缝合扩张小鼠模型中骨重塑的 3D 可视化技术

颅面缝合线是连接颅面骨的纤维组织，在颅面骨的生长和重塑中起着至关重要的作用。缝合线的结构类似于河流，提供细胞资源流来滋养和构建"河岸"，称为成骨前沿，通过膜内成骨促进颅面骨的形成¹。

对颅面缝合线的兴趣是由临床需求驱动的，即了解颅缝过早闭合和面部缝合功能障碍，这可能导致颅面畸形，甚至危及儿童生命的疾病。开放缝合切除术是临床治疗的常规应用，但长期随访显示一些患者再骨化复发不完全².微创开颅手术由扩张弹簧或内窥镜条纹颅骨切除术辅助，可能提供一种更安全的方法来保留潜在的缝合线，而不是丢弃组织³.同样，面罩和扩张器具等骨科疗法已被广泛用于治疗矢状或水平上颌骨发育不全，一些研究将年龄限制扩大到通过微型螺钉辅助腭扩张器治疗成年患者 ^4,5,6。此外，间充质干细胞 （MSCs） 结合可生物降解材料的颅缝再生是未来的潜在疗法，为相关疾病的治疗提供了新的方向⁷.然而，缝合线的功能过程或调节机制仍然难以捉摸。

骨重塑主要由成骨细胞进行的骨形成和破骨细胞进行的骨吸收之间的平衡组成，其中机械信号刺激的干细胞成骨分化起着重要作用。经过几十年的研究，人们发现颅面缝合线是高度可塑的间充质干细胞生态位⁸。缝合干细胞（SuSCs）是一组异质性干细胞，属于间充质干细胞（MSCs）或骨干细胞（SSCs）。SuSCs 在体内 由Gli1、Axin2、Prrx1和Ctsk等4个标记物标记，特别是Gli1⁺ SuSCs，严格验证了干细胞的生物学特性，不仅表现出典型MSC标志物的高表达，而且表现出优异的成骨和软骨生成潜力⁹。先前的研究表明，Gli1⁺ SuSCs 在拉伸力下积极促进新骨形成，将它们确定为支持牵引成骨的缝合干细胞来源¹⁰。

过去，通过Flexcell、四点弯曲、微磁体加载系统等在体外研究了干细胞的广泛机械特性。尽管在体外¹¹中已经鉴定出小鼠颅骨缝合来源的间充质细胞，并且最近也分离出人类缝合间充质干细胞¹²，但缝合细胞的生物力学反应在体外系统中仍不清楚。为了进一步研究骨重塑过程，建立了基于分离颅骨器官培养的缝合扩张模型，为建立有用的体内缝合扩张模型铺平了道路 ^1,13。兔¹⁴ 和大鼠¹⁵ 是缝合扩张基础研究中应用最广泛的动物。然而，小鼠因其与人类高度同源的基因组、众多的基因修饰系和较强的生殖杂交能力，是探索人类疾病的首选动物模型。现有的颅骨缝合扩张小鼠模型通常依靠不锈钢正畸弹簧线对矢状缝线施加拉伸力^16,17。在这些模型中，在顶骨的每一侧各打两个孔来固定扩张装置，并将导线嵌入皮肤下，这可能会影响细胞活化模式。

在可视化方法方面，切片在矢状方向上的二维观察已经普遍采用数十年。然而，考虑到骨重塑是一个复杂的三维动态过程，获取完整的三维信息已成为当务之急。PEGASOS组织透明技术的出现是为了满足这一要求^18,19。它为硬组织和软组织的透明度提供了独特的优势，使完整的骨重塑过程能够在三维空间中再现。

为了更深入、更全面地了解骨重塑期的生理变化，建立了一个标准的矢状缝合扩张小鼠模型，在手工制作的支架之间设置了弹簧设置¹⁰。通过标准化的酸蚀刻和粘合程序，膨胀装置可以牢固地粘合到颅骨上，产生垂直于矢状缝的拉力。此外，在矿化骨扩张后双标记后应用PEGASOS组织清除方法，以充分可视化缝合扩张后的骨骼建模变化。

本文描述的所有实验程序均已获得上海交通大学医学院附属上海市第九人民医院动物护理委员会批准（SH9H-2023-A616-SB）。本研究使用4周龄的C57BL / 6雄性小鼠。所有使用的器械在手术前都经过消毒。

