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肿瘤微环境中空间免疫细胞格局的多重免疫组织化学分析

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DOI：

10.3791/65717

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2023年8月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical BioSciences, Radboudumc, 2Division of Immunotherapy, Oncode Institute, Radboudumc, 3Data Science, Institute for Computing and Information Sciences, Radboud University, 4Department of Medical Oncology, Radboudumc, 5Department of Pulmonary Diseases, Radboudumc, 6Department of Pathology, Radboudumc

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了如何利用多重免疫组织化学对肿瘤微环境中的免疫细胞进行表征。

摘要

肿瘤微环境中免疫细胞的分布特征可能包含发现预后和预测性生物标志物的重要信息。多重免疫组织化学是一种有价值的工具，可在保留空间信息的同时，对肿瘤组织中不同类型的免疫细胞进行可视化和鉴定。本文提供了详细的实验方案，用于分析组织切片中的淋巴细胞、髓系细胞和树突状细胞群体。方案涵盖从切割福尔马林固定石蜡包埋组织切片、在自动化平台上进行自动多重染色、使用多光谱成像显微镜扫描切片，到利用本课题组自主开发的机器学习算法ImmuNet进行图像分析的完整流程。通过更换肿瘤标志物，这些方案可适用于多种肿瘤样本，用于分析样本不同区域（肿瘤实质与侵袭边缘）的免疫细胞，并可进一步开展最近邻细胞分析。该分析方法不仅限于肿瘤样本，也可应用于其他（非）病理性组织。近年来设备和工作流程的改进显著缩短了整体处理时间，为该技术在未来临床诊断中的应用提供了便利。

引言

免疫细胞在抵御病毒和细菌等病原体以及癌细胞方面发挥着关键作用1。因此，肿瘤微环境（TME）中的免疫系统在发现预后和预测性生物标志物方面具有巨大潜力2。免疫细胞浸润已被证实与多种癌症类型的预后相关，但目前尚未应用于临床实践3,4。在大多数肿瘤类型中，高水平的细胞毒性T细胞和T辅助1细胞和/或低水平的调节性T细胞与较好的预后相关。目前正在进行努力，将所谓的"免疫评分"纳入结直肠癌的TNM分期系统，从而形成TNM-I分期5,6。免疫评分基于两个不同肿瘤区域中T细胞总数（通过CD3检测）和细胞毒性T细胞数量（通过CD8检测）：即肿瘤核心区域与肿瘤侵袭边缘（IM）。免疫评分也被提议在其他癌症类型中具有预后价值，例如黑色素瘤、肺癌和乳腺癌6,7,8,9。此外，免疫细胞浸润也可能与检查点阻断免疫治疗的疗效相关10。然而，这些预测性生物标志物必须在前瞻性研究中得到验证后，才能常规应用于临床实践。而且，已有研究提出单一生物标志物可能不足以实现有意义的预测11。因此，有人建议通过整合多种生物标志物，对患者样本进行全面描绘，构建所谓的"癌症免疫图谱"，作为更全面的预测性生物标志物12。

在研究肿瘤微环境（TME）中免疫细胞的方法中，历史最悠久且最为人熟知的技术是免疫组织化学（IHC），该技术常规用于多种疾病的诊断检测，尤其是癌症13。长期以来，该技术仅限于使用一种或少数几种标志物14，因此在科研领域逐渐被流式细胞术和基因表达谱分析（GEP）等其他技术所取代。然而，常规诊断和研究中常用的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织并不（理想）适用于流式细胞术和GEP。此外，尽管GEP和流式细胞术能够深入揭示细胞表型与功能，但缺乏空间定位信息是一个主要缺点。因此，样本内部的异质性，例如肿瘤组织中免疫细胞浸润区与非浸润区之间的差异，可能无法被检测到15。近年来已开发出多种可用于FFPE组织多重分析的新平台，例如多重IHC、成像质谱流式细胞术以及通过索引进行共检测（CO-Detection by indEXing, CODEX），这些技术能够在组织切片中同时检测多种标志物16。目前，科研人员正广泛研究TME中的免疫细胞，以寻找最适合免疫治疗的生物标志物。然而，多重检测技术与自动化图像分析本身也面临诸多挑战。

本实验室在使用Opal/酪胺信号放大（TSA）方法进行多重免疫组化（IHC）染色方面具有丰富经验，并已在 IHC平台（参见材料表）上实现自动化17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。我们已优化了用于检测淋巴细胞、髓系细胞和树突状细胞（DCs）不同亚群的免疫细胞抗体组合。含有密集免疫细胞区域的组织——尤其是淋巴细胞或具有复杂细胞形态（如髓系细胞和DCs）的组织——在分析上尤为困难，容易导致对免疫细胞数量的高估或低估。为解决这一问题，我们团队开发了ImmuNet分析软件32，该机器学习分析流程极大地提升了对这些不同类型免疫细胞的识别质量。本文详细描述了从获取FFPE组织样本到分析不同组织区室中免疫细胞密度以及免疫细胞类型间距离的完整实验方案。

本方案概述了自2022年数字病理成像仪投入使用以来，拉德堡德大学医学中心开展多重免疫组化（IHC）检测面板的具体操作流程。所述的多重IHC检测面板可用于多种癌瘤（如肺、前列腺、结直肠、膀胱、乳腺癌）的研究，使用广谱细胞角蛋白抗体作为肿瘤标志物；也可用于黑色素瘤研究，使用黑色素细胞相关抗体作为肿瘤标志物。这些多重IHC方案在初级抗体浓度、荧光染料组合以及染色步骤顺序方面均经过精心优化。我们及其他研究者此前已报道过多重IHC检测面板的优化方法17,33,34,35。多重IHC检测面板可进行调整，但所描述的分析流程需相应地进行评估，必要时进行调整或重新训练。所述的七色多重IHC方案使用Opal荧光染料Opal480、Opal520、Opal570、Opal620、Opal690、Opal780以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），从而可在成像仪上利用"Multispectral One Touch ImmunoFluorescence"（MOTiF）实现简便的光谱分离和快速扫描。本方案未描述九色染色与扫描，因其需要对实验设置进行更精细的优化，并在成像仪上采用基于液晶可调滤光片的另一种扫描模式。

方案

本方案所展示的患者材料来自一项先前开展的研究，根据荷兰法律规定，已由当地拉德堡德大学医学中心（Radboudumc）医学伦理委员会正式认定无需经过医学伦理审批（文件编号 2017-3164）30。

