药、质子泵抑制剂（PPI）或_H2 受体拮抗剂等药物的患者未纳入本研究。那些在过去3个月内接受过 幽门螺杆菌 治疗的患者也被排除在这项研究之外。那些有严重心脏，肝脏，肾脏问题，严重神经病变或精神疾病的人也不允许参加这项研究。这项研究没有包括孕妇和哺乳期母亲。本研究中使用的用品（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息在 材料表中给出。

1.胃液采样的串试验

1. 要求患者在采集样本前禁食过夜。
2. 第二天，打开弦测试套件，取出胶囊，并按住弦末端的环。
3. 将绳子粘在患者的脸颊上，并要求他们将胶囊放在靠近喉咙后部的舌头上，然后喝一口水吞咽。
4. 让胶囊溶解在患者的胃中，从而暴露胶囊内的绳子以吸收胃粘液。
5. 请训练有素的助手在患者吞咽胶囊 1 小时后小心地拉出绳子。
6. 切下浸泡在胃液中的绳子（40厘米）的下端，将其放入TSE（Tris/盐水/ EDTA）样品保存溶液中，然后在室温（RT）下将其送到临床实验室，以便随后检测 幽门螺杆菌 并使用qPCR测定抗生素耐药性谱。

2. 脱氧核糖核酸提取

1. 将携带标本的收集管放在试管架上，正确标记，并涡旋10秒。
2. 将 32 孔板（核酸提取或纯化试剂盒）倒置数次以重悬磁珠。短暂涡旋10秒后，小心地从板上取下铝箔密封。
3. 将每个样品和 幽门螺杆菌 DNA 中的 200 μL 胃液作为阳性对照转移到单独的孔中。
4. 将32孔板置于核酸提取机的相应样品槽中，用于自动DNA提取。
5. DNA提取和确认后，通过qPCR对阳性样本启动克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性检测。
6. 将过量的胃液和提取的DNA样品置于-20°C，以便长期储存和将来使用。
7. 在生物安全柜中执行所有这些步骤以避免任何污染。

3. qPCR 用于检测 幽门螺杆菌 和抗生素耐药性（克拉霉素和左氧氟沙星）

1. 进行 qPCR 以检测 幽门螺杆菌 及其基因组中可疑的抗生素耐药性突变。
   1. 将qPCR反应混合物（幽门螺杆菌 核酸检测试剂盒）在冰上解冻，并通过轻弹和旋转进行混合，以防止试剂损失。
   2. 对于 32 孔板上的每个样品，将 20 μL PCR 反应混合物（基因分型反应预混料 [含有 Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液和氯化镁]，与尿素 A 正向和反向引物以及 尿素 A 探针）和 5 μL 提取的 DNA 混合。
   3. 在 qPCR 机器上运行 32 孔 qPCR 板。对热循环仪进行编程:反应混合物将首先在42°C和95°C（均一个循环）下依次反应2分钟;然后，在95°C下循环40次，变性10秒，在58°C下退火和延伸45秒。
   4. 将荧光信号采集设置为FAM（幽门螺杆菌），将数据采集设置为扩增延长周期。反应完成后，保存数据以供将来的结果分析。
   5. 使用特定的qPCR软件分析数据，因为仪器将自动选择基线阈值。
   6. 如果幽门螺杆菌的检测结果为阳性，机器将自动对样本开始耐药性检测。将试剂盒替换为幽门螺杆菌 （qPCR） 试剂盒中 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变的检测试剂盒。
      注意:试剂盒（幽门螺杆菌 [qPCR] 中 23S rRNA 基因和 gyrA 基因突变的检测试剂）包括 PCR 反应混合物（基因分型反应预混料 [含有 Taq 酶、脱氧核糖核苷三磷酸、反应缓冲液、氯化镁]、引物和探针）。所有负质控产品均为无菌纯化水。幽门螺杆菌核酸检测试剂盒中的阳性质量控制产物是灭活幽门螺杆菌标准微球（ATCC 43504）。试剂盒中的强幽门螺杆菌阳性和弱阳性质控产物（幽门螺杆菌23S rRNA基因和gyrA基因突变的检测试剂）是含有靶基因和突变基因的灭活幽门螺杆菌菌株的DNA。同样，根据实际情况，所有诊断标准，包括幽门螺杆菌感染或耐药性的存在，都设置为CT ≤35，并具有典型的S形曲线。弱质控品的浓度为1.0 x 10³拷贝/mL，而强质控品的浓度为1.0 x 10⁸拷贝/mL。