1. 缝合扩张模型的准备

1. 准备两个固定架。
   1. 使用 0.014 英寸澳焊丝或不锈钢丝（见 材料表）用轻线钳制作螺旋环。环的直径为2 mm，两侧保留1 mm的尾巴（图1A）。
   2. 在高压灭菌器、等离子灭菌器或合适的冷灭菌剂（例如戊二醛）中对手术用的电线和支架进行消毒。
2. 准备弹簧。
   1. 准备定制的不锈钢弹簧。
      注意:本研究使用线径为 0.2 mm、外径为 1.5 mm、间隔空间为 1 mm 且长度为 7 mm 的压力弹簧（图 1B）。每个 1 毫米的弹簧压缩获得约 30 g 的推力。
   2. 在设置之前将弹簧切成可用的长度。在实验前确认专用弹簧的力。
      注意:只要平行实验中的力大小相同，弹簧的大小就会变化。如果条件有限，则通过台式单轴测试仪器或小型电子测功机（见材料表）测量力。根据力的大小评估长度变化（图1C-E）。值得注意的是，有必要根据小鼠的年龄、骨骼状况和研究对象来改变弹簧力载荷值。
   3. 准备一根7毫米长的澳大利亚直线或直钢丝，并制作两张直径为2毫米的纸作为屏障（图1F）。

2. 矢状缝扩张手术

1. 麻醉:用替利他明（25mg / kg），唑拉西泮（25mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）麻醉小鼠。同时，在眼睛上涂抹无菌眼膏，以防止角膜干燥。通过脚趾捏来判断小鼠的麻醉深度。
   注意:以下特征表明小鼠被适当麻醉:呼吸缓慢而稳定，四肢无力，肌肉松弛，皮肤针灸反射和眼睑反射消失，以及角膜反射较弱。
2. 毛发去除和消毒:用脱毛膏小心地去除头顶的毛发;避免触摸眼睛。不久之后，交替使用碘伏和 75% 酒精对手术部位进行消毒。通过皮下注射给予美洛昔康（1mg / kg）作为小鼠的镇痛剂。
3. 身体姿势固定:将鼠标放在前面，用手术胶带将四肢固定在手术台上。
4. 开放头皮瓣:使用手术剪刀沿着小鼠颈部附近的头皮进行弓形皮瓣，完全暴露矢状缝线和周围的颅骨。之后，在手术台上用 6-0 缝合线固定头皮瓣。
5. 酸蚀后粘合固定支架。
   1. 干燥头骨并用37%磷酸蚀刻20秒，并使用生理盐水清理酸蚀刻（图2A）。用橡胶移液器球茎干燥颅骨后，白垩状残留物会很明显。
   2. 用光固化粘合剂将顶骨两侧的两个支架（在步骤1.1中制备）粘合在距矢状缝合线3毫米处（图2B）。
6. 重置头皮瓣。
   1. 手动放回头皮瓣（图2C）。标记支架的位置，在双侧固定支架的相应位置在头皮上切两个小孔，然后重置拍打的头皮。
   2. 同时，将小环穿过孔，露出皮肤表面。用6-0缝合线缝合弯曲的切口（图2D）。皮肤恢复需要一到三天。每24小时皮下注射美洛昔康（1mg / kg）给小鼠施用1至3天。
      注意:手术后，每天检查小鼠头皮的活动以及支架是否脱落。在颜色和厚度方面，皮肤有多种类型;健康的皮肤头皮会保持原来的颜色，缝合后皮肤边缘会逐渐融合在一起。如果发现头皮感染，或者手术装置脱落，请将小鼠从研究中取出并对其进行安乐死。
7. 安装弹簧和导丝。
   1. 将弹簧切割比两个支架之间的距离长 1 毫米。
   2. 压缩选定的压力弹簧并将其放置在两侧的小线圈之间。
   3. 将不锈钢丝穿过小线圈和弹簧，松开弹簧以获得约 30 g 的起始推力。
   4. 检查鼠标弹簧区域下方的头皮是否没有任何压缩。
   5. 确认粘合牢固无松动后，用光固化粘合剂在弹簧和支架之间粘合两张纸片，以便在弹簧的两端设置屏障（图 2E，F）。