1. FFPE 样本的收集、蜡块筛选及样本制备

  1. 通过主治医师或病理学家从患者病历中获取福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块的标识信息。请核查当地法规是否需要伦理审批。
  2. 向本地病理档案库或外部医院申请获取FFPE组织块。
    注意：在某些特定研究中，也可能直接获取肿瘤组织或活检样本，例如小型临床试验或动物实验。在此类情况下，组织样本的处理可能由研究人员自行负责。
  3. 当存在多个FFPE组织块时，应通过评估苏木精-伊红（HE）染色切片（图1），选择最具有代表性且含有可评估肿瘤组织的FFPE组织块，优先选择伴有周围间质组织的样本。
    注意：建议由专业人员（如病理学家）协助完成该选择过程。有时可能无法获得用于评估FFPE组织块内容的HE染色切片，此时需重新制备切片用于评估。详见第2节说明。
  4. 使用切片机切割厚度为4 µm的FFPE切片。
    注意：切片厚度在1 µm至6 µm之间通常不会对染色效果产生明显影响；但4 µm为最常用标准厚度。
  5. 采用以下方法之一，将组织切片转移至载玻片上，并置于适合自动染色仪流体运行的位置（图2A-C）：
    1. 将切片置于水浴中40 °C的蒸馏水表面，使其展开，再用载玻片捞起。
      或
      将载玻片置于40 °C加热板上，确保在载玻片上拟放置组织切片的位置滴加一滴蒸馏水。用镊子将切片置于水滴上方，使其自然展开。用纸巾吸除多余蒸馏水，并轻敲载玻片以去除残留水分。
      注意：若组织切片过于靠近载玻片标签位置，将导致染色效果不理想（图2D、E）。我们通常每例样本制备6–10张载玻片，用于不同多重免疫组化（IHC）检测组合，并保留备用切片。
  6. 将贴附组织的载玻片在56 °C下干燥1小时，或在37 °C下过夜干燥。
  7. 将干燥后的载玻片用于实验，或存放于4 °C环境中保存。
    ​注意：根据我们的经验，这些贴附好的载玻片在进行多重IHC染色前可保存数年。

2. 制备苏木精和伊红染色切片

注意：第 2 节的所有后续步骤均须在通风橱中进行。

  1. 用二甲苯脱蜡（2次，每次5分钟）。
  2. 梯度乙醇复水（99.6% 1次，5分钟；95% 1次，5分钟；70% 1次，2分钟）。或者，将切片浸入99.6%乙醇中3次。
  3. 用蒸馏水洗涤切片（2分钟）。
  4. 用苏木精染细胞核（10分钟）。
  5. 用蒸馏H2O洗涤切片（5分钟）。
  6. 用伊红染色切片（5分钟）。
  7. 将切片浸入99.6%乙醇中3次，进行脱水。
  8. 将切片浸入二甲苯中2次。
  9. 滴加数滴封片剂，并用盖玻片封片。
  10. 待切片完全硬化，且所有试剂挥发后，将切片从通风橱中取出。

在自动染色机中进行单重和多重免疫组化操作

  1. 根据待染色样本的数量，计算所需试剂的用量。
    注意：自动染色机每轮可处理 30 张切片，完成包含六种抗体的多重免疫组化（IHC）方案约需 18 小时。若需染色更多切片，可在每个工作日晚上运行多批次；每晚 30 张切片，连续 4 晚共可处理 120 张切片/周。
    1. 在每周开始时准备好所有必要的试剂。自动染色系统每张切片分配 150 µL 试剂。抗体和 Opal 试剂使用 6 mL 滴定容器，封闭试剂和二抗-辣根过氧化物酶使用 30 mL 容器。
      注意：6 mL 容器配有方便的内插件，必要时可轻松取出和更换。计算试剂用量时，需考虑 30 mL 容器的死体积为 1.6 mL，6 mL 滴定容器的死体积为 300 µL。
    2. 将所有 Opal 荧光染料和地高辛（DIG）用提供的稀释液按 1:100 稀释；Opal780 使用抗体稀释液按 1:25 稀释。所有一抗均使用抗体稀释液稀释，具体稀释比例见补充文件 1。
  2. 在开始正式的多重免疫组化实验前，应先在含有扁桃体对照组织及其他感兴趣（肿瘤）组织类型的切片上运行单重免疫组化（补充文件 2），以确认所有试剂均已正确配制。
    注意：单重免疫组化耗时约 3.5 小时，可在当天结束前检查信号模式和强度。若某些信号过弱（图 3），可对试剂进行调整。
  3. 为进行自发荧光校正，准备一张含有自发荧光结构（如血液和胶原）的（肿瘤）组织切片。该切片应与单重免疫组化切片同时制备，但以封闭试剂替代一抗和 Opal 试剂（补充文件 3）。
    注意：原则上，此类切片可重复用于多光谱成像，直至自发荧光校正效果不再理想。然而，对于脑和肝等高度自发荧光的组织，建议使用相应组织进行自发荧光校正。
  4. 每次运行多重免疫组化时，在自动染色系统中加载 29 个样本，并加入一张对照组织切片，用于检测每次多重免疫组化运行的性能。
  5. 从自动染色机网站的下载标签页下载多重免疫组化方案，并根据每个自定义的多重免疫组化抗体组合进行调整36。有关多重免疫组化方案，请参见补充文件 4；有关自定义多重免疫组化抗体组合，请参见补充文件 1。
  6. 染色程序完成后，将切片从自动染色机中取出，并放入含有洗涤缓冲液的容器中。
  7. 为防止 DAPI 污染自动染色系统（因样本已在极低浓度下染色），应在加盖盖玻片前手动添加 DAPI。每毫升洗涤缓冲液中加入两滴 DAPI，在避光条件下室温孵育 5 分钟。
    注意：为构建光谱库，样本中应避免出现任何 DAPI 染色。也可每毫升洗涤缓冲液加一滴 DAPI，室温避光孵育 10 分钟。
  8. 用洗涤缓冲液清洗切片 3 次。
  9. 将切片置于纸巾上，轻拍去除多余的洗涤缓冲液。
  10. 在组织上滴加数滴封片介质。
  11. 将玻璃盖玻片轻轻倾斜盖在封片介质上，以避免产生气泡。
  12. 用镊子或洁净的移液器吸头轻轻按压玻璃盖玻片，以去除多余的封片介质和气泡。
  13. 将切片静置约 24 小时，待封片介质固化。可水平放置于显微镜载片板上，或直接装入显微镜进行成像。
  14. 封片介质固化后或切片成像完成后，将切片存放在显微镜盒中，置于 4 °C 保存。

