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利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

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DOI：

10.3791/65720

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2024年2月9日

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1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

本文内容

摘要

将犬类肠道类器官与“肠芯片”微流控系统相结合，为人类肠道疾病提供了具有相关性的转化研究模型。所介绍的方案支持三维形态发生和动态培养 体外 肠道建模，助力犬类和人类肠道疾病的治疗开发，推动同一健康（One Health）发展。

摘要

犬类肠道在解剖结构、微生物组成和生理特性方面与人类肠道具有相似性，且犬类会自然发生类似于人类的自发性肠道疾病。为克服三维（3D）类器官难以接触肠上皮顶膜表面的固有局限，研究人员已开发出二维（2D）单层培养体系，该体系利用类器官来源的细胞暴露可及的管腔表面。将这些类器官及其衍生的单层培养物整合至微流控“肠芯片”（Gut-on-a-Chip）系统中，进一步推动了该技术的发展，使其能够构建出更具生理相关性的动态模型 体外 肠道模型

本研究中，我们介绍了一种利用患有炎症性肠病（IBD）犬只的原代肠道组织样本生成犬类肠道上皮三维形态发生的实验方案。同时，我们还概述了利用三维肠道类器官衍生细胞建立并维持二维单层培养体系及肠道芯片（intestine-on-a-chip）系统的操作流程。本研究所提供的实验方案为构建专用于犬类的微流控肠道芯片（Gut-on-a-Chip）系统提供了基础框架。通过奠定这一创新性方法的基础，我们旨在拓展这些技术在生物医学与转化研究中的应用，契合“同一健康”（One Health Initiative）理念。利用该方法，我们能够建立更符合生理条件的动态体外（in vitro）模型，用于研究犬类及人类的肠道生理功能。这一进展在生物医学和药物研发领域具有重要意义，有助于为两种物种的肠道疾病开发更有效的治疗策略。

引言

肠道上皮形态发生的研究在很大程度上依赖于实验室动物模型，但这些模型成本高、耗时长，且不能准确反映人类发育过程1此外，传统的静态二维细胞培养模型无法模拟三维上皮结构的复杂空间组织。2因此，需要一种诱导方案 体外 利用与人类相关的动物模型肠道上皮细胞进行三维形态发生研究，以增进对肠道上皮结构的理解。

由于在驯化过程中与人类共享生活环境和饮食，伴侣犬的肠道解剖结构和微生物组构成与人类极为相似3。除了这一相似性之外，人类和犬类还共同患有多种慢性疾病，这些疾病被认为与肠道健康有关。犬类与人类一样，可自发地发生肥胖、认知功能障碍、糖尿病、炎症性肠病（IBD）以及结直肠腺癌等慢性疾病4,5,6,7,8,9,10。尽管在以往的“芯片肠道”研究中已开发并使用了人类和小鼠的肠上皮细胞2,11,12,13,14，但犬类肠道上皮至今尚未被应用。我们提出的新方法，利用犬类肠道类器官上皮在具有三维上皮形态发生的动态培养系统中进行培养，对犬类和人类医学均具有重要意义。

肠道类器官培养技术的最新进展已成功建立了犬肠道类器官培养体系15该培养系统通过在明确的形态发生素条件下培养肠道干细胞，从而获得源自成体干细胞、具有自我更新能力的三维模型16然而，由于肠道腔室的封闭特性，使用该3D模型进行转运实验或宿主-微生物组共培养存在困难。17为解决这一问题，研究人员开发了一种源自肠道类器官的二维单层培养模型，可暴露其管腔表面18,19然而，三维类器官和二维单层细胞均在静态条件下培养，这并不能准确反映 体内 肠道微环境的生物力学。结合患者来源的犬类类器官技术与 体外 三维形态发生为慢性多因素疾病的转化研究提供了机遇。该方法使研究人员能够开发出对人类和犬类均更有效的治疗方法，进一步推动转化研究，与“同一健康”倡议相一致。“同一健康”是一种协作式方法，认识到人类健康、动物健康与环境健康之间的相互关联，倡导跨学科合作以应对复杂的健康挑战，实现所有群体的最佳健康状态。通过理解人类、动物与生态系统之间的相互依赖关系，该倡议旨在降低新发传染病、环境退化及其他共通健康问题带来的风险20,21,22.