3.矿化骨的双重标记

1. 储备溶液的制备。
   1. 用含有 0.9% NaCl 和 2% NaHCO₃ 的蒸馏水制备稀释溶液。
   2. 使用稀释液制备 20 mg/mL 茜素复合物二水合物和 10 mg/mL 钙黄绿素（见 材料表）。
   3. 使用 pH 测量设备将 pH 值调节至 7.4。在两次测量之间冲洗pH探头，以确保读数准确。
   4. 将染料放入无菌容器中，并储存在4°C的冰箱中;箔纸用于防止光线进入。
2. 准备工作溶液。注射前，使用溶解溶液将储备溶液稀释至钙的1mg / mL和茜素复合物的2mg / mL二水合物。
3. 在两个时间点腹膜内注射5mg / kg钙黄绿素绿和20mg / kg茜素红，以标记矿化骨并分析两次之间的变化。通常，在注射后12-14小时收集样品。
   注意:注射前加热染料，并确保注射时间不少于3分钟。注射间隔取决于膨胀时间。在这项研究中，茜素红和钙黄绿素绿分别在扩增前和收集前注射过夜（O/N）。
4. 在第二次注射后一天收集准备用于组织清除程序的整个颅骨。

4. EdU染色

1. 腹腔注射:在对小鼠实施安乐死之前2小时腹膜内注射EdU（遵循机构批准的方案）。剂量为1mg / 10g体重。
2. 标记混合物制备:混合Tris缓冲盐水（最终100 mmol/L，pH 7.6），CuSO₄ （最终4 mmol/L），磺基花青3叠氮化物（最终2-5μmol/L）和抗坏血酸钠（最终100 mmol/L，每次使用新鲜）（见 材料表）。
3. EdU整体挂片染色:在PEGASOS组织透明化方法（步骤7）中进行组织脱色步骤后，将样品在室温（RT）下放入标记混合物中1天。

5. 显微计算机断层扫描成像

1. 组织固定和储存:将颅骨固定在4°C O/N的4%多聚甲醛（PFA）中，并在扫描前将其储存在0.5%PFA中。
2. 扫描和分析:使用高分辨率和体素尺寸为 7 μm 的显微计算机断层扫描 （μCT） 成像系统扫描样品。

6. PEGASOS组织清理工作液的制备

1. 4% 聚甲醛 （PFA）:将 4 g PFA 粉末溶解在 1× PBS 中至 100 mL。
2. 心脏灌注液:0.02%肝素，即20mg肝素粉溶于1×PBS至100mL;或者，使用0.05mol/L EDTA，即0.05mol乙二胺四乙酸（EDTA）（见 材料表），溶解在去离子水溶液中至总体积为1L。
3. 脱钙液:0.5mol/L EDTA，即0.5mol乙二胺四乙酸（EDTA），溶于去离子水溶液中至总体积为1L。
4. 脱色溶液:25%Quadrol，其是250mL四醇（N，N，N'，N'-Tetrakis（2-羟丙基）乙二胺）（见 材料表）溶于去离子水中至总体积为1L。
   注意:由于 Quadrol 的粘度，可以在配置前将其加热到 60 °C 以增加其流动性。
5. 脱脂液:30%、50%、70%叔丁醇（tB）（见 材料表），按体积分数用水制备。
   注意:考虑到纯tB在室温下是结晶的，必须将其加热到60°C直至溶解后才能使用。随后，加入3%至5%（v / v）三乙醇胺（TEA）以调节溶液的pH值>9.5。
6. 脱水溶液:TB-PEG溶液，70%tB+27%PEG-MMA+3%Quadrol（v/v），其中PEG-MMA是平均分子量为500的聚（乙二醇）甲基丙烯酸甲醚（聚（乙二醇）甲基丙烯酸酯500，PEG-MMA 500）（见 材料表）。
7. 透明溶液:BB-PEG溶液，75%BB+22%PEG-MMA+3%四醇（v/v），其中BB为苯甲酸苄酯（BB）。