使用数字病理成像仪进行成像及扫描文件的标注

  1. 按下机器右侧的电源按钮以开启成像仪。至少等待 20 秒后，启动软件。
    注意：等待 20 秒，以确保硬件正确启动。
  2. 将切片按每四个一组装入盒式架中。
    1. 可选：将切片信息输入一个 .csv 文件，该文件模板可下载（补充文件 5）。要将 .csv 文件加载到程序中，请将其保存至 C:\Users\Public\Akoya\VectraPolaris\States。
      注意：最多可同时加载 20 个盒式架或 80 张切片。
  3. 参考设置
    1. 从主菜单中打开 检查仪表板。
      注意：制造商提供了一个带有参考切片的盒式架，可选择性地永久放置在第 20 号插槽中。
    2. 根据制造商的说明，每周一次在提供的切片上设置明场参考（耗时几分钟）。
    3. 根据制造商的说明，每月一次在提供的切片上设置荧光参考（耗时超过 1 小时）。
  4. 创建或调整实验方案
    1. 返回主菜单，点击 编辑实验方案 以创建实验方案。
    2. 点击 新建…，在 成像模式 中选择 荧光，选择 多光谱切片扫描，并在 染色 选项下选择 Opal Polaris 5、6 和 7 色。
    3. 在 实验方案名称 下为实验方案命名，并通过从 可用研究项目 中选择一个研究项目，或将新项目创建于 创建新研究 | 研究项目名称 下，将其保存至某一研究项目中。
    4. 最后选择 创建实验方案 完成操作。
    5. 对于此类扫描，仅使用左侧窗口 多光谱切片扫描设置；忽略右侧窗口 多光谱视野设置。
    6. 以不同放大倍数扫描切片。为遵循本实验方案，请将 像素分辨率 保持在 0.50 µm (20x)，以实现 20 倍放大扫描。
    7. 通过选择 扫描曝光时间 来设置曝光时间。
    8. 通过在 加载载体 选项下选择正确的插槽，加载存放切片的盒式架。
    9. 为便于在切片中导航，选择 获取概览图像，在加载载体后获取包含切片的载体概览图像。要自动开启或关闭此功能，请点击右上角的 齿轮图标，进入 首选项…，并在 导航概览图像 下勾选或取消 开启 或 关闭，以启用 加载载体时自动成像用于交互式任务。
    10. 通过选择 设置扫描曝光时间，并在相应的单plex IHC 染色切片上选择不同具有阳性信号的区域，为每个滤光片设置曝光时间。手动对焦或使用 自动对焦，切换至对应信号的兼容滤光片后选择 自动曝光。选择最短的曝光时间以防止过曝，并在所有曝光时间设置完成后，为每张切片拍摄快照作为参考（图 3）。
      注意：对于此类扫描，请忽略 设置视野曝光时间 选项。
    11. 在一张多plex染色切片上，通过在几个具有阳性信号的位置检查所有滤光片来设置曝光时间。将最低的自动曝光时间减少 10%，以防止过曝，并在所有曝光时间设置完成后拍摄几张快照。
    12. 使用 样本自发荧光滤光片（Sample AF filter）导航，对未染色切片拍摄快照，用于自发荧光补偿（图 3H）。
      注意：红细胞和胶原结构区域值得关注。对于强自发荧光区域，可能需要降低 Opal480 滤光片的曝光时间。如果 Opal480 信号足够强，由于专有的 Sample AF 滤光片的使用，仍可将其与自发荧光结构良好分离（见第 6 节）。
    13. 使用软件评估染色和成像质量（见第 5 和第 6 节；图 4、补充文件 6：补充图 S1 和补充图 S2）。
    14. 选择 保存… 按钮，确保实验方案及其调整后的曝光时间已保存至该实验方案中。
      注意：若实验方案已保存，目前软件不会对未保存的调整提供额外提示。
  5. 切片的自动扫描
    1. 返回主菜单，点击 扫描切片 以开始扫描切片。
    2. 在 配置任务 下手动输入切片名称/编号及对应任务和实验方案，或通过先前创建的 .csv 文件使用 加载设置 自动导入。
    3. 点击 扫描 以开始扫描。
    4. 等待弹出窗口提示保存扫描设置。点击 保存 使用默认设置并开始扫描。
      注意：使用此方法扫描每张切片约需 10–20 分钟。根据切片数量，扫描可能最长持续一整天。
    5. 通过查看是否有错误消息，检查所有切片的扫描是否成功。要确认扫描成功，请查找已保存的 Akoya 全切片扫描文件（.qptiff）以及扫描中完整的组织图像。

5. 使用幻灯片查看器对数据进行注释

  1. 返回主菜单，点击 启动 Phenochart 以打开切片查看器。
  2. 如果扫描文件未直接显示，请先点击右上角的 齿轮图标，进入 更改浏览器位置…，然后随机选择目标数据集中的一个 .qptiff 文件。
    注意：数据默认存储在 D:\Data\VectraPolaris。
  3. 通过选中切片并点击右上角的 加载 按钮，或双击该切片来加载切片。
  4. 点击右上角的 登录 按钮进行登录。
    注意：用户名可以仅为姓名首字母或全名，用于记录由谁进行了哪些标注。
  5. 要执行光谱解混，请点击顶部的 解混 按钮，并选择 Opal + AF 选项。
    注意：此操作有助于消除 Opal 480 通道附近的部分自发荧光信号，但无法完全去除。
  6. 为批量处理数据生成算法时，使用 图章 功能，并选择 用于 inForm 项目 的 1 x 1 图像选项（图像尺寸：928 µm x 696 µm）。
    注意：在整个数据集中选择若干包含肿瘤、间质、背景及不同类型免疫细胞的代表性图章，最终获得约 20–30 张图像。
  7. 根据组织中需要分析的内容，使用 感兴趣区域（ROI） 选项选择感兴趣区域，并选择 inForm 批量处理。手动删除无需分析的图像，例如距离肿瘤过远或位于背景区域的图像。
    注意：我们通常在整块肿瘤周围绘制一个 ROI，并在肿瘤区域外额外选择一张图像，以便能够分析约 0.5 mm 的免疫微环境（IM）。
    如果所绘制的 ROI 相对较小，则其将由 2–9 张合并的 20 倍图像组成。由于我们不推荐此方式，建议手动对感兴趣组织区域（选择用于 inForm 批量处理）进行图章标注以避免该问题。
  8. 完成标注后，系统将自动保存标注结果，并加载下一张切片。
  9. 在标注过程中，检查切片是否已正确扫描。
    1. 如果缺少 .qptiff 文件或切片未成功扫描，请检查载玻片上是否存在组织，用 70% 乙醇清洁载玻片后重新扫描。
    2. 如果组织未被完整扫描，导致可能遗漏重要（肿瘤）区域，或重要区域的扫描失焦，请用 70% 乙醇清洁载玻片后重新扫描。
      注意：在这两种情况下，也可尝试用记号笔在盖玻片表面围绕组织画圈，以帮助系统定位组织并重新扫描（补充文件 6：补充图 S3）。据我们经验，细的红色记号笔效果优于粗的黑色记号笔。
  10. 完成所有样本的扫描和标注后，将数据备份至另一台计算机或外部硬盘中。

