本文介绍了一种将处于不同成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的实验方案。人脑类器官采用非定向标准化方案进行培养。
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本文内容
摘要
摘要
将类器官移植到模式动物（如免疫缺陷小鼠或鸡胚绒毛尿囊膜（CAM））的血管化组织中，已被证明是模拟新生血管形成的高效方法。CAM 是一种富含血管的胚外膜，其免疫反应性较低，因此成为人源细胞移植的理想宿主模型。
本文描述了将处于多个成熟阶段的人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）中的策略。人脑类器官的细胞组成随时间发生变化，反映了人类大脑发育过程中的关键阶段。我们将处于不同成熟阶段的人脑类器官——神经上皮扩增阶段（18天体外培养，DIV）、早期神经发生阶段（60天体外培养，DIV）以及早期胶质发生阶段（180天体外培养，DIV）——移植至孵化第7天（E7）的鸡胚尿囊膜上。移植5天后获取类器官，并对其组织学特征进行分析。
在移植的类器官中或移植物邻近区域均未检测到新生血管形成的组织学迹象或异常血管。此外，观察到移植类器官的细胞组成发生显著变化，即胶质纤维酸性蛋白阳性反应性星形胶质细胞数量增加。然而，这些细胞结构的变化依赖于类器官的成熟阶段。综上所述，这些结果表明脑类器官可在鸡胚尿囊膜（CAM）上生长，并且其细胞结构特征会因移植时所处的成熟阶段不同而有所差异。
引言
人脑类器官是一种新兴技术，能够在体外重现人脑的早期发育过程in vitro1,2,3。然而，该模型的主要局限性之一是缺乏血管化，而血管系统不仅在脑内环境稳态中发挥不可或缺的作用，也在脑发育过程中具有关键功能4。除了输送氧气和营养物质外，越来越多的证据表明，脑血管系统在发育过程中调控神经分化、细胞迁移和突触形成5,6。因此，迫切需要建立可靠的模型，为脑类器官提供缺失的血管信号和结构支持，从而提升人脑类器官生成的复杂性7。
在已提出的血管化方法中，主要有两种研究方向：将类器官移植到活体生物体内，以及在体外通过共培养内皮细胞和神经细胞的纯in vitro技术8,9,10,11,12。在小鼠脑内进行移植成本高且耗时，因此其他技术在简化模型中具有重要意义。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型已被广泛用于血管生成的研究13,14,15。在过去十年中，多个研究团队已成功将多种类器官移植到CAM上，包括肾类器官16,17、心肌类器官18以及肿瘤类器官19,20。然而，关于将人脑类器官移植到CAM上的效率、毒性/排斥反应、生理效应以及具体移植方法，目前仍知之甚少。另一个尚未被探索但具有重要意义的方面是CAM与类器官星形胶质细胞界面之间是否能够形成嵌合的血脑屏障（BBB）。先前的开创性研究表明，通过移植星形胶质细胞或星形胶质细胞条件培养基，可能在CAM上构建出BBB21,22,23。然而，成熟星形胶质细胞似乎无法实现这一功能24,25。因此，星形胶质细胞诱导形成BBB的能力仍存在争议，而移植人脑类器官将有助于澄清这一问题。
本视频文章介绍了一种将人脑类器官移植到鸡胚尿囊膜（CAM）上的 in ovo 实验方案，该方法可促进类器官的生长、功能改善及血管化，最终形成的类器官包含组织学上符合血脑屏障（BBB）特征的结构成分。本文提供了一套确保鸡胚存活的实验流程，并报道了CAM支持脑类器官生长的容受性。
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方案
白来航鸡（Gallus gallus）胚胎的处理遵循美国国家研究委员会生命科学委员会实验动物资源研究所发布的《实验动物护理和使用指南》，实验已获得巴塞罗那大学实验动物护理和使用委员会的批准。
1. 非引导性脑类器官制备