本方案概述了在基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）多孔膜的肠芯片微装置上培养源自患者类器官的犬肠道上皮细胞的全面方法。通过整合犬肠道类器官与肠芯片技术，建立三维上皮形态发生过程，使我们能够研究肠道如何发育并维持其细胞结构及干细胞微环境。该平台为研究微生物群落对肠道健康的影响提供了宝贵机会，并有助于理解这些群落如何产生参与肠道病理生理过程的微生物代谢物14,23。这些技术进展现可拓展至犬类肠道样本，使研究人员能够深入探索肠道微生物组与宿主生理之间的复杂关系。这为揭示肠道病理生理学的潜在机制提供了重要途径，并有助于理解微生物代谢物在犬类和人类健康以及多种疾病状态中的潜在作用。犬用肠芯片所采用的实验方案具有良好的可重复性，是适用于比较医学研究的理想实验模型，该方法可用于在犬和人类中共同研究宿主-微生物组相互作用、病原体感染以及基于益生菌的治疗效应。

方案

本研究经华盛顿州立大学机构动物护理和使用委员会批准并按照其规定进行（ASAF# 6993）。在本方案中，我们使用了一种成熟的、由PDMS制成的“肠芯片”微流控装置，该装置为实验室自制2（图1D）。有关“肠芯片”微装置制备的详细方法可参见先前的报道2,24。本方案展示了一种将肠道类器官与微流控系统独特整合的方法（图2）。

1. PDMS 材质的肠芯片表面活化

  1. 在50 mL锥形管中，将1 mL 50%的聚乙烯亚胺（PEI）溶液加入49 mL去离子水（DI水）中，配制1%的聚乙烯亚胺（PEI）溶液。轻轻倒置管体2至3次以充分混匀，随后使用0.2 µm针头滤器过滤溶液。
    注：4 °C保存。
  2. 在50 mL锥形管中，将100 µL 50%的戊二醛（GA）溶液加入49.9 mL去离子水中，配制0.1%的戊二醛（GA）溶液。轻轻倒置管体2至3次以充分混匀，随后使用0.2 µm针头滤器过滤溶液。
    注：4 °C保存，并避免直接光照。
  3. 将器官芯片（Gut-on-a-Chip）装置置于60 °C的干燥烘箱中，孵育至少30分钟，以去除任何残留的水分。
  4. 使用紫外/臭氧发生器对器官芯片（Gut-on-a-Chip）装置进行60分钟的紫外和臭氧处理。
    注：为确保PDMS表面在处理过程中得到最佳活化，应保持紫外灯与装置之间的距离约为3 cm或更小。避免在发生器内放置过多装置，以实现有效的表面活化。
  5. 使用长尾夹夹紧上层微通道的入口、旁路和出口管路，同时夹紧下层微通道的入口管路。
  6. 断开下层微通道的出口管路，确保下层微通道的旁路管路保持开放。
  7. 使用P100移液器，通过下层微通道的出口孔加入100 µL的1% PEI溶液。
    注：建议在装置仍处于紫外/臭氧处理后的温热状态时进行此操作。观察PEI溶液流经微通道，并从下层微通道的旁路管路中滴出。
  8. 重新连接下层微通道的出口管路。
  9. 使用长尾夹夹紧下层微通道的入口、旁路和出口管路，同时夹紧上层微通道的入口管路。
  10. 断开上层微通道的出口管路，确保上层微通道的旁路管路保持开放。
  11. 使用P100移液器，通过上层微通道的出口孔加入100 µL的1% PEI溶液。
    注：观察PEI溶液流经微通道，并从上层微通道的旁路管路中滴出。
  12. 重新连接上层微通道的出口管路。
  13. 当上下两层微通道均充满1% PEI溶液后，将装置在室温（RT）下孵育10分钟。
  14. 使用0.1% GA溶液重复步骤1.5–1.12。
  15. 当上下两层微通道均充满0.1% GA溶液后，将装置在室温（RT）下孵育20分钟。
  16. 使用去离子水重复步骤1.5–1.12，以去除任何过量的表面活化溶液。
  17. 将芯片置于60 °C的干燥烘箱中，过夜干燥。
    ​注：务必从所有管路中移除长尾夹，以避免管路受压。此干燥过程对于器官芯片内微通道的均匀表面活化至关重要12。