6. 光谱解混

  1. 打开 inForm 自动化图像分析软件。
  2. 通过 文件 | 打开图像 将图像加载到软件中；选择 .qptiff 文件。让在步骤 5.6 中标记为 inForm 项目 的图章加载到当前项目中。
  3. 加载用于自发荧光补偿成像的 .qptiff 文件。
  4. 为补偿自发荧光，使用图像上的 选择自发荧光 工具，在未染色切片的图像上穿过具有自发荧光的结构（如红细胞和胶原蛋白）绘制一条线。
  5. 在 编辑标记物和颜色… 部分，为对应的 Opal 荧光染料分配标记物名称，并将颜色调整为所需颜色。
  6. 为解混荧光信号，请在左下角选择 全部准备。
  7. 逐一浏览图像，检查所有信号是否可见，解混效果是否良好。选择 眼睛图标 逐个开启或关闭所有标记物，以检查图像质量。
  8. 可选步骤：训练组织分割、细胞分割和表型识别的算法。
  9. 转到 导出 选项卡，点击 导出目录 下方的 浏览… 按钮，创建一个新的空导出目录。
  10. 在 要导出的图像： 下，选择 复合图像 和 组分图像（多图像 TIFF）。
  11. 选择 文件 | 保存 | 项目，将算法保存到指定位置。
  12. 在左侧垂直菜单中进入 批量分析 选项卡，对切片进行批量处理。
  13. 在 导出选项 下，选择为每个项目 创建独立目录。
  14. 为添加待分析切片，请在 添加切片… 按钮下选择 .qptiff 文件，并将其加载至批量分析中。
  15. 点击 运行 以启动切片的批量处理。

7. 绘制感兴趣区域（ROI）

  1. 创建一个仅包含第6节组件文件的文件夹，但保持原有的层级文件夹结构不变（组件文件应位于以样本/切片命名的子文件夹中）。
  2. 打开 QuPath 全切片图像查看软件。
  3. 点击左侧的创建项目，选择或新建一个具有合适名称的空文件夹。
  4. 点击自动化，然后选择显示脚本编辑器。
  5. 复制粘贴补充文件7中提供的脚本。在第34行，将路径更改为存放所有组件文件的切片文件夹所在位置（即步骤7.1中创建的文件夹）。
  6. 选择运行，待切片批量拼接完成后（可能在第二天或稍后）再返回继续操作。
  7. 将生成的.ome.tif文件拖入QuPath项目中，并将其保存为项目。
  8. 当新窗口自动弹出时，选择设置图像类型 | 荧光，然后点击导入。
  9. 在左侧菜单中查看样本列表，双击其中一个样本以打开该样本（图5A）。
  10. 为调整各通道的强度以使其更清晰可见，请点击对比度图标。
  11. 选中所有通道，然后点击重置。
  12. 关闭自发荧光通道。
  13. 要开始绘制肿瘤区域的感兴趣区域（ROI），请点击对比度图标并选择显示灰度图像。选择肿瘤标志物通道，并调整其强度以达到最佳可视效果（图5B）。
  14. 点击画笔工具，粗略绘制肿瘤的感兴趣区域（ROI）。
  15. 在选中魔棒工具的情况下，按住alt键并在ROI外部点击，以从外部平滑ROI边界（图5C）。
  16. 将分离的肿瘤区域合并至同一ROI中。
  17. 通过在左侧列表中右键单击注释，选择设置属性并输入名称，为该ROI命名，例如肿瘤。
  18. 为创建侵袭边缘（IM）的ROI，需扩展肿瘤区域的现有ROI：选择对象 | 注释… | 扩展注释。
  19. 设置扩展半径大小，并勾选移除内部区域和限制在父级范围内（图5D）。
  20. 点击对比度图标，选择自发荧光通道，并调整其强度以达到最佳可视效果。
  21. 点击魔棒工具，在按住alt键的同时调整ROI，从外部平滑边界，并去除不应属于该ROI的背景区域。
  22. 通过在左侧列表中右键单击注释，选择设置属性，输入名称（如侵袭边缘或IM），并可选地将其颜色更改为绿色，以命名该ROI。
  23. 保存注释信息：选择文件 | 导出对象 | 导出所有对象，在默认选项导出为FeatureCollection下点击确定，并将文件保存至指定位置。

8. 免疫细胞检测

  1. 由于 ImmuNet 在训练和推理过程中均使用组件数据（多通道 TIFF 文件），需将注释划分为训练集和验证集。训练模型时，请参照代码仓库中 Readme 文件所述步骤，将示例数据集和注释替换为所需数据。除不同类型的免疫细胞外，还需通过生成阴性样本来为模型提供负例 背景 在不应被识别为目标细胞的位点进行标注：肿瘤细胞、其他细胞或 "无细胞" （可能与目标细胞混淆的结构）；详见 ImmuNet 出版物32.
  2. 使用验证标注确保模型性能令人满意。查看每种标注类型的错误率——即模型未能检测到的验证标注所占比例——这是最直接的评估指标。通过绘制若干个完整标注的感兴趣区域（ROI），计算F分数，以评估模型在假阳性方面的表现。
  3. 除了定量评估外，还需目视检查预测结果，以定性了解模型容易产生的误差类型。图6, 补充文件6：补充图S4， 和 补充图 S5）。如果判断模型性能不足，可按照代码库中的说明对部分切片的预测结果进行可视化，检查哪些位点最容易出错。在这些位点增加更多标注后，重新运行模型训练与评估。
  4. 当达到目标性能后，按照所述方法对整个数据集运行推理。 整个数据集的推断 代码库 Readme 文件的部分内容。将获取的包含模型预测结果的 .csv 文件作为数据分析的输入（为此编写 Python 或 R 脚本）。

9. 预测表型分析与数据处理

注意：在本节中，我们以一个经淋巴细胞检测面板染色的黑色素瘤样本为例，展示简单的数据分析流程。该分析结合了由 ImmuNet（第 8 节）识别的免疫细胞位置信息以及通过 QuPath（第 7 节）划定的感兴趣区域（ROI）。分析在 R 4.1.1 中完成（脚本作为补充文件 8提供）。该脚本需要以下 R 包：plyr 1.8.8、dplyr 1.0.8、tidyr 1.2.0、sf 1.0-7、ggplot2 3.4.0、RANN 2.6.1 和 RColorBrewer 1.1-2，这些包可通过install.packages()命令安装。输入文件包括一个包含 ImmuNet 对样本预测结果的 .csv 文件，以及一个从 QuPath 导出的 ROI 文件。步骤 9.1–9.6 描述了所提供脚本中对单个样本的分析过程，而第 9.7–9.9 节则介绍了对多个样本进行分析的可选方法。