- 将 H9 人胚胎干细胞（hESCs）在室温预热的 mTESR1 培养基中培养，细胞融合度控制在 70%，培养容器为 Matrigel（用 DMEM 按 1:40 稀释）包被的 6 孔板，置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中。
注意：Matrigel 必须始终保持在冰上直至用于包被，以防止其发生聚合。 - 按照非定向脑类器官方案2生成脑类器官。
- 使用 500 µL 细胞解离液对 H9 hESCs 进行解离，并在 37 °C 下孵育 3–5 分钟。用含有 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基重悬细胞，按每孔 9,000 个细胞接种至经低黏附预处理的 96 孔板中。
- 当类器官在含 ROCK 抑制剂 Y27632（终浓度 50 µM）的 mTESR1 培养基中聚集成球后，将其转移至诱导培养基中培养 5–6 天。
- 根据非定向脑类器官方案26，在约第 4–5 天将类器官转移至神经诱导培养基中。
- 当类器官达到一定大小并形成神经上皮环结构后，将其转移至冰上预冷的 Matrigel 液滴中。待 Matrigel 完全聚合后，将类器官转移至含 5 mL 预热成熟培养基的 5 cm 低黏附培养皿中。
- 4 天后，将脑类器官置于轨道振荡条件下培养。
- 在移植前立即用新鲜 DPBS 收集待移植的类器官。
2. 卵的维持、发育激活及卵壳穿刺
- 将受精卵（第0天）保存在18 °C的培养箱中，直至使用。
注意：在此温度下，胚胎不会发育，将保持在相同的成熟阶段。 - 使用时，将鸡蛋置于38 °C、相对湿度60%的环境中孵育，并以45 °C的角度进行轻柔的往复摇动。
- 第1天，用70%乙醇清洁蛋壳表面，并用纸巾擦干以达到消毒目的。
- 在蛋壳顶部贴上外科用纸质粘性绷带，后文简称"绷带"，覆盖蛋的气室区域。
注意：此举可防止蛋壳碎屑落入CAM（绒毛尿囊膜），避免其卡在膜中。 - 使用无菌针头（21 G × 11/2''）进行气室穿刺操作，后文简称气室孔（ACH），轻柔刺穿蛋壳。在蛋的顶端打开ACH，以避免干扰此时已与蛋壳分离的CAM。
- 为确定穿刺ACH的最佳位置，可使用光源照射，识别蛋顶端蛋壳最薄的区域。透光最明显的位置即为最佳钻孔点。
- 用新的绷带覆盖ACH，以保护胚胎免受外界环境影响，并将蛋放回培养箱中。
- 自此之后，停止培养箱内的旋转，将蛋保持垂直放置，开窗端朝上。
注意：这有助于胚胎发育，同时使CAM位于上方，并在胚胎与蛋壳之间形成气室，便于后续移植操作。 - 从第1天至第4天打开ACH。第4天（移植前3天）胚胎活性显著提高。
3. 脑类器官移植
- 在第7天进行移植，此时绒毛尿囊膜（CAM）已充分发育并血管化，覆盖整个胚胎的卵表面。
- 移除胶带，用70%乙醇擦拭蛋壳表面以对蛋壳进行消毒，然后小心地扩大人工开窗（ACH），形成移植窗口。
- 放置一个新的、更大的胶带覆盖在最终移植窗口之外的区域，以防止在扩大移植窗口时蛋壳碎片落入绒毛尿囊膜上。
注意：此更大的窗口有助于选择最佳移植位置，并便于后续移植操作。 - 通过轻柔穿刺蛋壳来扩大移植窗口，直至窗口直径达到约2 cm。使用镊子轻轻移除蛋壳边缘，使窗口扩大。随后轻柔揭下胶带，去除仍附着在胶带上的残留灰尘和蛋壳碎片。
- 使用P200自动移液器将类器官放置到位。用无菌锋利剪刀剪切移液器吸头尖端，使其开口根据类器官大小适当扩大，以避免损伤类器官；或使用大孔径的无菌移液吸头。将类器官收集于最大体积为50 µL的PBS中，并直接将其转移至绒毛尿囊膜上，位置应选择在胚胎所在位置的对侧。
- 确保移植位置远离卵黄，以避免在收获时破裂；最好将其置于血管附近。
- 将类器官放置于绒毛尿囊膜上后，在其周围滴加7 µL Matrigel。
注意：这将防止类器官在膜上移动。 - 使用一块大小与窗口完全匹配的Parafilm薄膜覆盖窗口，并用胶带将其固定在蛋壳上。
注意：必须用Parafilm完全覆盖窗口，以防止胚胎干燥，同时允许气体交换。应准确界定窗口覆盖范围，避免超出窗口边缘，否则可能阻碍胚胎正常发育所需的气体交换27。
