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方法文章

一种用于骨缝扩张小鼠模型中骨重塑的三维可视化技术

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DOI：

10.3791/65709

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2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthodontics, China Shanghai Ninth People’s Hospital, College of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2National Center for Stomatology, National Clinical Research Center for Oral Diseases, Shanghai Key Laboratory of Stomatology, Shanghai Jiao Tong University

本文内容

摘要

本方案介绍了一种标准化的缝线扩张小鼠模型以及一种三维可视化方法，用于研究在张力加载下颅缝的力生物学变化及骨重塑过程。

摘要

颅面骨缝的作用远不止是连接颅面骨骼的纤维性关节；它们还是颅盖骨和面部骨骼生长的主要微环境，容纳着间充质干细胞和成骨前体细胞。由于大多数颅面骨通过膜内成骨方式发育，骨缝的边缘区域便成为成骨的起始位点。正因如此，这些骨缝已成为骨科治疗中的重要靶点，例如弹簧辅助颅骨穹窿扩张、快速上颌扩展以及上颌前牵引等疗法。在骨科牵引力作用下，骨缝中的干细胞被迅速激活，成为扩张过程中骨重塑的动态来源。尽管其作用重要，但在骨重塑期间发生的生理变化仍不甚明确。传统的切片方法主要局限于矢状方向，难以全面捕捉整个骨缝区域发生的完整变化。本研究建立了一种标准的小鼠矢状缝扩张模型。为了完整可视化骨缝扩张后的骨重塑变化，本研究结合使用PEGASOS组织透明化技术、整体EdU染色以及钙螯合双标记法，从而实现了对扩张后整个颅盖骨中高度增殖细胞及新生骨形成的三维观察。该实验方案提供了一种标准化的骨缝扩张小鼠模型及三维可视化方法，有助于揭示在张力加载条件下骨缝的力学生物学变化及骨重塑过程。

引言

颅面骨缝是连接颅面骨骼的纤维组织，在颅面骨骼的生长和重塑过程中发挥着关键作用。骨缝的结构类似于河流，可提供细胞资源的流动，以滋养并构建颅面骨骼 "河岸"，称为成骨前沿，通过膜内成骨参与颅面骨的形成1.

对颅面骨缝的研究兴趣源于临床需求，旨在理解颅骨骨缝的过早闭合及面部骨缝功能障碍，这些情况可能导致儿童出现颅面畸形，甚至危及生命的状况。开放性骨缝切除术在临床治疗中常规使用，但长期随访发现部分患者存在骨组织再生不完全及复发的情况。2使用扩张弹簧辅助的微创开颅术或内镜条状颅骨切除术可能提供一种更安全的方法，以保留潜在的骨缝，而非丢弃相关组织3同样，正畸治疗如面罩和扩弓装置已广泛用于治疗矢状向或水平向上颌骨发育不全，一些研究还将治疗的年龄限制延伸至成年患者 通过 微螺钉辅助式腭部扩展器4,5,6此外，间充质干细胞（MSCs）联合可生物降解材料进行颅缝再生，未来可能成为一种潜在的治疗方法，为相关疾病的治疗提供新的方向7然而，颅缝的功能过程或调控机制仍不明确。

骨重塑主要由成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的平衡构成，其中机械信号刺激干细胞的成骨分化发挥着重要作用。经过数十年的研究发现，颅面骨缝是具有高度可塑性的间充质干细胞微环境8缝源性干细胞（SuSCs）是一类异质性的干细胞，属于间充质干细胞（MSCs）或骨干细胞（SSCs）。SuSCs 被标记为 体内 通过四个标志物（包括 Gli1、Axin2、Prrx1 和 Ctsk）标记。Gli1+ SuSCs 尤其严格验证了干细胞的生物学特性，不仅表现出典型间充质干细胞标志物的高表达，还展现出优异的成骨和成软骨潜能9既往研究表明，Gli1+ SuSCs 在张力作用下积极参与新骨形成，表明其作为支持牵张成骨的骨缝干细胞来源10.