qPCR检测胃液中 幽门螺杆菌 感染和抗生素耐药性
我们通过扩增尿素A基因进行qPCR检测幽门螺杆菌感染，并通过靶向23S rRNA基因和gyrA基因的点突变来确定其抗生素耐药性谱（表1）。所有三组qPCR实验的质控CT值均在推荐范围内，表明样品在实验时均处于正常状态，检测结果可靠。本研究选取了5个不同测试结果（S1-S5）的样品来表征实验方案的可靠性。S1代表没有感染的幽门螺杆菌代表性菌株，而S2-S5样本是感染幽门螺杆菌的样本，具有不同的耐药结果（图1）。我们将系统设置为不对未感染幽门螺杆菌的样本进行进一步的耐药性测试，因此在系统测试显示幽门螺杆菌阴性结果后，S1样本没有进入耐药性测试。幽门螺杆菌感染阳性样本中，S2 CT值均在检出范围内，表明样本为幽门螺杆菌阳性，对克拉霉素和左氧氟沙星表现出双重耐药性，建议临床医生自行选择其他治疗方法。S3 CT值在幽门螺杆菌感染和左氧氟沙星耐药试验检测范围内，克拉霉素耐药试验未检出CT值，表明S3样本来自左氧氟沙星耐药患者。同样，S4样本CT值在幽门螺杆菌感染和克拉霉素耐药检测范围内，而左氧氟沙星耐药CT值未检出，表明该患者对克拉霉素耐药，建议服用左氧氟沙星治疗。最后，S5样本测试显示CT值仅在检测幽门螺杆菌感染的检测范围内，表明该患者对两种抗生素都敏感，可以使用两种药物中的任何一种进行治疗。与同时检测幽门螺杆菌感染和耐药性的细菌培养方法相比，该方法在不对患者造成损害的情况下安全有效地检测幽门螺杆菌感染和耐药性，可用于指导医生制定适当的治疗方案。

图 1:通过 qPCR 检测胃液中的 幽门螺杆菌 及其抗生素耐药性。
（A） 幽门螺杆菌 感染的定量PCR扩增，（B）克拉霉素耐药性的检测，以及（C）左氧氟沙星耐药性的检测。"S"代表样本。"S1"是幽 门螺杆菌 感染阴性的样本，也进行了抗生素耐药性检测;"S2"是 幽门螺杆菌感染的样本，对克拉霉素和左氧氟沙星均具有耐药性;"S3"也是 幽门螺杆菌阳性样本，但克拉霉素敏感且左氧氟沙星耐药;"S4"也是 幽门螺杆菌阳性样本，但克拉霉素耐药且左氧氟沙星易感;"S5"是 幽门螺杆菌阳性样本，但对克拉霉素和左氧氟沙星均敏感。弱质控品的浓度为1.0 x 103 拷贝/mL，而强质控品的浓度为1.0 x 108 拷贝/mL。 请点击此处查看此图的大图。

表1:表显示了检测 幽门螺杆菌 感染和对克拉霉素和左氧氟沙星耐药的qPCR结果。 该表列出了 幽门螺杆菌 感染的定性结果，23S rRNA基因突变的检测表明分离株对克拉霉素耐药，以及 gyrA 基因突变的检测表明分离株对左氧氟沙星耐药。+/−，定性结果;+，阳性结果;−，阴性结果。

没有。