  1. 将 ImmuNet 的预测结果载入 R 后，通过绘制定义表型的标记物之间的相互关系图，选择能够最佳区分各细胞群的阈值，以确定预测标记物表达的阈值。
    注：本样品所用的设门策略如图7B所示。髓系细胞和树突状细胞 panel 的设门策略见补充文件6：补充图S6和补充图S7。
  2. 确定阈值后，使用这些阈值为每个 ImmuNet 预测结果分配 panel 中定义的表型。在某些预测中，可能会观察到两个预测标记物均未超过阈值，或经阈值处理后认为表达的标记物组合不一致（例如淋巴细胞 panel 中的 CD3+ CD20+ 预测）。若在步骤 8.3 中模型性能良好，则此类预测所占比例将很小；在分析前应将其过滤掉。
  3. 为分别分析在 QuPath 中绘制的肿瘤区域及其侵袭边缘（至多 100 µm 范围内）的感兴趣区域（ROI），需在 R 中载入相应的 GeoJSON 文件，并为每个预测结果确定其所属的 ROI。
  4. 作为合理性检验和探索性数据分析的一部分，将样本中发现的免疫细胞及其所在 ROI 的边界在对应的 ROI 中分别可视化（图7A）。
  5. 接下来，分别针对每个 ROI 计算不同免疫细胞的密度。本样本中获得的密度值如表1所示。
  6. 若存在多个样本，可对细胞密度的分布进行可视化。对密度值进行对数转换，以获得近似正态分布的数据。
    注：当某些表型的计数为 0 时，无法进行对数转换，从而导致缺失值。为解决此问题，可先对所有细胞计数统一加上 0.5 进行拉普拉斯平滑（LaPlacian smoothing），再除以表面积。
  7. 使用所选软件对密度值进行分析并绘图（图8）。
  8. 保留细胞的空间位置信息可实现空间分析。例如，针对每个检测到的免疫细胞，寻找其最近邻细胞，然后针对每种表型，计算不同表型作为其最近邻出现的百分比。
    注：由于本样本中检测到的自然杀伤（NK）细胞数量极少，因此未将其纳入本项分析。肿瘤区域和侵袭边缘（IM）ROI 的分析结果如图9所示。

结果

根据病理学报告和苏木精-伊红（HE）染色切片，选择含有肿瘤组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块。当从患者体内切除多个肿瘤病灶，或肿瘤样本体积较大时，这些组织会被分置于多个FFPE组织块中。我们倾向于在肿瘤实质区域以及所谓的肿瘤侵袭边缘（IM）内分析免疫细胞。IM是指紧邻肿瘤的非癌性间质组织。因此，当某一肿瘤样本存在多个可用的FFPE组织块时，优先选择同时包含这两种组织类型的组织块。如HE染色切片所示，其中一个FFPE组织块包含肿瘤组织及邻近的间质组织（图1A）；而来自同一肿瘤的另一FFPE组织块则含有较少的周围间质组织（图1B）。然而，对于某些组织样本，可能没有可供选择的FFPE组织块，或任何FFPE组织块中均不存在侵袭边缘。这种情况在（穿刺）活检样本中尤为常见，在数据分析和解释时应予以充分考虑。

组织学比较、染色组织样本、示意图、展示IM的存在、研究分析。
图1：黑色素瘤肿瘤标本的HE染色切片。（A）一个肿瘤样本示例，其右上角可见肿瘤旁的间质组织（IM）（黑色箭头指示）。（B）同一肿瘤病灶的另一样本，其中几乎无或无间质组织存在。比例尺 = 5 mm。缩写：HE = 苏木精和伊红；IM = 侵袭边缘。请点击此处查看该图的放大版本。

使用建议的七色抗体组合（补充文件4）进行多重免疫组化染色，既可在常规工作时间内通过人工操作在3天内完成，也可在自动染色机中过夜完成。使用自动染色机时，组织切片必须贴附在玻片的特定位置，以确保仪器系统的最佳液体流动性能（图2A）。当切片正确贴附于玻片上时（图2B），染色将均匀一致（图2C）。若切片未在玻片上最佳位置贴附（图2D），常会导致染色效果不理想（图2E），原因是自动染色机的液体流动无法充分覆盖（全部）组织区域。这种情况可能发生在样本过大，或由不了解该问题的人员提供已贴附切片的玻片时。在此类情况下，应仅选择染色良好的区域用于后续分析。对于此类样本的另一种处理方式是采用人工染色，以更优地分布液体。

显微镜载玻片染色过程示意图及照片，显示均匀与不均匀的组织学染色。
图 2：FFPE 切片在载玻片上的贴附位置及其影响。（A）在载玻片上贴附位置的示意图，以在自动染色机上实现最佳染色效果。（B）正确贴附的载玻片示例。（C）正确贴附的载玻片可产生染色均匀的组织切片。（D）贴附不佳的载玻片示例。（E）贴附不佳的载玻片可能导致组织切片染色不完全，如本图左侧所示。比例尺 = 5 mm。缩写：FFPE = 甲醛固定及石蜡包埋。请点击此处查看该图的放大版本。

当进行多轮染色的大规模多重免疫组化实验且需要配制大量溶液时，最好在开展多重免疫组化之前，先在单重免疫组化实验中测试这些试剂。单重免疫组化应使用数字病理成像仪检查预期的染色模式，并在对照切片上通过相应滤光片设定曝光时间（图3A-H）。大多数免疫细胞标志物均以扁桃体组织作为阳性对照。由于扁桃体对照组织中DAPI的曝光时间通常高于其他组织（图3G），因此DAPI的曝光时间应根据待研究的组织类型进行设置。此类扫描的常规曝光时间范围为1 ms至30 ms，具体取决于荧光染料和滤光片（图3I）。若单重免疫组化的曝光时间超出该范围或染色模式不够清晰，则应调整或更换抗体溶液。在本示例中，我们决定提高FOXP3的浓度（图3C 和 图3I），使其信号强度与其他标志物更匹配。在其他组织中，自发荧光可能比扁桃体对照组织更强。在我们的实验条件下，样本自发荧光（Sample AF）滤光片的曝光时间介于25 ms至50 ms之间（图3H、I）。

Opal480-780、DAPI、自发荧光的荧光成像滤光片及曝光时间设置；显微镜分析。
图3：单重免疫组化及未染色对照样本的曝光时间设置。（A）扁桃体对照组织中的CD20 - Opal 480信号。（B）扁桃体对照组织中的CD3 - Opal 520信号。（C）扁桃体对照组织中的FOXP3 - Opal 570信号。（D）扁桃体对照组织中的CD56 - Opal 620信号。（E）扁桃体对照组织中的CD8 - Opal 690信号。（F）肿瘤标志物 - Opal 780信号在扁桃体对照组织中的表达。（G）扁桃体对照组织中的DAPI信号通常弱于目标组织类型。（H）自发荧光——肿瘤对照组织样本的AF信号。（I）在调整曝光时间为10%并检查多重免疫组化染色切片前的曝光时间截图。比例尺 = 100 µm。缩写：AF = 自发荧光；IHC = 免疫组化；DAPI = 4'6-二脒基-2-苯基吲哚。请点击此处查看该图的放大版本。