4. 移植类器官的收获
- 在鸡胚胎发育第12天（即移植后5天）收获移植的类器官及其周围的绒毛尿囊膜（CAM），此时对应Hamburger和Hamilton发育阶段的第38期（HH38）28。在此阶段，CAM已完全分化并具有成熟的脉管系统，同时羽毛胚已覆盖胚胎的翅膀及上眼睑。
- 移除粘性绷带后，进一步扩大窗口，以便使用剪刀和精细镊子进行样本采集。
- 如有需要，可在双目解剖显微镜下观察类器官，并进行2分钟的预固定（使用4%多聚甲醛，PFA），以利于类器官和CAM的采集。
- 收集包含类器官的约1.5 cm2大小的CAM组织区域。
- 样本固定
- 用1×PBS洗涤样本，随后在4 °C条件下用4% PFA（溶于PBS，pH 7.2）固定30分钟。然后用PBS洗涤3次，每次5分钟。
- 将样本在含叠氮化钠的PBS中4 °C保存，或直接在30%蔗糖-PBS溶液中4 °C过夜进行冷冻保护。
- 完成冷冻保护后，将样本包埋于最佳切割温度化合物（OCT）中，-20 °C保存直至切片。使用冷冻切片机切割20 µm厚的组织切片，并将其收集到经多聚赖氨酸处理的载玻片上。切片载玻片于-20 °C保存，待染色时使用。
5. 免疫荧光
- 用含0.1% Triton X-100的PBS溶液（PBS-T）在室温（RT）下处理切片10分钟，以去除OCT。
- 用封闭液（BS）（含2% BSA、3%驴血清的PBS-T 0.01%溶液）在室温下处理切片1小时。
- 将所选的一抗抗体（见材料表）用封闭液稀释后，于4 °C孵育过夜。
- 次日，在室温下用1× PBS溶液清洗样本3次，每次10分钟。
- 将二抗抗体用封闭液稀释后，在室温下孵育2小时（见材料表）。
- 在室温下用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育样本10分钟，以标记细胞核；DAPI用PBS-T按1:1,000稀释。
- 用封片剂封片，并加盖盖玻片。
- 使用宽场荧光显微镜在2.5、10、20和40倍镜下采集所有图像。
- 将切片储存于4 °C。
6. 苏木精-伊红（H&E）染色
注意：为了证实嫁接成功，需进行苏木精-伊红（H&E）染色。
- 在室温下用 PBS-T 0.1% 去除 OCT，持续 10 分钟。
- 在通风橱中进行逐级脱水，步骤如下：蒸馏水（DW）中 10 分钟，苏木精中 45 秒，DW 中 1 分钟，PBS 中 20 秒，70% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，80% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，96% EtOH 中 2 次，每次 30 秒，伊红中 30 秒，96% EtOH 中 2 次，每次 15 秒，100% EtOH 中 2 次，每次 15 秒，二甲苯-100% EtOH 中 1 分钟，二甲苯中 1 分钟，新鲜二甲苯中 1 分钟。
- 使用基于二甲苯的封片介质封固玻璃盖玻片。
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结果
选择用于移植的胚胎成熟时间表
实验从第0天（D0）开始，将受精卵置于38 °C、相对湿度60%的条件下孵育。绒毛尿囊膜（CAM）是一种高度血管化的胚外膜，于卵孵化后发育形成，由尿囊和绒毛膜融合而成。在第1天（D1），即孵育24小时后，穿刺气室以防止绒毛尿囊膜与壳内膜粘连。相较于后期（D4）穿刺，D1穿刺可获得更高质量的气室。绒毛尿囊膜持续生长，至第12天（D12）时包裹整个卵内容物，并牢固附着于壳内膜（图1）。在第7天（D7）将原先的孔扩大，以便于后续样本收获。D7是移植物接种的最佳时间点，此时绒毛尿囊膜已发育成熟，覆盖卵黄囊及胚胎表面。在此阶段，扩大气室孔，借助自动移液器将类器官接种至绒毛尿囊膜上。
脑类器官移植