过去，人们已对干细胞的大量力学特性进行了研究 体外 通过Flexcell、四点弯曲、微磁加载系统等方法。尽管已鉴定出小鼠颅缝来源的间充质细胞 体外11，且最近也已分离出人缝隙间充质干细胞12，缝线细胞的生物力学反应在该情况下仍不明确 体外 系统。为进一步研究骨重塑过程，已建立基于分离颅骨器官培养的缝合扩张模型，为建立一种有效的 体内 缝合扩张模型1,13. 家兔14 和大鼠15 在缝线扩张的基础研究中，小鼠一直是应用最广泛的动物模型。然而，由于小鼠基因组与人类高度同源，拥有大量基因修饰品系，并具备较强的繁殖和杂交能力，因此更适合作为研究人类疾病的动物模型。目前现有的颅缝扩张小鼠模型通常依赖不锈钢正畸弹簧丝对矢状缝施加牵张力。16,17在这些模型中，于每侧顶骨上钻两个孔以固定扩张装置，且将导线埋置于皮肤下，这可能影响细胞的活化模式。

在可视化方法方面，长期以来普遍采用矢状方向切片的二维观察。然而，考虑到骨重建是一个复杂的三维动态过程，获取完整的三维信息已成为迫切需求。PEGASOS组织透明化技术应运而生，以满足这一需求18,19。该技术在硬组织和软组织透明化方面具有独特优势，能够实现骨重建全过程在三维空间中的重现。

为了更深入、全面地了解骨重建时期内的生理变化，本研究建立了一种标准的矢状缝扩张小鼠模型，将弹簧置于手工制作的夹持器之间10。通过标准化的酸蚀和粘接程序，扩张装置可牢固地粘接于颅骨上，从而在矢状缝处产生垂直方向的张力。此外，在骨扩张后对矿化骨进行双重标记，随后应用PEGASOS组织透明化方法，以完整可视化缝扩张后的骨形态学变化。

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方案

本研究所描述的所有实验程序均经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物护理委员会批准（SH9H-2023-A616-SB）。实验使用4周龄雄性C57BL/6小鼠。所有使用器械均在操作前进行灭菌处理。

1. 缝线扩张模型的制备

  1. 两个固位夹的制备。
    1. 使用0.014''澳丝或不锈钢丝（见材料表），用细丝钳弯制直径为2 mm的螺旋环，两侧各保留1 mm的尾部（图1A）。
    2. 将导丝及固位夹通过高压蒸汽灭菌器、等离子灭菌器或合适的冷灭菌剂（如戊二醛）进行手术前灭菌处理。
  2. 弹簧的制备。
    1. 准备定制的不锈钢弹簧。
      注：本研究中使用的压缩弹簧参数为：钢丝直径0.2 mm，外径1.5 mm，节距1 mm，总长度7 mm（图1B）。每压缩1 mm可产生约30 g的推力。
    2. 在安装前将弹簧剪至合适长度。实验前应确认特定弹簧所施加的力值。
      注：只要在平行实验中力值大小一致，弹簧尺寸可有所变化。若条件受限，可通过台式单轴测试仪或小型电子测力计（见材料表） 测量力值。 通过测量弹簧长度变化来评估其所产生的力值大小（图1C-E）。需注意，应根据小鼠的年龄、骨质状况以及研究目的调整弹簧加载的力值。
    3. 准备一根长度为7 mm的直澳丝或直钢丝，并制作两个直径为2 mm的纸片作为阻挡物（图1F）。