7. PEGASOS方法的颅骨透明度

1. 通过腹腔注射麻醉剂对小鼠进行麻醉（步骤2.1），并通过捏反应判断小鼠的麻醉深度，以确保心脏灌注前无阻力反应。
2. 进行心脏灌注和固定。
   1. 向上握住鼠标的腹部，用胶带固定四肢，并沿着胸部的圆周小心地切开，使其完全暴露。
   2. 用眼科剪刀在右心房切开一个小切口后，立即在左心室的顶端插入灌注22G针。
      注意: 仅插入针尖，以避免因过度插入而损坏心脏瓣膜。否则，心脏灌注液会进入肺循环，影响体循环的灌注效果。
   3. 将 30-50 mL 心脏灌注液（步骤 6.2）推入注射器。可以看出，肝脏从鲜红色逐渐变为苍白。
   4. 在右心房流出的液体完全透明后，以等体积注入 4% PFA 溶液。PFA灌注的操作在通风罩中进行。
   5. 解剖并分离组织和器官，并在4°C下用4%PFA固定过夜。
3. 组织脱钙:对于通过EdU染色处理的样品，将固定的硬组织置于0.5mol/L EDTA（pH 7.0）溶液（10mL）中，在37°C的摇床上约2天，并每天更换液体。
   注意:在钙螯合剂标记的骨骼的标准化PEGASOS方法中跳过脱钙过程，以完全保留信号传导。需要脱钙来处理骨骼，以可视化内源性荧光或整体免疫染色信号。
4. 组织脱色:将固定的颅骨置于25%Quadrol溶液（20mL）中，在37°C的摇床上1天，并更换一次液体。
   注意:脱色时间与组织中的血红素含量有关。观察处理液的颜色，因为颜色的深度代表需要继续进行液体置换处理。
5. EdU染色:将样品在1×PBS中冲洗5分钟（3次），然后将它们浸入标记混合物中1天。之后，在1×PBS中冲洗样品1小时（三次）。
6. 组织脱脂和脱水
   1. 将组织依次置于30%tB，50%tB和70%tB溶液中，以在37°C的振床上进行梯度减小。 以每种浓度放置约2小时。
   2. 随后，在37°C的振荡台上将样品在TB-PEG溶液中脱水6小时。
      注意:上述处理时间可以根据组织的数量增加或减少。
7. 组织透明度:将完全脱水的组织置于BB-PEG溶液中，在37°C（2-4小时）的振床上，直至透明。目前，样品可以储存长达 1-2 年。
   注意:几乎完全清除后，打开管盖，将样品和介质暴露在空气中，摇晃将进一步提高透明度。该方法适用于提高幼鼠个体组织和器官的透明度，以及整个头部和身体的透明度。然而，为了成年小鼠全身的透明度，上述步骤应使用全周期灌注法进行。

8. 影像学检查

注:在本研究中，共聚焦显微镜用于透明组织的 3D 可视化。光片显微镜也适用于该协议。之前已经验证了几个操作系统可用。这里以激光共聚焦显微镜操作系统为例（见 材料表）。

1. 根据用户手册，按照正确的步骤打开激光共聚焦和 LAS AF 操作界面。在不同的拍摄通道中打开所需的激光，并调整功率。设置光路和相应的波长，茜素红为561nm，钙黄绿素绿为488nm，其中任何一个都用于根据标记混合物的EdU信号。
2. 将透明样品放入可携带厚标本的凹玻璃培养皿中，包埋盒，或防水胶等自制放置装置，将透明样品浸入透明液体中。
3. 选择低倍物镜以快速定位样品。使用快速扫描功能对整个颅骨组织进行概览，并找到成像感兴趣的区域。
4. 设置输出功率，选择扫描模式，首先调整拍摄系数（分辨率、扫描速度、变焦系数、图像质量、平均背景噪点 等）。
   注意: 通常，智能增益范围为 500 到 800（信号和噪声变化）;智能偏移尽可能接近 0，同时确保图像质量（以减少背景噪音）。当PMT增益高于800，或HyD增益大于100%，亮度仍然不足时，可以适当提高激光强度，但原则上越低越好。
5. 设置轴距Z范围和Z步长，从透明组织的最浅侧向下钻取;也就是说，设置最深和最浅的侧面。
   注意: 确认每个镜头的分类和工作距离。仔细设置Z范围，不要操作超过所选镜头限制的工作距离。当需要精细调节时，可以选择"z-Galvo"。
6. 再次设置拍摄参数，然后开始拍摄。完成后，通过多功能模块对图像进行合并处理。最后，按指示的顺序存储和关闭仪器。

使用该协议，已经建立了矢状缝合线扩张的小鼠模型（图1-2）。对于缝合线扩张后骨骼建模变化的 3D 可视化，将 PEGASOS 组织清除方法应用于扩张后的整个颅骨。灌注后，分离颅骨（图3A），并继续适当的PEGASOS过程（表1和表2）。值得注意的是，无论是否进行脱钙，在完整的PEGASOS过程后，颅骨几乎变得透明（图3B，C）。