2. 肠芯片培养的细胞外基质（ECM）包被及培养基制备

  1. 用类器官基础培养基配制细胞外基质混合物，使 I 型胶原和 Matrigel 的终浓度分别为 60 µg/mL 分别为 2%（体积/体积）。
    注意：准备 50 µL 每肠道芯片的ECM混合物（即， 20 µL 每条上、下微通道各使用 ECM 混合物 10 µL 额外）。在使用当天配制，并将此溶液储存于 4 °C 或将其置于冰上，直至准备使用。
  2. 从干燥烘箱中取出经过紫外/臭氧、PEI 和 GA 处理的 Gut-on-a-Chip。
    注意：在相差显微镜下观察，检查是否存在残留水分。
  3. 在生物安全柜中让 Gut-on-a-Chip 冷却 10 分钟。
  4. 使用长尾夹夹紧上层微通道的入口、旁路和出口管路，同时夹紧下层微通道的入口管路。
  5. 断开下部微通道的出口管路。
  6. 使用 P100 微量移液器，引入 20 µL 通过下层微通道的出口孔流出ECM混合物。
    注意：观察ECM混合物流经微通道，确保无气泡滞留。若存在气泡，向下方微通道中加入额外的ECM混合物，直至气泡完全排出。
  7. 重新连接下部微通道的出口管路。
  8. 使用长尾夹夹紧下层微通道的入口、旁路和出口管路，同时夹紧上层微通道的入口管路。
  9. 断开上层微通道的出口管路。
  10. 使用 P100 微量移液器，引入 20 µL 通过上层微通道的出口孔流出ECM混合物。
  11. 重新连接上部微通道的出口管路。
  12. 将芯片置于湿润的CO₂培养箱中2 5% CO₂ 培养箱2 在 37 °C 孵育1小时，以在经PEI和GA处理的PDMS膜上形成ECM层（图3A).
    注意：孵育期间务必夹紧所有管路。
  13. 在ECM包被孵育期间，准备两支含有冷接种培养基的1 mL注射器，该培养基为不含A8301但含有 10 µM Y-27632 和 2.5 µM CHIR99021，如先前在源自人类类器官的类器官芯片中所报道2.
    注意：如先前报道所述，已从培养基中去除 A8301，以增强细胞在包被的细胞外基质上的贴附2第0天的肠芯片培养仅需上部微通道灌注。因此，为上部通道准备一整支注射器，下部通道则至少准备0.2 mL。
  14. ECM包被完成后，将芯片从培养箱中取出，并松开连接至下层微通道的旁路管路上的夹子。
  15. 将装有接种培养基的1 mL注射器连接至与肠道芯片下层微通道相连的钝端针头。小心注入接种培养基（约50 µL将旁路管路充满引入的培养基后，用长尾夹固定连接至下层微通道的旁路管路。
  16. 松开连接至下层微通道的出口管路的夹子。小心地将接种培养基引入下层微通道，使其平稳流经系统。灌注完成后，用长尾夹固定连接至下层微通道的出口管路。
  17. 接下来，打开连接至上层微通道的旁路管。
  18. 将装有接种培养基的1 mL注射器连接至与肠道芯片上层微通道相连的钝端针头。小心注入接种培养基（约50 µL将旁路管路充满引入的培养基后，用长尾夹夹紧与上层微通道相连的旁路管路。
  19. 松开连接至下层微通道的出口管路。小心地将接种培养基引入上层微通道，使其平稳流经系统。灌注完成后，用文件夹夹固定连接至上层微通道的出口管路。

3. 用于接种的犬肠道类器官细胞制备

注意：为构建肠道芯片模型，本实验方案使用了来源于患炎症性肠病犬只的犬结肠类器官（称为结肠类器官）。这些结肠类器官取自3至5个活检结肠组织小片段，制备方法参照先前报道的方案。15,18为获得最佳结果，必须使用经过至少三次传代培养的犬类结肠类器官，以建立适合的稳定类器官 体外 应用。建议将犬类结肠类器官培养至少3-4天，以促进类器官内多谱系细胞的充分分化，确保其功能成熟，适用于后续的“芯片肠道”模型实验。本研究中传代次数上限少于20次，此前已有研究证实，在连续20次传代过程中，类器官的表型和核型均保持稳定。25这些供体的信号信息如下所示。 补充表 S1.

  1. 将犬类结肠类器官培养于24孔板中，置于基质胶内 30 µL Matrigel的15,18 使用下文所列的类器官培养基 材料表，该培养基经修改自先前报道的培养基15,26,27通过培养分泌Noggin的Rspo1细胞和HEK293细胞获得条件培养基28.
  2. 通过真空抽吸弃去类器官培养基，并加入 500 µL 将预冷的细胞回收溶液加入各孔中，每孔保持冰上操作。在30分钟内孵育 4 °C.
    注意：通常情况下，从24孔板中取三个孔的成熟犬类肠类器官，即可获得足量的解离细胞，用于在x10放大倍数下，于单个肠芯片装置中接种40–50个类器官/视野。
  3. 使用 P1000 微量移液器机械吹打 Matrigel 凝胶 dome 约 5 秒。随后，将类器官悬液收集至 15 mL 圆锥形离心管中。
  4. 将锥形管在200 × g条件下离心 × g 和 4 °C 5 分钟后，去除上清液。
  5. 加入1 mL室温的胰蛋白酶样蛋白酶，补充有 10 µM Y-27632，并使用P1000移液器吹打重悬细胞沉淀。
  6. 将细胞悬液置于设定温度的水浴中 37 °C 孵育10分钟，期间定期振荡混合物。
  7. 加入5 mL温热的类器官基础培养基，使用P1000移液器剧烈吹打细胞悬液，直至悬液变浑浊且无可见细胞团块。
  8. 将细胞悬液通过带有细胞筛的滤器 70 µm 截断以去除任何 Matrigel 残留物和大细胞团块。
  9. 将锥形管在200 × g下离心 × g 和 4 °C 5 分钟，随后将沉淀重悬于接种培养基中。接种一个犬源性 Gut-on-a-Chip 装置时，使用 20 µL 加入铺板培养基以重悬细胞沉淀（即，使用） 20 µL 接种一种肠芯片装置时的接种培养基用量）
  10. 调整活细胞浓度至1 × 107 细胞/mL，使用先前报道的接种培养基2使用血细胞计数板进行活力评估，通过结合 10 µL 细胞悬液的 10 µL 加入台盼蓝，然后在显微镜下观察细胞。
    ​注意：必须适当调整细胞浓度，以确保细胞在芯片膜上有效贴附并形成均匀的单层。若初始细胞数量不足，可能导致融合单层的形成延迟或无法成功建立。相反，若细胞数量过多，非贴壁细胞可能在通道内聚集成团，从而引起不良的浓度效应。