2. 矢状缝扩张手术

  1. 麻醉：使用替来他明（25 mg/kg）、唑拉西泮（25 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。同时，在眼睛上涂抹无菌眼膏以防止角膜干燥。通过夹捏脚趾来判断小鼠的麻醉深度。
    注意：以下特征表明小鼠已达到适当的麻醉深度：呼吸缓慢而平稳、四肢无力、肌肉松弛、皮肤针刺反射和眼睑反射消失，以及角膜反射减弱。
  2. 去毛与消毒：使用脱毛膏小心去除小鼠头顶的毛发，避免接触眼睛。随后，交替使用碘伏和75%酒精对术区进行消毒。通过皮下注射给予小鼠美洛昔康（1 mg/kg）作为镇痛剂。 
  3. 体位固定：将小鼠俯卧放置，并使用手术胶带将其四肢固定在手术台上。
  4. 切开头皮瓣：使用手术剪沿小鼠颈部附近的头皮做弧形切口，充分暴露矢状缝及周围颅骨。之后，用6-0缝线将头皮瓣固定在手术台上。
  5. 酸蚀后粘接固定夹持器。
    1. 干燥颅骨后，用37%磷酸酸蚀20秒，并用生理盐水清洗酸蚀区域（图2A）。使用橡胶吸头吹干颅骨后，可见白色 chalky 残留物。
    2. 使用光固化粘合剂将两个夹持器（步骤1.1中预先准备）分别粘接于矢状缝两侧3 mm处的顶骨上（图2B）。
  6. 复位头皮瓣。
    1. 手动复位头皮瓣（图2C）。标记夹持器位置，在头皮对应双侧固定夹持器的位置处剪出两个小孔，然后将头皮瓣复位。
    2. 同时，将小环穿过小孔使其暴露于皮肤表面，用6-0缝线缝合弧形切口（图2D）。允许皮肤恢复1至3天。  每24小时通过皮下注射给予小鼠美洛昔康（1 mg/kg），持续1至3天。  
      注意：术后每日检查小鼠头皮活动情况及夹持器是否脱落。不同个体的皮肤在颜色和厚度上存在差异；健康的头皮将保持原有色泽，缝合后皮肤边缘会逐渐融合。若发现头皮感染或手术装置脱落，应立即将该小鼠剔除实验并实施安乐死。
  7. 安装弹簧与引导钢丝。
    1. 将弹簧剪裁至比两个夹持器之间距离长1 mm。
    2. 压缩所选的压力弹簧，并将其置于两侧小线圈之间。
    3. 将不锈钢钢丝穿过小线圈和弹簧，然后释放弹簧，以获得约30 g的初始推力。
    4. 检查小鼠弹簧区域下方的头皮无任何受压现象。
    5. 确认粘接牢固无松动后，使用光固化粘合剂在弹簧与夹持器之间粘接两小片纸片，以在弹簧两端形成屏障（图2E,F）。

3. 矿化骨骼的双重标记

  1. 储备液的制备。
    1. 用蒸馏水配制含有0.9% NaCl 和2% NaHCO3的稀释液。
    2. 用该稀释液配制20 mg/mL的茜素络合物二水合物（Alizarin complex dihydrate）和10 mg/mL的钙黄绿素（Calcein）（见材料表）。
    3. 使用pH测量仪将pH值调节至7.4。每次测量之间需冲洗pH探针，以确保读数准确。
    4. 将染料置于无菌容器中，用铝箔避光，于4 °C冰箱中保存。
  2. 制备工作液。注射前，使用溶解液将储备液稀释至钙黄绿素1 mg/mL、茜素络合物二水合物2 mg/mL。
  3. 在两个时间点分别腹腔注射5 mg/kg的钙黄绿素绿（Calcein green）和20 mg/kg的茜素红（Alizarin red），以标记矿化骨组织并分析两个时间点之间的变化。通常在注射后12–14小时采集样本。
    注意：注射前将染料预热，确保注射时间不少于3分钟。注射间隔取决于扩张时间。本研究中，茜素红和钙黄绿素绿分别在组织扩张前夜（O/N）和采集前夜（O/N）注射。
  4. 在第二次注射后的第二天，采集用于组织透明化处理的完整颅骨。