进行多重IHC后，通过检查几张多重IHC切片并选择自动曝光，从单重IHC的设置中调整曝光时间。此类扫描没有饱和保护选项，因此避免将曝光设置得过高至关重要，以防止过度曝光。过度曝光会妨碍荧光染料的光谱分离。我们通常不会将曝光时间设置为超过基于单重IHC所确定的时间，仅对在多重IHC中信号更强的标记物降低曝光时间（图3G 和 图4A）。通过对几张切片上的不同位置进行自动曝光，可观察到某些滤光片的曝光时间仍然过高。这些滤光片的曝光时间应调整为使用自动曝光设置时所观察到的最低数值，并再减少该数值的10%，以防止在其他未观察到的位置发生过度曝光（图4A）。采用此方法，某些滤光片的曝光时间可能低于单重IHC中设定的值。然而，在成功的多重IHC实验中，所有标记物均应可见，至少在对照切片上如此（图4B-H、补充文件6：补充图S1和补充图S2）。需注意某些标记物可能并非存在于每个样本中。通过包含至少含有扁桃体组织切片的对照切片，可以验证标准检测面板中所有标记物的成功染色及信号强度。

多重免疫荧光、复合图像、CD标志物、Opal染料、光谱分析、滤光片设置
图4：黑色素瘤肿瘤标本中使用淋巴细胞抗体组合成功染色切片的示例。（A）用于采集该多重IHC样本的曝光时间。（B）肿瘤组织内多重IHC淋巴细胞抗体组合的复合图像。（C）CD20 - Opal 480信号（品红色）。（D）CD3 - Opal 520信号（红色）。（E）FOXP3 - Opal 570信号（绿色）。（F）CD56 - Opal 620信号（黄色）。（G）CD8 - Opal 690信号（青色）。（H）TM - Opal 780信号（白色）。比例尺 = 100 µm。缩写：TM = 肿瘤标志物；IHC = 免疫组织化学。请点击此处查看该图的放大版本。

使用数字成像仪对多重免疫组化切片进行全片扫描。在切片查看器中选择用于后续分析的图像区域。然而，当需要分析更特定的区域时，例如肿瘤区域与侵袭性边缘区域（IM），可使用QuPath软件手动绘制这些感兴趣区域（ROIs）。在完成切片查看器中所选区域的批量处理后，各组件文件将被重新合并（图5A 和 补充文件7）。利用QuPath中的肿瘤标志物通道（图5B）及魔棒工具，可勾勒出肿瘤轮廓，形成“肿瘤ROI”（图5C）。随后，可将肿瘤ROI向外扩展一定距离（本例中为500 µm），以生成“侵袭性边缘ROI”（图5D）。通过观察自发荧光信号，使用魔棒工具去除该ROI中不必要的背景（非组织区域）（图5E）。肿瘤ROI和侵袭性边缘ROI均保存为GeoJSON文件，用于后续分析（图5F）。

合并文件、标记通道、感兴趣区域的肿瘤分析示意图；显微镜数据解读。
图 5：在 QuPath 中绘制肿瘤感兴趣区域及侵袭边缘感兴趣区域的过程。（A）合并的组件文件。（B）仅显示肿瘤标记通道的灰度图像。（C）围绕肿瘤标记信号绘制肿瘤感兴趣区域。（D）通过将肿瘤感兴趣区域向外扩展 100–500 µm 生成新的感兴趣区域，以形成侵袭边缘感兴趣区域。（E）通过排除背景（无信号区域）以及其他较大的组织结构（如脂肪、血管和毛囊），对侵袭边缘感兴趣区域进行调整，使其仅包含间质组织。（F）最终的肿瘤感兴趣区域和侵袭边缘感兴趣区域被保存并导出为 GeoJSON 文件，用于后续区域分析。肿瘤感兴趣区域以红色轮廓显示，侵袭边缘感兴趣区域以绿色轮廓显示。比例尺 = 2 mm。缩写：ROI = 感兴趣区域；IM = 侵袭边缘；GeoJSON = 地理空间 JavaScript 对象表示法。请点击此处查看该图的放大版本。

ImmuNet 网络可用于检测免疫细胞。对于淋巴细胞 panel，可将实验合成图像（图 6A）与软件检测到的免疫细胞进行视觉比较（图 6B）。对于髓系细胞 panel（补充文件 6：补充图 S4）和树突状细胞 panel（补充文件 6：补充图 S5），也可进行类似的视觉比较。

使用 DAPI、CD20、CD3 标记的复合图像与 ImmuNet 细胞图像；免疫细胞网络分析。
图 6：ImmuNet 识别的淋巴细胞。（A）图 4B 的复合图像，显示被 ImmuNet 识别的细胞（以白点表示）。（B）ImmuNet 识别的细胞及其后续检测到的标志物表达。比例尺 = 50 µm。缩写：TM = 肿瘤标志物。请点击此处查看该图的放大版本。

通过 ImmuNet 检测并以 .csv 格式保存的免疫细胞可导入任意编程语言中进行进一步分析。我们在 R 中进行了空间可视化和设门分析（补充文件 8）。随后可对检测到的细胞进行空间可视化展示（图 7A、补充文件 6：补充图 S6 和 补充图 S7）。还可通过伪标记物表达进行设门，以对单个免疫细胞进行表型鉴定（图 7B）。

肿瘤细胞分布、流式细胞术散点图、免疫细胞分析示意图、肿瘤学研究
图7淋巴细胞分群策略. (A) 使用 QuPath 划定感兴趣区域，在肿瘤区域和侵袭边缘检测到免疫细胞。B) 基于ImmuNet检测到的所有细胞的设门分析 A淋巴细胞首先根据CD20设门+ B细胞和CD3+ T细胞，CD3+ T细胞进一步根据CD8和FOXP3的表达进行设门。CD20-CD3- 群体经CD56设门+ 自然杀伤细胞 请点击此处以查看此图的放大版本。

通过设门确定预测细胞的表型后，可计算不同表型细胞在各感兴趣区域（ROI）内的细胞密度。该密度通过将每种表型的细胞总数除以ROI的表面积来计算（表1、图8 和 补充文件8）。此处，B细胞定义为CD3-CD20+，辅助性T细胞定义为CD3+CD20-CD8-FoxP3-，调节性T细胞定义为CD3+CD20-CD8-FoxP3+，细胞毒性T细胞定义为CD3+CD20-CD8+FoxP3-，NK细胞定义为CD3-CD20-CD56+。

表型肿瘤内密度（细胞/mm2）IM 区密度（细胞/mm2）
B 细胞185.74145.62
辅助性 T 细胞301.46157.51
调节性 T 细胞38.5319.53
细胞毒性 T 细胞185.3583.21
NK 细胞0.180

表1：感兴趣区域中表型的密度。 使用淋巴细胞检测面板染色的一个黑色素瘤样本中，不同表型细胞在肿瘤和侵袭边缘区域的密度。密度分别在肿瘤和IM感兴趣区域中单独计算。缩写：IM = 侵袭边缘；ROI = 感兴趣区域。

细胞密度条形图；肿瘤与IM感兴趣区域；免疫细胞类型包括NK细胞、B细胞、T细胞；数据分析。
图8：多个样本数据分析示例。 对23例原发性黑色素瘤肿瘤中肿瘤区域和侵袭边缘（IM）内不同淋巴细胞表型的密度分析。缩写：IM = 侵袭边缘；ROI = 感兴趣区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