4. 二维细胞单层的接种与形成

  1. 断开上层微通道的出口管路。确保上层微通道的旁路管路保持开放状态。使用长尾夹夹紧下层微通道的入口和出口，将其固定。
  2. 使用 P100 或 P20 移液器，将来自方案 3 的 20 µL 细胞悬液加入上层微通道的出口孔中（图 3B 接种）。
  3. 使用长尾夹夹紧上层微通道的旁路和入口管路。然后，将出口管路重新连接至上层微通道的出口孔，确保在整个过程中管路保持开放，以避免对上层微通道施加任何压力。完成此步骤后，缓慢使用长尾夹夹紧上层通道的出口管路。
  4. 使用显微镜确认细胞在上层微通道内均匀分布。
    注意：必须夹紧管路以停止通道内培养基的流动，从而维持稳定的静态环境，直至细胞完成理想的贴壁。
  5. 将芯片置于 37 °C 的加湿 CO2 培养箱中。
    注意：犬小肠类器官细胞通常需要约 3 小时才能贴附于 ECM 涂层上（图 3B 贴附）。
  6. 将连接至肠芯片上层微通道的注射器接入置于 CO2 培养箱内的注射泵。
    注意：通过注射泵的旋钮小心地将培养基推入微通道，以去除未结合的细胞。在显微镜下观察芯片，确保所有未贴壁的细胞已被有效冲洗掉。
  7. 使用接种培养基以 30 µL/h 的流速启动培养基流动。初始阶段该连续流动仅作用于上层微通道，直至肠芯片上形成 2D 单层细胞。对于下层微通道，保持管路夹闭，不进行培养基冲洗。
  8. 从细胞接种后的第二天起，将培养基更换为类器官培养基，该培养基含有 A8301，但不含 10 µM Y-27632 和 2.5 µM CHIR99021，与接种培养基不同。
  9. 一旦单层细胞形成，也开始对下层微通道实施连续培养基流动。犬小肠类器官上皮细胞通常需要 2 至 3 天时间形成上皮单层（图 3C）。

5. 建立犬源肠芯片中的三维形态发生

注意：在肠芯片中形成融合的单层细胞后，如图2所示，通过引入上通道和下通道的培养基流动以及细胞应变，启动从二维单层向三维形态发生的转变。

  1. 将类器官培养基引入 Gut-on-a-Chip 系统的上、下微通道，以启动三维形态发生的培养。为实现 0.02 dyne/cm 的剪切应力2 在现有的肠道芯片设计中（即 500 µm 高度微通道），提高流速至 50 µL/h29.
  2. 接种10%的细胞株并设置频率为0.15 Hz，如前所推荐2，使用计算机调控的生物反应器对培养的细胞施加周期性应变 体外该过程将对 Gut-on-a-Chip 装置施加真空负压抽吸。
  3. 维持这些培养条件至少 2 至 3 天。犬肠单层细胞的 3D 形态发生通常在 Dural 芯片通道开始灌流和真空负压吸引后 2 至 3 天内出现。图3C).