4. EdU 染色

  1. 腹腔注射：在处死小鼠前2小时进行腹腔注射EdU（遵循机构批准的实验方案）。剂量为每10克体重注射1毫克。
  2. 标记试剂混合液配制：将Tris缓冲盐水（终浓度100 mmol/L，pH 7.6）、CuSO4（终浓度4 mmol/L）、Sulfo-Cyanine 3 Azide（终浓度2–5 µmol/L）和抗坏血酸钠（终浓度100 mmol/L，每次使用前新鲜配制）混合（参见材料表）。
  3. EdU整体组织染色：在PEGASOS组织透明化方法的组织脱色步骤（步骤7）之后，将样本置于标记试剂混合液中，在室温（RT）下孵育1天。

5. 微型计算机断层扫描成像

  1. 组织固定与保存：将颅骨在 4% 多聚甲醛（PFA）中于 4 °C 过夜固定，随后在扫描前保存于 0.5% PFA 中。
  2. 扫描与分析：使用高分辨率微型计算机断层扫描（µCT）成像系统对样品进行扫描，体素大小为 7 µm。

6. PEGASOS 组织透明化工作溶液的配制

  1. 4% 多聚甲醛（PFA）：将 4 g PFA 粉末溶于 1× PBS 中，定容至 100 mL。
  2. 心脏灌注液：0.02% 肝素，即 20 mg 肝素粉末溶于 1× PBS 中，定容至 100 mL；或使用 0.05 mol/L EDTA，即 0.05 mol 的乙二胺四乙酸（EDTA）（见材料表），溶于去离子水溶液中，定容至 1 L。
  3. 脱钙液：0.5 mol/L EDTA，即 0.5 mol 的乙二胺四乙酸（EDTA），溶于去离子水溶液中，定容至 1 L。
  4. 脱色液：25% Quadrol，即将 250 mL Quadrol（N, N, N', N' - 四(2-羟丙基)乙二胺）（见材料表）溶于去离子水中，定容至 1 L。
    注：由于 Quadrol 黏度较高，配置前可加热至 60 °C 以提高流动性。
  5. 脱脂液：30%、50%、70% 叔丁醇（tB）（见材料表），按体积分数用水配制。
    注：考虑到纯 tB 在室温下呈结晶状态，使用前需加热至 60 °C 至完全溶解。随后加入 3%–5%（v/v）三乙醇胺（TEA），调节溶液 pH >9.5。
  6. 脱水液：TB-PEG 溶液，70% tB + 27% PEG-MMA + 3% Quadrol（v/v），其中 PEG-MMA 为平均分子量为 500 的聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（聚乙二醇甲基丙烯酸酯 500，PEG-MMA 500）（见材料表）。
  7. 透明液：BB-PEG 溶液，75% BB + 22% PEG-MMA + 3% Quadrol（v/v），其中 BB 为苯甲酸苄酯（BB）。