为了更深入地分析这些免疫细胞的空间信息，还可以测定样本中已鉴定表型之间的距离，或最近邻细胞表型的百分比（图9）。

细胞类型分布：B细胞、细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞；比较图表、百分比、堆叠柱状图。
图9：单个样本最近邻分析示例。 在一个黑色素瘤样本中，使用淋巴细胞抗体组合染色后，在（A）肿瘤区域和（B）侵袭边缘区域（IM）感兴趣区域（ROI）内不同细胞类型的最近邻表型百分比。缩写：IM = 侵袭边缘；ROI = 感兴趣区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：多重免疫组化实验的总结性方案说明。 请点击此处下载该文件。

补充文件2：单重染色自动染色仪操作步骤。 请点击此处下载该文件。

补充文件3：自发荧光补偿的自动染色仪操作方案。 请点击此处下载该文件。

补充文件4：多重免疫组织化学自动染色仪操作方案。 请点击此处下载该文件。

补充文件 5：模板 .csv 文件。 请点击此处下载该文件。

补充文件6：黑色素瘤组织样本中的髓系细胞和树突状细胞检测面板；扫描失败情况下的切片标记方法；ImmuNet识别的髓系细胞和树突状细胞；髓系细胞与树突状细胞面板的设门策略。 请点击此处下载该文件。

补充文件 7：QuPath 拼接脚本。 请点击此处下载该文件。

补充文件 8：数据分析脚本。 请点击此处下载该文件。

讨论

对肿瘤微环境（TME）进行空间分析是一种备受关注的技术，有助于深入了解免疫细胞组成，并发现新的预后和预测性生物标志物，尤其在肿瘤免疫学领域具有重要意义16。目前已有多种技术被开发用于实现这一目标，包括检测蛋白质、mRNA转录本或两者联合检测，可同时检测的目标数量估计可达100至1,000个。然而，更高重数的检测通常伴随着通量降低、实验成本升高以及技术挑战增加，且往往只能分析TME中很小的一部分。本文所描述的基于TSA方法的多重免疫组化（IHC）技术可同时检测六种不同的标志物加DAPI，相对成本较低，整个组织切片可在20分钟内完成成像，随即进入全面分析阶段。随着染色流程的自动化，该技术的操作复杂性已显著降低。多光谱显微镜的改进，包括新增两个滤光片，极大地提升了光谱分离效果和扫描速度。目前可实现最多同时检测八种不同标志物加DAPI。然而，当标志物数量进一步增加时，前述优势将逐渐消失，因为光谱分离变得更加困难，全片扫描时间也显著延长。目前正积极开展工作，以在不同机构之间实现多重IHC技术的标准化，从而更便于其在诊断环境中的推广应用。对于多重IHC的标准化，我们建议使用者采用更为可行的六种标志物加DAPI的实验方案。尽管如此，该技术仍需要相当程度的技术经验，且后续分析可能具有挑战性，为此我们已在本方案中详细描述了相应的分析方法。

标准化始于多重免疫组化（IHC）面板的开发。先前已有研究强调了选择针对特定蛋白靶点的一抗在其中的重要性17。我们的多重IHC面板主要采用那些已在本机构诊断部门用于IHC并经过验证的一抗克隆。然而，在树突状细胞多重IHC面板中，大多数抗体此前并未在诊断环境中使用（van der Hoorn 等，论文待发表）。为确保特异性并尽量减少批次间的差异，我们优先选用单克隆抗体而非多克隆抗体，并且大多数抗体均通过转染细胞系和原代细胞进行了验证。多年来，不同版本的多重IHC面板已在多项研究中使用Vectra 3系统进行应用18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32。为了在PhenoImager HT系统上最优地实施这些多重IHC面板，需对一抗与荧光染料的组合进行一些调整。为了更好地实现光谱分离并加快整张组织切片的扫描速度，在七色多重IHC面板中应采用最新的Opal480和Opal780荧光染料，并避免使用Opal540和Opal650荧光染料。扫描速度根据组织切片大小的不同，可提高约3至10倍。多重IHC面板的调整相对容易实现，但仍需注意若干事项。Opal480的荧光光谱与自发荧光光谱重叠较多，因此会干扰红细胞及其他自发荧光结构的光谱分离。在大多数情况下，通过提高与Opal480配对的一抗浓度可解决此问题。PhenoImager HT系统上专有的Sample AF滤光片有助于Opal480与自发荧光的分离。然而，最佳策略是选用与Opal480联用时能产生清晰信号的一抗，使其信号强度高于自发荧光。

尽管这些多重免疫组化检测面板已经建立，但仍需考虑批间差异的问题。在开展完整的多重免疫组化实验之前，通过进行单plex免疫组化对照实验，我们有时会发现一抗在不同实验之间的染色强度存在增强或减弱的情况。造成这一现象的原因可能包括移液误差、试剂储存条件不理想以及试剂保质期等因素。我们通过根据经验调整一抗溶液的浓度来解决这一问题。即使无需进行上述任何调整，在每次多重免疫组化批次实验中，仍需依据单plex免疫组化染色的对照切片来设定曝光时间。

由于我们的研究最初聚焦于不同类型的癌和黑色素瘤，因此需要多重免疫组化（IHC）检测面板在不同肿瘤类型之间可互换，且仅需极少调整。因此，在优化过程中我们始终纳入多种（肿瘤）组织类型，并观察到不同肿瘤类型之间免疫细胞标志物的一抗稀释比例可保持相近。然而，癌与黑色素瘤之间的肿瘤组织检测需要使用不同的肿瘤标志物。为此，肿瘤标志物总是在每个多重IHC检测面板的最后一步进行优化，目前始终与Opal780联用，而Opal780恰好也必须位于多重IHC染色流程的最后一个荧光染料位置。通过始终将肿瘤标志物置于多重IHC的最后一步，这些多重IHC检测面板可轻松适用于其他肿瘤类型，例如胶质母细胞瘤（即GFAP）和霍奇金淋巴瘤（即CD30）。对于血管肉瘤，我们使用该淋巴细胞多重IHC检测面板，并以红系白血病病毒相关基因（ERG）作为肿瘤标志物，仅进行了两次优化实验25。优化内容包括对ERG一抗进行滴定，以及测试将ERG置于末步的多重IHC检测面板效果。

通过将某种免疫细胞标志物替换为其他免疫或功能标志物，也可对这些多重免疫组化（IHC）检测面板进行其他调整。每次更改均需进行优化，优化方案可参照先前所述的方法17。对所提出的多重IHC面板进行某些修改可能会影响我们开发的ImmuNet算法。为将这些更改整合至算法中，必须生成足够的数据并投入相应时间（每种新标志物和/或细胞表型至少需要750个注释，验证先前训练过的标志物则需150个注释）。本文所展示的面板未包含功能标志物，尽管我实验室已常规将PD-1和PD-L1等免疫检查点标志物纳入多重IHC面板中。然而，对于在阴性和阳性信号之间区分度较低、非典型二元表达的标志物，其分析已被证实更具挑战性，目前仍是我课题组积极研究的方向。