犬源肠道芯片的表征

  1. 活细胞成像
    1. 使用注射泵轻柔地灌注培养基，以去除器官芯片中的任何气泡。
    2. 将 Gut-on-a-Chip 装置从注射泵上断开。
      注意：避免任何可能对 Gut-on-a-Chip 内部施加压力的操作。
    3. 将装置置于显微镜上，以获取已建立的三维上皮结构的图像。使用相差显微镜观察三维上皮层结构时，采用10倍和20倍物镜图3C).
  2. 免疫荧光染色
    1. 通过将1 g BSA溶解于50 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中配制封闭液，制成2% BSA溶液。将该溶液经注射器滤器过滤 0.2 µm 用于过滤。将此溶液储存于 4 °C.
    2. 通过混合制备透化溶液 150 µL 将Triton X-100与50 mL封闭液混合，使Triton X-100的终浓度为0.3%。将溶液通过注射器滤器过滤 0.2 µm 用于过滤。将此溶液储存于 4 °C.
    3. 通过注射进行细胞固定 100 µL 按照步骤2.4-2.11所述，将4% PFA分别注入上、下微通道中。
    4. 用注射方式冲洗细胞 100 µL 将PBS注入上下两个微通道，具体步骤如2.4-2.11所述。
    5. 通过注射进行细胞透化处理 100 µL 将0.3% Triton按照步骤2.4-2.11所述加入上下微通道中。将装置置于室温下30分钟。
    6. 用注射方式冲洗细胞 100 µL 将PBS注入上下两个微通道，具体步骤如2.4-2.11所述。
    7. 通过注射进行细胞封闭以防止非特异性结合 100 µL 向上下微通道中均加入2% BSA，操作同2.4–2.11步骤所述。将装置置于室温下1小时。
    8. 注射 20 µL 用2% BSA稀释的一抗溶液，室温放置3小时，随后4℃孵育过夜 4 °C.
      注意：孵育期间务必夹紧所有管路 4 °C 过夜。一抗的浓度应为单层细胞或三维类器官染色推荐浓度的2-5倍。补充图 S1).
    9. 用注射方式冲洗细胞 100 µL 向上下微通道加入 PBS，具体步骤如 2.4–2.11 所述。
    10. 注射 20 µL 用2% BSA稀释的二抗溶液孵育，室温放置1小时。
      注意：孵育期间务必夹紧所有管路。从这一步开始，需用铝箔包裹装置以避免光漂白。
    11. 用注射方式洗涤细胞 100 µL 向上下微通道中加入 PBS，具体步骤如 2.4–2.11 所述。
    12. 配制用于F-actin和DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）共染的混合溶液。注入 20 µL 按照步骤2.4-2.11所述，将混合溶液分别加入上、下微通道中。
    13. 用注射方式冲洗细胞 100 µL 将PBS分别注入上下微通道，具体步骤如2.4-2.11所述。
      使用荧光显微镜或共聚焦显微镜对三维上皮细胞的结构进行荧光成像。

7. 上皮屏障功能

  1. 使用注射泵轻轻灌注培养基，以去除肠道芯片中的任何气泡。测量期间确保所有管路均处于开放状态。
  2. 将肠道芯片从注射泵上取下，并置于室温下至少10分钟。
  3. 将Ag/AgCl电极从70%乙醇溶液中取出。
  4. 将两个Ag/AgCl电极分别插入上部入口和下部出口，使用万用表测量上皮层的电阻。
  5. 将两个Ag/AgCl电极分别插入下部入口和上部出口。将这两个数值的平均值报告为肠道芯片的电阻值。
    注意：空白TEER应在仅涂有细胞外基质（ECM）而无上皮细胞的肠道芯片上进行测量。
  6. 可使用公式（1）计算跨上皮电阻（TEER）值（kΩ × cm2）。
    TEER = (Ωt - Ωblank) × A      (1)
    ​其中，Ωt为自实验开始后某一特定时间点测得的电阻值，Ωblank为无上皮细胞时测得的电阻值，A为细胞层覆盖的表面积（本肠道芯片设计中约为0.11 cm229）。
    1. 使用公式（2）计算归一化的TEER值。
      TEER = figure-protocol-1      (2)
      其中，Ω0为实验初始读数时间点的电阻值，如先前报道30（图4C）所示。

结果

本方案可稳定促进肠道芯片系统中三维肠道形态发生的自发形成。该方法利用来源于患有炎症性肠病（IBD）犬只的肠道类器官所获得的犬肠道上皮细胞（图1B）。在培养基持续流动6–9天后，可在微通道内观察到犬肠道上皮细胞出现偶发性的三维形态发生聚集体（图3C）。这些形态学变化可通过相差显微技术进行监测。在本研究中，我们使用了来自两只确诊为IBD犬只的类器官。值得注意的是，在两个生物学重复实验中均成功观察到了三维形态发生，每个生物学重复均包含两个技术重复。本研究的结果为今后使用其他犬只供体来源的肠道类器官开展研究奠定了基础。这些结果表明，本实验方法具有潜在的适用性和可重复性，此前该方法已在人源样本中报道过。本研究进一步证实了肠道芯片技术适用于犬肠道上皮细胞，这与先前使用人肠道上皮细胞的研究结果一致2。

该方案表明，可利用免疫荧光染色结合常规荧光显微镜，对类器官来源的单层细胞在微流控芯片中形成的绒毛样三维结构进行评估图4 A，B）。该方案可进行调整，通过免疫荧光染色来验证分化且空间有序的细胞表型。在肠芯片（Gut-on-a-Chip）中观察三维形态发生过程，为研究多种病理相互作用过程中的宿主反应提供了极佳的机会14,23,31当与来自患者供体的上皮细胞（如先前在人类中所述）结合时，该技术可用于构建个体化的肠道疾病模型13通过将免疫荧光成像与靶向RNA可视化技术（如荧光原位杂交）相结合 原位 杂交后，可在肠道芯片系统中对宿主的转录组和蛋白质组进行可视化分析。