7. 采用 PEGASOS 方法实现颅骨的透明化

  1. 通过腹腔注射麻醉剂对小鼠 进行麻醉（步骤 2.1），并通过夹趾反应判断小鼠 的麻醉深度，确保在心脏灌注前无痛觉反应。
  2. 进行心脏灌注和固定。
    1. 将小鼠腹部朝上固定，用胶带固定四肢，沿胸廓周缘小心剪开，充分暴露胸腔。
    2. 用眼科剪在右心房剪开一个小口后，立即在左心室心尖处插入 22 G 灌注针。
      注意：仅插入针尖部分，避免因插入过深而损伤心脏瓣膜；否则灌注液将进入肺循环，影响体循环的灌注效果。
    3. 推动注射器中 30–50 mL 的心脏灌注液（步骤 6.2），可见肝脏由鲜红色逐渐变为苍白。
    4. 当右心房流出液完全变澄清后，以等体积灌注 4% PFA 溶液。PFA 灌注操作应在通风橱中进行。
    5. 解剖并分离组织与器官，并在 4 °C 条件下用 4% PFA 固定过夜。
  3. 组织脱钙：对于 EdU 染色处理的样本，将固定后的硬组织置于含 0.5 mol/L EDTA（pH 7.0）溶液（10 mL）的摇床上，37 °C 处理约 2 天，每日更换溶液。
    注意：在用于标记钙螯合剂骨骼的标准化 PEGASOS 方法中，应跳过脱钙步骤，以完整保留信号。若需观察内源性荧光或整体免疫染色信号，则必须对骨骼进行脱钙处理。
  4. 组织脱色：将固定后的颅骨置于含 25% Quadrol 溶液（20 mL） 的摇床上，37 °C 处理 1 天，更换一次溶液。
    注意：脱色时间与组织中的血红素含量相关。应观察处理液的颜色，其深浅程度可反映是否需要继续更换溶液。
  5. EdU 染色：将样本在 1× PBS 中清洗 5 分钟（共三次），随后浸入标记反应液中 1 天。之后在 1× PBS 中清洗 1 小时（共三次）。
  6. 组织脱脂与脱水
    1. 将组织依次置于 30% tB、50% tB 和 70% tB 溶液中，在 37 °C 摇床上进行梯度递减处理，每种浓度处理约 2 小时。
    2. 随后在 TB-PEG 溶液中于 37 °C 摇床上脱水 6 小时。
      注意：上述处理时间可根据组织数量适当延长或缩短。
  7. 组织透明化：将完全脱水的组织置于 BB-PEG 溶液中，在 37 °C 摇床上处理（2–4 小时），直至组织透明。目前样本可保存长达 1–2 年。
    ​注意：在组织几乎完全透明后，打开管盖，使样本及介质在摇动条件下暴露于空气中，可进一步提高透明度。该方法适用于单个组织或器官的透明化，也适用于幼鼠的整个头部和身体。但对于成年小鼠的全身体透明化，应采用全循环灌注方式进行上述操作。

8. 成像

注意：本研究中采用共聚焦显微镜对透明组织进行三维可视化。光片显微镜也适用于本方案。此前已验证多种操作系统可用。此处以激光共聚焦显微镜操作系统为例（见材料表）。

  1. 根据用户手册，按照正确步骤打开激光共聚焦显微镜及LAS AF操作界面。在不同拍摄通道中开启所需的激光并调节功率。设置光路及相应的波长，茜素红（Alizarin red）使用561 nm，钙黄绿素（Calcein green）使用488 nm，EdU信号的检测则根据标记混合物选择其中任一波长。
  2. 将透明样本置于可承载厚体标本的凹形玻璃培养皿、包埋盒或自制放置装置（如防水胶）中，并用透明液体浸没透明样本。
  3. 选择低倍物镜以快速定位样本。使用快速扫描功能对整个颅骨组织进行概览，确定成像的兴趣区域。
  4. 设置输出功率，选择扫描模式，并首先调整拍摄参数（分辨率、扫描速度、缩放系数、图像质量、平均背景噪声） 等等.).
    注意：通常情况下，Smart Gain 范围为 500 至 800（信号和噪声均会变化）；Smart Offset 应尽可能接近 0，同时确保图像质量（以降低背景噪声）。当 PMT 增益高于 800，或 HyD 增益大于 100% 时，若亮度仍然不足，可适当增加激光强度，但原则上应尽可能保持较低水平。
  5. 设置轴向距离Z的范围和Z步长，从透明组织的最浅侧开始逐层深入；即，设定最深侧和最浅侧。
    注意：请确认每种物镜的放大倍数和工作距离。仔细设置Z轴范围，切勿超过所选物镜限定的工作距离。 "z-Galvo" 在需要精细调控时可选择。
  6. 重新设置拍摄参数，然后开始拍摄。完成后，通过多功能模块对图像进行合并和处理。最后，按照指定顺序存储数据并关闭仪器。

