本文介绍了一种将处于不同成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的实验方案。人脑类器官采用非定向标准化方案进行培养。
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本文内容
摘要
摘要
将类器官移植到模式动物（如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛尿囊膜（CAM））的血管化组织中，已被证明是模拟新生血管形成的高效方法。CAM 是一种富含血管的胚外膜，其免疫反应性较低，因此成为人源细胞移植的理想宿主模型。
本文描述了将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）中的策略。人脑类器官的细胞组成随时间发生变化，反映了人类大脑发育过程中的关键阶段。我们将处于不同成熟阶段的人脑类器官——神经上皮扩增阶段（18天体外培养，DIV）、早期神经发生阶段（60天体外培养，DIV）以及早期胶质发生阶段（180天体外培养，DIV）——移植至孵化第7天（E7）的鸡胚尿囊膜上。移植5天后获取类器官，并对其组织学特征进行分析。
在移植的类器官中或移植物邻近区域均未检测到新生血管形成的组织学迹象或异常血管。此外，观察到移植类器官的细胞组成发生显著变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞数量增加。然而，这些细胞结构的变化依赖于类器官的成熟阶段。综上所述，这些结果表明脑类器官可在鸡胚尿囊膜（CAM）上生长，并且其细胞结构特征会因移植时所处的成熟阶段不同而有所差异。
引言
人脑类器官是一种新兴技术，能够在体外重现人脑的早期发育过程in vitro1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，而血管系统不仅在脑内环境稳态中发挥不可或缺的作用，也在脑发育过程中具有关键功能4。除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，脑血管系统在发育过程中调控神经分化、细胞迁移和突触形成5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为脑类器官提供缺失的血管信号和结构支持，从而提升人脑类器官生成的复杂性7。
在已提出的血管化方法中，主要有两种研究方向：将类器官移植到活体生物体内，以及在体外通过共培养内皮细胞和神经细胞的纯in vitro技术8,9,10,11,....
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方案
白来航鸡（Gallus gallus）胚胎的处理遵循美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所发布的《实验动物护理和使用指南》，实验已获得巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会的批准。
1. 非引导性脑类器官制备
- 将 H9 人胚胎干细胞（hESCs）在室温预热的 mTESR1 培养基中培养，细胞融合度控制在 70%，培养容器为 Matrigel（用 DMEM 按 1:40 稀释）包被的 6 孔板，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
注意：Matrigel 必须始终保持在冰上直至用于包被，以防止其发生聚合。 - 按照非定向脑类器官方案2生成脑类器官。
- 使用 500 µL 细胞解离液对 H9 hESCs 进行解离，并在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。用含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基重悬细胞，按每孔 9,000 个细胞接种至经低黏附预处理的 96 孔板中。
- 当类器官在含 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基中聚集成球后，将其转移至诱导培养基中培养 5–6 天。
- 根据非定向脑类器官方案26
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结果
选择用于移植的胚胎成熟时间表
实验从第0天（D0）开始，将受精卵置于38 °C、相对湿度60%的条件下孵育。绒毛尿囊膜（CAM）是一种高度血管化的胚外膜，于卵孵化后发育形成，由尿囊和绒毛膜融合而成。在第1天（D1），即孵育24小时后，穿刺气室以防止绒毛尿囊膜与壳内膜粘连。相较于后期（D4）穿刺，D1穿刺可获得更高质量的气室。绒毛尿囊膜持续生长，至第12天（D12）时包裹整个卵内容物，并牢固附着于壳内膜（图1）。在第7天（D7）将原先的孔扩大，以便于后续样本收获。D7是移植物接种的最佳时间点，此时绒毛尿囊膜已发育成熟，覆盖卵黄囊及胚胎表面。在此阶段，扩大气室孔，借助自动移液器将类器官接种至绒毛尿囊膜上。
脑类器官移植
在脑类器官固有的成熟过程中 体外其细胞组成从神经前体细胞转变为成熟的神经元和胶质细胞。在脊椎动物中，神经血管系统与神经发生是相互交织且相互依赖的发育过程，介导这种交互作用的信号通路在很大程度上依赖于神经组分的成.......
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讨论
本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，包含多个关键步骤，可在不干扰鸡胚存活的前提下，促进人脑类器官移植后的良好生长与发育。我们建议在孵化24小时后（第1天）使用无菌针头刺穿鸡蛋的气室。此外，我们也曾尝试在第4天进行穿刺（通过透光观察蛋壳，检测血管系统的发育情况，以确保仅对健康的胚胎进行操作）。然而，由于尿囊膜血管已接近蛋壳，该操作导致胚胎存活率下降。需要注意的是，施加过大的力量可能导致蛋壳破裂，进而损伤尿囊膜血管系统。使用光源检测蛋壳变薄的区域有助于制作钝性孔洞，同时防止过度穿刺穿透蛋壳，避免侵入尿囊膜。
尽管在孵化过程中鸡蛋的定期翻转对鸡胚的正常发育似乎是必需的，但在穿刺气室后必须避免翻转。本模型无需移除蛋清，也无需添加PBS以防止鸡蛋脱水。此外，使用70%乙醇溶液时应谨慎操作，需特别注意将蛋壳表面残留的乙醇彻底干燥，以维持胚胎活性。另一个关键点是用于移植的蛋壳开孔尺寸，需在保证移植物操作便利的前提下，尽可能缩小开孔大小。选择E7胚龄进行移植，是基于绒毛尿囊膜（CAM）的成熟程度及其相对大小，有利于移植物的整合。然而，若移植的类器官需要更长时间 在卵内 成熟后.......
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披露
作者未报告任何利益冲突。
致谢
感谢巴塞罗那大学的 Alcántara 博士和 Ortega 博士，以及 Acosta 博士实验室的其他成员所参与的富有见地的讨论。S.A. 是由加泰罗尼亚自治区资助、在巴塞罗那大学任职的塞拉-亨特学者计划助理教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 TUBB3 [Tuj1] 抗体，小鼠 | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| 抗 GFAP 抗体，兔 | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| AlexaFluor 488 标记山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| AlexaFluor 594 标记山羊抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| 受精白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋 | Granja Gibert（西班牙卡姆布里尔斯） | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | 基于二甲苯的封片介质 |
| 温和解离溶液 | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | 细胞解离溶液 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 封片剂 | Merk | 81381 | |
| 实验室级纸巾 | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK 抑制剂 Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| 尖头手术剪刀 | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus 黏附载玻片 | Epredia | J1800AMNZ |
参考文献
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
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