维持肠道膜的完整性对于保持肠道稳态至关重要，而肠道芯片（Gut-on-a-Chip）平台通过实现对此关键功能的精确监测与定量，提供了显著优势。利用肠道芯片技术测量跨上皮电阻（TEER）具有多项优点。例如，已有研究成功在肠上皮细胞与非致病性及益生菌共培养的条件下评估了TEER32，并在肠漏症（leaky-gut）条件下进行了测量23。这使得研究人员能够研究不同条件对肠道屏障功能的影响，并识别出促进肠道健康的潜在干预措施。

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图1：犬炎症性肠病患者来源的肠芯片模型的建立。（A）患者来源的肠道类器官与肠芯片平台的整合。可通过内窥镜活检分离肠道隐窝细胞，以构建供体特异性的肠道类器官。将类器官中的上皮细胞解离为单细胞后，接种至基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的肠芯片中，并在独特的动态微环境中进行培养。（B）来自一只炎症性肠病犬的结肠类器官的代表性图像。比例尺 = 100 µm。（C）该示意图展示了一种肠芯片装置，其中多孔膜位于上下两个微通道之间。上微通道由蓝色区域表示，下微通道由红色区域表示。微通道两侧设有真空腔，可使多孔膜发生形变，从而模拟肠道蠕动运动24。（D）犬肠芯片装置的设置包括一个基于PDMS的肠芯片，其连接管路并置于盖玻片上2,24。旁路管路对于在操作过程中（例如连接注射器时）避免微通道内压力积聚至关重要。使用文件夹夹子固定管路。可通过上或下出口的开放孔口灌注对体积敏感的材料。通过将注射器连接至钝端针头，并使液体流经上下入口，可灌注类器官培养基。缩写：IBD = 炎症性肠病；PDMS = 聚二甲基硅氧烷。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：犬炎症性肠病类肠芯片中绒毛样结构的形成。 将解离的上皮细胞接种至细胞外基质包被的类肠芯片中。当解离的细胞贴附于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜后，开始施加顶端流动，持续3天（D0-D3）。当形成融合的二维单层细胞时（D3），启动伴有频繁拉伸的基底外侧流动（拉伸，顶端和基底外侧流动）。经过2-3天的双向流动及膜拉伸后，二维单层细胞开始发生三维形态发生，培养9天后形成绒毛样结构（三维形态发生，D9-D12）。缩写：ECM = extracellular matrix；PDMS = polydimethylsiloxane；AP = apical；BL = basolateral。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：犬类肠道类器官在“芯片肠道”中的接种及三维形态发生。（A）基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的“芯片肠道”中多孔膜表面活化的实验步骤。联合使用紫外/臭氧处理、PEI和GA处理，可促进细胞外基质（ECM）溶液中所含胺基的交联，从而实现ECM蛋白在多孔膜上的稳定固定。（B）相差显微图像显示了接种后立即（左）以及接种后3–5小时（右）的细胞形态。接种3小时后的多孔膜显示出较细且颜色较深的区域，表明单个细胞已附着，突出了细胞附着过程。（C）相差显微图像展示了“芯片肠道”系统中肠道单层细胞的三维形态发生。这些单层细胞来源于患有炎症性肠病（IBD）的犬只，类器官细胞在动态条件下（包括液体流动和拉伸运动）培养了12天。比例尺 = 50 µm（B,C）。缩写：IBD = 炎症性肠病；ECM = 细胞外基质；PDMS = 聚二甲基硅氧烷；PEI = 聚乙烯亚胺；GA = 戊二醛。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图 4：患者来源的犬类 Gut-on-a-Chip 中三维形态发育的评估。（A）犬类炎症性肠病（IBD）Gut-on-a-Chip 的免疫荧光成像，展示培养 12 天后完全发育的三维上皮层的俯视图，通过荧光显微镜进行评估。紧密连接蛋白（ZO-1）显示为黄色；刷状缘膜（F-actin）呈红色；细胞核经 DAPI 染色后呈蓝色。（B）使用配备长距离物镜的共聚焦显微镜对犬类 IBD Gut-on-a-Chip 进行免疫荧光成像。如示意图所示，展示了培养 12 天后完全发育的三维上皮层绒毛样结构横截面的荧光图像。此外，Z 轴层扫显示了三维上皮层的侧视图，揭示了绒毛样结构的形成。刷状缘膜（F-actin）呈红色，细胞核经 DAPI 染色后呈蓝色。（C）通过跨上皮电阻（TEER）评估并测量患者来源的犬类 Gut-on-a-Chip 的肠道屏障功能。在 Gut-on-a-Chip 上培养第 5 天时达到稳定的 TEER 值。误差线表示测量值的标准误（SEM）。TEER 值在两个生物学重复样本中各进行一次技术重复测量。比例尺 = 50 µm（A），25 µm（B）。缩写：IBD = 炎症性肠病；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；TEER = 跨上皮电阻。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图 S1：抗 ZO-1 多克隆抗体在犬类结肠类器官衍生的单层细胞及 Gut-on-a-Chip 装置上的表征。（A）ZO-1 的免疫荧光染色呈黄色，F-肌动蛋白呈红色，以及两者的叠加图像。比例尺 = 25 µm。（B）在不同条件下对“肠漏芯片”（Leaky Gut Chips）中的 ZO-1 进行黄色免疫荧光观察，包括益生菌刺激（LGG + 细胞因子 或 VSL#3 + 细胞因子）以及无益生菌刺激的无菌对照组（细胞因子）。比例尺 = 50 µm。本图引自 Min 等人23。请点击此处下载该文件。