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结果

利用本方案，已建立用于矢状缝扩张的小鼠模型（图1-2）。为了在缝扩张后对骨改建变化进行三维可视化观察，采用PEGASOS组织透明化方法处理扩张后的整个颅盖骨。灌注后，分离颅盖骨（图3A），并继续进行适当的PEGASOS处理流程（表1 和 表2）。值得注意的是，无论是否进行脱钙处理，在完成完整的PEGASOS流程后，颅盖骨几乎均变得透明（图3B、C）。

为了快速观察扩张后的变化，对采集并固定的样本进行了µCT成像。与对照组（图4A）相比，在施加牵张力1天后，颅缝逐渐且显著地扩张（图4B）。至第5天时，骨边缘出现蓬松状骨性突...

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讨论

我们采用标准的缝线扩张小鼠模型，观察在整个为期一个月的重塑周期中每周发生的规律性形态变化10。该模型通过扩张颅骨缝，可用于研究颅骨骨重塑与再生，同时也适用于在体研究多种缝线细胞。in vivo。为了全面展示此类研究的结果，需要对染色组织进行三维可视化。因此，将已知在硬组织透明化方面高效的 PEGASOS 技术19,20 与双标记及 EdU 染色相结合，以揭示扩张过程中矿化速率的增加以及增殖细胞的分布情况。

关于缝合器扩张手术，其中一个关键步骤是固位环的粘接。为确保固位环底部与骨面形成牢固结合，我们对固位环底部的酸蚀处理和粘接流程进行了标准化。固位环上的小环应垂直于骨面，并与头皮上的小孔相对应。缝合头皮后，小环应通过头皮小孔自然且均衡地暴露于皮肤表面，以避免在安装施力弹簧和引导丝时固位环发生塌陷，从而导致手术失败。此外，选择合适的施力弹簧对手术成功至关重要，因为它不仅便于弹簧的安装，还能防止固位环脱落，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢上海交通大学医学院耳科学研究所提供的实验平台与协助。本研究得到上海市浦江人才计划（22PJ1409200）；国家自然科学基金（No.11932012）；上海交通大学医学院附属第九人民医院博士后科研基金；上海交通大学医学院附属第九人民医院基础研究项目资助（JYZZ154）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
37% 酸蚀XihubiomE10-02/1807011
茜素红Sigma-AldrichA3882
AUSTRALIAN WIREA.J.WILCOCK0.014''
苯甲酸苄酯Sigma-AldrichB6630
钙黄绿素绿Sigma-AldrichC0875
无水硫酸铜(II)Sangon BiotechA603008
测力计SanliangSF-10N
EDTASigma-AldrichE9884
EdUInvitrogenE104152
激光共聚焦显微镜LeicaSP8
PBSSangon BiotechE607008
PEG-MMA 500Sigma-Aldrich447943
PFASigma-AldrichP6148 
pH 计Mettler ToledoS220
QuadrolSigma-Aldrich122262
抗坏血酸钠Sigma-AldrichA4034
碳酸氢钠Sangon BiotechA500873
氯化钠Sangon BiotechA610476
氢氧化钠Sigma-AldrichS5881
弹簧TAOBAO0.2*1.5*1*7
Sulfo-Cyanine3 叠氮化物LumiprobeA1330
叔丁醇Sigma-Aldrich360538 避光保存。切勿冷冻。
Transbond MIP
潮湿不敏感底涂剂		3M Unitek712-025
Transbond XT
光固化粘接糊剂		3M Unitek712-035
三乙醇胺Sigma-AldrichV900257
Tris缓冲盐水Sangon BiotechA500027

参考文献

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颅面缝PEGASOS 组织透明化颅骨骨组织EdU 染色机械力加载成骨前体细胞
一种用于骨缝扩张小鼠模型中骨重塑的三维可视化技术
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