为了快速观察扩增后的变化，对采集和固定的样品使用μCT。与对照组（图4A）相比，颅缝线在用力1天后逐渐显着扩大（图4B）。到第五天，骨边缘出现蓬松的骨突起（图4C）。

为了在扩张后整个缝合线中对矿化并列率进行三维可视化，即使在未脱钙的颅骨上，也采用了双重标记方法和高效的PEGASOS技术（图5）。在生理条件下，前后标记信号之间存在微小变化（图5A），而力负荷显着激活成骨。新矿化骨的锯齿形图案，用单个钙黄绿色标记标记，在扩张 7 天后变宽（图 5B，C）。在高分辨率三维可视化中，边缘骨的图案变化表明了缝合线扩张后的骨重塑过程，并且缝合线两侧新形成的骨的程度各不相同（图5C）。

此外，为了可视化缝合扩张时细胞的增殖速率，尝试使用PEGASOS组织清除方法和钙化过程进行整体安装EdU掺入。成功地，标记是有效的，并且在透明的组织中保存完好。在对照组中，几个 EdU+ 细胞弥漫分布在整个缝合线中（图 6A），这可能对生理性骨重塑很重要，但在 2-D 切片中可能被忽视。扩增1天后，增殖细胞在缝合线的中间和边缘达到峰值（图6B）。随着缝合线的扩大，增殖细胞的数量随着时间的推移而减少，达到第7天（图6C）。突出显示的细胞是骨髓中的小圆形细胞，表明血细胞，与EdU +缝合细胞不同（图6C）。

图1:为手术准备了重要材料。 固定架由不锈钢丝制成。它们的直径为 2 毫米，两侧 （A） 保留了 1 毫米的尾巴。施加线径为0.2 mm、外径为1.5 mm、间隔间距为1 mm的压力弹簧（B）。拉力由Dynameter（C，D）检测。在这个实验中，每个 1 mm 的弹簧压缩获得约 30 g （E） 的推力。将纸屑切成直径为 2 毫米的风筝形状，用作屏障 （F）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2:缝合扩张小鼠模型的手术过程。 翻转颅骨瓣后，在固定支架暴露的位置进行酸蚀刻 （A） 和粘合 （B）。重置头皮瓣 （C） 后，将支架暴露在标记位置 （D）。在两个支架之间设置一个弹簧，以对颅骨缝合线施加膨胀力，并在确认支架牢固粘合后，将两张纸片固定在弹簧的两端作为屏障（E，F）。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3:对两个颅骨进行 PEGASOS 组织清除程序，有或没有脱钙。 灌注后，颅骨分离，并附有一些血迹和软组织（A）。经历过脱钙过程（B）或未脱钙过程（C）的颅骨在PEGASOS的整个过程后几乎完全透明。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 4:施加拉伸力后颅骨缝线逐渐扩张。 无力载荷矢状缝合线 （A） 和受力载荷后 1 天和 5 天 （B，C） 的 μCT 图像。比例尺:100 μm。 Exp = 膨胀。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 5:3D 图像中缝合线扩张后激活的成骨。 （A-C） 通过PEGASOS方法清除的双标记矢状缝线的三维可视化。茜素红和钙黄绿素绿分别在扩增前和扩增7 d后安乐死前腹腔注射过夜（B，C），与无机械负荷的对照组相同时间点（A）。使用5倍透镜有效地获取整个缝合图像（A，B），并用10倍透镜放大（C，C'，C''）中的盒形图像。比例尺 A，B:100 μm，C:150 μm。 Exp = 膨胀。 请点击这里查看此图的较大版本.

图 6:3D 图像中拉伸力加载时缝合细胞高度增殖。 结合PEGASOS组织清除方法的全安装掺入试验显示，在安静（A）或强制加载1天和7天（B，C）后，整个缝合线中的增殖细胞。用 10 倍镜头成像。虚线勾勒出矢状缝线的两条边。比例尺:100 μm。 Exp = 膨胀。 请点击这里查看此图的较大版本.

表 1:使用 EdU 染色的颅骨的 PEGASOS 组织清除程序。

表2:颅骨的PEGASOS组织清除程序，用钙黄绿素绿和茜素红对矿化骨进行双重标记。

作者没有什么可透露的。