补充表 S1：组织供体信息汇总。 供体年龄、性别、品种、组织病理学评估及犬炎症性肠病活动指数（CIBDAI）评分的汇总表。CIBDAI 是一种数值评分系统，用于推断犬炎症性肠病的临床严重程度33。请点击此处下载该文件。

讨论

本研究首次证明了犬肠道类器官与犬炎症性肠病（IBD）肠道芯片（Gut-on-a-Chip）模型构建的兼容性。将肠道类器官及其衍生的单层培养细胞整合至微流控系统（即肠道芯片系统）中，进一步推动了该技术的发展，实现了 体外 紧密模拟生理动态且更能代表生物条件的肠道模型。特别是由于目前关于使用炎症性肠病（IBD）来源类器官构建人类肠道芯片（Gut-on-a-Chip）培养系统的报道极少，本研究采用犬源IBD衍生的肠道芯片模型，可能为人类IBD研究提供前沿性的见解。

在肠道芯片（Gut-on-a-Chip）上成功实现犬类肠上皮三维形态发生，需特别关注若干关键步骤。首先，聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控通道的疏水表面可能阻碍细胞外基质（ECM）的黏附以及后续的细胞贴附，因此在ECM包被和接种细胞前，必须对PDMS表面进行活化处理（参见方案第1节）。为获得稳定的单层细胞培养，细胞贴附后彻底清除未贴附的多余细胞至关重要（方案步骤4.6–4.7）。此外，持续的培养基流动和类似蠕动的真空牵拉等动态刺激，对于肠上皮的三维形态发生必不可少（方案步骤5.2）。在整个肠道芯片培养过程中的任何步骤，均需谨慎操作，避免微通道内产生气泡。

如果在肠道芯片（Gut-on-a-Chip）中出现细胞接种效果不佳的情况，可能是由于细胞数量过少或细胞贴附不良所致。针对细胞数量偏低的问题，应通过观察类器官在Matrigel中的生长状态来评估制备的肠类器官的健康状况。在细胞解离后，可通过台盼蓝染色法评估细胞活力，确保死亡细胞比例不超过20%。若活细胞数量仍不足，可尝试优化类器官培养基条件。另一种可能是类器官解离不完全，导致产生过多直径大于70 µm的细胞团块，这些团块会被滤膜截留。为解决此问题，可选择在细胞解离过程中延长吹打时间；或者在使用类胰蛋白酶处理期间，每隔一分钟轻轻振荡15 mL圆底离心管。细胞在肠道芯片上贴附不良可能与细胞外基质（ECM）包被不当有关。在包被过程中，应仔细检查是否存在气泡，并根据需要缓慢添加包被液以防止气泡形成。细胞密度过高以及未充分洗去未贴附细胞，可能导致初始单层细胞形成不充分。在此情况下，可在推动注射器活塞时施加轻微的脉冲力。这些故障排除步骤有助于识别并解决肠道芯片培养过程中的各类问题。

尽管这种肠道芯片平台能够构建出具有皱襞结构的三维上皮层，但我们认识到，要完全模拟肠道微环境，还需引入更多的生物学复杂性。必须考虑上皮细胞与间充质细胞之间的相互作用、细胞外基质（ECM）的沉积以支持三维再生，以及隐窝-绒毛结构特征的存在，这些特征共同构建了适宜的干细胞微环境。间质细胞（如成纤维细胞）在ECM蛋白的产生和肠道形态发生调控中发挥着关键作用34,35,36。在该模型中引入间充质细胞，有望增强形态发生过程以及细胞黏附效率。内皮层包含毛细血管网络和淋巴管，在调控分子转运和免疫细胞募集方面起着至关重要的作用37,38。引入患者来源的免疫细胞对于构建肠道疾病模型可能至关重要，因为它能够展现固有免疫与适应性免疫之间的相互作用，并建立组织特异性的免疫反应39。在肠道芯片上完成三维形态发生后，可将类器官培养基更换为类器官分化培养基。根据实验目标的不同，这是一种可行的策略，可用于诱导进一步的细胞分化。

成像三维微结构 原位 由于需要较长的工作距离，成像具有挑战性，但可通过使用长工作距离物镜克服。此外，逐层微加工和键合方法使得在扫描电子显微镜（SEM）下观察上层结构变得困难。对于当前的肠芯片设计，每个肠芯片微装置需要配备一个注射泵，占用CO₂培养箱空间2 培养箱空间受限，且难以开展大规模实验。需要创新技术以提升可扩展性，实现用户友好的平台和高通量筛选。