与其它新兴技术相比，多重免疫组化（multiplex IHC）可同时检测的标志物数量有限。尽管可通过在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块的连续切片上分析不同的抗体组合来弥补这一限制，但在空间上对这些切片进行比较仍存在困难。由于切片制备后组织的方向性和折叠伪影可能不一致，因此难以实现精确的空间对应。然而，多重免疫组化技术具有较高的可及性，使其成为更多机构和研究人员易于采用的工具，因而更适用于未来在诊断环境中的推广应用。随着针对多种肿瘤类型的多重免疫组化免疫细胞抗体组合及其下游分析流程的逐步标准化，研究人员有望更深入地了解不同患者之间以及不同肿瘤类型之间肿瘤微环境（TME）的差异。例如，这可能有助于阐明TME在特定治疗方案抗肿瘤反应中的作用。甚至可能由此发现可用于预测治疗反应和预期生存等指标的新生物标志物。总体而言，这有望推动多重免疫组化发展成为个性化医疗中辅助临床决策的临床工具。诚然，为了使其适用于日常诊断工作，分析流程中的更多步骤可能需要实现自动化和标准化，因此目前该技术的应用前景仍主要处于未来展望阶段。

尽管存在技术挑战，但在单个样本切片上分析多个标志物仍是一种非常强大的工具。通过标准化的实验方案和稳健的分析方法（如本文使用ImmuNet所描述的），多标志物的定量分析比传统免疫组化（IHC）更具信息量，同时与新型更高重数的实验方法相比，多重免疫组化仍具有相对较高的通量。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

PhenoImager HT 的采购资金由拉德堡德大学医学中心和拉德堡德显微技术中心提供。CF 获得了荷兰癌症协会基金（10673）和欧洲研究委员会高级资助项目 ARTimmune（834618）的经费支持。JT 获得了荷兰科学研究组织（NWO）Vidi 基金（VI.Vidi.192.084）的经费支持。作者谨此感谢 Eric van Dinther 和 Ankur Ankan 在建立多重免疫组化数据存储工作流程方面的协助，同时感谢 Bengt Phung 提供在 QuPath 中实施多重免疫组化数据以进行感兴趣区域（ROI）绘制的操作指导。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 CD14Cell Marque 114R-16第3区，克隆EPR3653
抗CD163Cell Marque 163M-15第3节，克隆MRQ-26
抗CD19Abcamab134114第3部分，克隆 EPR5906
抗 CD1c（BDCA1）赛默飞世尔科技TA505411第3部分，克隆OTI2F4
抗CD20赛默飞世尔科技MS-340-S第3部分，克隆L26
抗CD3赛默飞世尔科技RM-9107第3节，克隆sp7
抗-CD303/BDCA2树突状细胞（Dendritics），通过 Enzo Lifesciences/Axxora 提供DDX0043第3区，克隆124B3.13
抗CD56Cell Marque 156R-94第3部分，克隆MRQ-42
抗CD66bBD 生物科学555723第3部分，克隆G10F5
抗 CD68Dako AgilentM087601第3部分，克隆PG-M1
抗CD8Dako AgilentM7103第3区，克隆C8/144B
抗 Foxp3赛默飞世尔科技14-4777第3区，克隆236A/E7
抗Gp100Dako AgilentM063401第3部分，克隆HMB45
抗 HLA-DR、DP、DQ圣克鲁斯sc-53302第3部分，克隆CR3/43
抗MART-1赛默飞世尔科技MS-799第3部分，克隆A103
抗广谱细胞角蛋白Abcamab86734第3部分，克隆AE1/AE3 + 5D3
抗SOX10Sigma Aldrich383R第3节，克隆EP268
抗酪氨酸酶SanbioMONX10591第3节，克隆T311
抗XCR1通过Biok实现的细胞信号传导技术é44665S第3节，克隆D2F8T
抗体稀释液Akoya BioSciencesSKU ARD1001EA第3部分，来自Opal 7色自动化IHC试剂盒50片装（可选择性地替换为含10% BSA的TBST）
键合抽吸探针Leica BiosciencesS21.0605第3节
键合吸液探针清洁Leica BiosciencesCS9100第3节
Bond 脱蜡液徕卡生物科学AR9222第3节
Bond 载玻片标签 + 打印防尘Leica BiosciencesS21.4564.A第3节
Bond 研究检测系统 2Leica BiosciencesDS9777第3节
Bond RX全自动染色机 Leica Biosciences-第3节，自动化平台
Bond TM 抗原修复液 1 - 1 LLeica BiosciencesAR9961第3节
Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 LLeica BiosciencesAR9640第3节
Bond TM 洗涤液 10x - 1 LLeica BiosciencesAR9590第3节
BOND Universal CovertileLeica BiosciencesS21.4611第3节
Bond(TM) 滴定试剂盒Leica BiosciencesOPT9049第3节
盖玻片 24 x 32 mm #1（0.13–0.16 mm）Fisher Scientific15717592第2节
盖玻片 24 x 50 mmVWR631-0146第2节
DAPI Fluoromount-GVWR0100-20第3部分，当需要快速检查单重染色切片（非正式分析）时，应单独进行DAPI染色以获得更佳结果
伊红第2节，自制
乙醇 99.5%VWR4099.9005第2节
Fluoromount-GVWR0100-01第3节 
苏木精-第2节，自制
ImmuNet-免疫细胞检测与表型分析流程
inForm 软件 2.4.10Akoya BioSciences-第4节 &和 6
OPAL 480 试剂盒Akoya BioSciencesFP1500001KT第3节
OPAL 520 试剂盒Akoya BioSciencesFP1487001KT第3节
OPAL 570 试剂盒Akoya BioSciencesFP1488001KT第3节
OPAL 620 试剂盒Akoya BioSciencesFP1495001KT第3节
OPAL 690 试剂盒Akoya BioSciencesFP1497001KT第3节
OPAL 780 试剂盒Akoya BioSciencesFP1501001KT第3节
Opal 7色自动化免疫组化试剂盒，50张载玻片Akoya BioSciencesNEL821001KT第3节
PhenoChart 1.1.0Akoya BioSciences-第5节
PhenoImagerHTAkoya BioSciencesCLS143455第4节，数字病理成像仪，配备载玻片观察器和成像软件（曾用名：Vectra Polaris）
Quick-D封片剂Klinipath7280第2节
QuPath 0.3.2全切片图像分析软件平台
R 4.1.1
载玻片盒VWR631-0737第1节
SuperFrost Plus赛默飞世尔科技通过 VWR631-9483第1节
Vectra Polaris 软件 1.0.13Akoya BioSciences-第4节
二甲苯VWR4055-9005第2节

参考文献

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