在脑类器官固有的成熟过程中 体外其细胞组成从神经前体细胞转变为成熟的神经元和胶质细胞。在脊椎动物中，神经血管系统与神经发生是相互交织且相互依赖的发育过程，介导这种交互作用的信号通路在很大程度上依赖于神经组分的成...
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讨论
本研究中，我们描述了一种详细的实验方案，包含多个关键步骤，可在不干扰鸡胚存活的前提下，促进人脑类器官移植后的良好生长与发育。我们建议在孵化24小时后（第1天）使用无菌针头刺穿鸡蛋的气室。此外，我们也曾尝试在第4天进行穿刺（通过透光观察蛋壳，检测血管系统的发育情况，以确保仅对健康的胚胎进行操作）。然而，由于尿囊膜血管已接近蛋壳，该操作导致胚胎存活率下降。需要注意的是，施加过大的力量可能导致蛋壳破裂，进而损伤尿囊膜血管系统。使用光源检测蛋壳变薄的区域有助于制作钝性孔洞，同时防止过度穿刺穿透蛋壳，避免侵入尿囊膜。
尽管在孵化过程中鸡蛋的定期翻转对鸡胚的正常发育似乎是必需的，但在穿刺气室后必须避免翻转。本模型无需移除蛋清，也无需添加PBS以防止鸡蛋脱水。此外，使用70%乙醇溶液时应谨慎操作，需特别注意将蛋壳表面残留的乙醇彻底干燥，以维持胚胎活性。另一个关键点是用于移植的蛋壳开孔尺寸，需在保证移植物操作便利的前提下，尽可能缩小开孔大小。选择E7胚龄进行移植，是基于绒毛尿囊膜（CAM）的成熟程度及其相对大小，有利于移植物的整合。然而，若移植的类器官需要更长时间 在卵内 成熟后...
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披露
作者未报告任何利益冲突。
致谢
感谢巴塞罗那大学的 Alcántara 博士和 Ortega 博士，以及 Acosta 博士实验室的其他成员所参与的富有见地的讨论。S.A. 是由加泰罗尼亚自治区资助、在巴塞罗那大学任职的塞拉-亨特学者计划助理教授。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 TUBB3 [Tuj1] 抗体，小鼠 | BioLegend | 801201 | 1:1,000 |
| 抗 GFAP 抗体，兔 | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| AlexaFluor 488 标记山羊抗兔 IgG | Invitrogen | A-21206 | 1:1,000 |
| AlexaFluor 594 标记山羊抗小鼠 IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| 受精白来航鸡（Gallus gallus）鸡蛋 | Granja Gibert（西班牙卡姆布里尔斯） | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10,000 |
| DPX | Sigma | 100579 | 基于二甲苯的封片介质 |
| 温和解离溶液 | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | 细胞解离溶液 |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 封片剂 | Merk | 81381 | |
| 实验室级纸巾 | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| ROCK 抑制剂 Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| 尖头手术剪刀 | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus 黏附载玻片 | Epredia | J1800AMNZ |
参考文献
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