这些现有方案可实现三维上皮层的自发形成 体外，突破了传统三维类器官、二维单层细胞以及静态微装置培养系统的局限性。这种动态 体外 通过引入多种细胞类型的共培养，可调控肠道微环境。先前的研究已探索了调控肠道芯片微环境的方法，包括与肠道微生物组进行共培养。14,23 外周单个核细胞30该重建的微环境具有广泛的应用前景，包括药物测试、基本机制研究和疾病建模。重建的微环境在药物测试等多种应用中具有重要意义23,40,41 和疾病建模12,13,14,30以及肠道形态发生的基本机制研究42可通过收集上清液以检测代谢物来进行多种检测43通过收集细胞进行基因组学检测2,32，或通过活细胞染料染色后进行活细胞观察，或固定细胞后进行免疫荧光成像观察23,44.

本研究提供了一种在肠道芯片平台上构建犬类肠上皮层三维形态发生的可重复性实验方案。所形成的三维上皮结构更真实地模拟了肠道微环境，在多种生物医学研究中具有广阔的应用前景。通过利用该肠道结构，我们能够开展更具转化价值的研究，并有望取得令人期待的成果。

披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

我们感谢华盛顿州立大学小型动物内科医学服务团队（Jillian Haines 博士、Sarah Guess 博士、Shelley Ensign LVT）以及华盛顿州立大学兽医院临床研究协调员 Valorie Wiss 在病例招募和来自公民科学家（患者捐赠者）样本采集过程中提供的支持。本研究工作部分由美国国立卫生研究院院长办公室（项目编号：K01OD030515 和 R21OD031903，授予 Y.M.A.）以及日本促进科学会青年研究人员海外挑战计划（项目编号：202280196，授予 I.N.）资助。图 1A 和 图 3A 使用 BioRender.com 制作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>类器官基础培养基
高级DMEM/F12Gibco12634-010
GlutaMAXGibco35050-0612 mM 谷氨酰胺替代物
1 M HEPESVWR生命科学J848-500ML10 mM
100倍青霉素–链霉素康宁MT30009CI1x
<强>类器官与类器官培养基
A-83-01 PeproTech 9094360500 nM
B27 补充剂 Gibco17504-0441x
CHIR99021Reprocell04-0004-基础2.5 µM
分泌Noggin的HEK293细胞 贝勒医学院
小鼠 EGFPeproTech 315-09-1MG50 ng/mL
小鼠 Wnt-3aPeproTech 315-20-10UG100 ng/mL
N-乙酰-L-半胱氨酸SigmaA9165-25G1 mM
N2 MAX 培养基添加剂 Gibco17502-0481x 
烟酰胺SigmaN0636-100G10 mM
Noggin 条件培养基NANA10% 体积比 
PrimocinInvivoGenant-pm-1100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) 细胞Trevigen3710-001-01Rspo1 细胞
R-Spondin-1 条件培养基NANA20% vol/vol 
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG 10 µM
Y-27632StemCell Technologies7230810 µM
[Leu15]-胃泌素 I 人 Sigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
<强>试剂
4% 多聚甲醛溶液Fisher ScientificAAJ19943K2
Alexa Fluor 647 鬼笔环肽赛默飞世尔科技A22287x250 稀释
抗兔 IgG H&L 标记 Alexa Fluor 555Abcamab1500781,000倍稀释
抗ZO-1多克隆抗体赛默飞世尔科技61-730050倍稀释
细胞回收溶液康宁354253
I型胶原蛋白，大鼠尾部，3 mg/mLGibcoA10483-01
DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）赛默飞世尔科技622481,000倍稀释
EMS 戊二醛水溶液 50%电子显微镜科学公司16320
基质胶矩阵康宁356255
聚乙烯亚胺溶液Sigma408700-250ML
TrypLE ExpressGibco12604-021
<强>材料与设备
24孔培养板康宁3524
87V 工业用万用表福禄克公司
离心Eppendorf5910R
CO2培养箱EppendorfC170i
DMi8 荧光显微镜徕卡显微系统DMi8
干燥箱Fisher Scientific15-103-0519
FlexCell FX-5000 张力系统Flexcell International Corporation
倒置相差显微镜徕卡显微系统DMi1
SP8-X 倒置共聚焦显微镜徕卡显微系统SP8-X
注射泵Braintree Scientific型号 BS-8000 120V
注射器，3 mL，无菌BD 生物科学14-823-435
1 mL 无菌注射器BD 生物科学14-823-434
紫外/臭氧发生器Jelight 公司型号 30
<强>软件
LAS X 成像软件 徕卡显微系统

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类器官来源的单层细胞微流控芯片肠道屏障功能宿主-微生物组相互作用免疫荧光染色比较医学
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