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脂肪组织是间充质干细胞的极好来源。在这里，我们带来了从瑞士小鼠附睾脂肪组织中逐步提取、培养和表征脂肪组织衍生干细胞 （ADSC） 的过程。
间充质干细胞 （MSCs） 作为一种新的治疗方法已被广泛研究，主要用于阻止炎症加剧，因为它们具有调节免疫反应的潜力。间充质干细胞是一种免疫特权细胞，能够在免疫互容的同种异体移植受者中存活，这些受体基于 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子的低表达以及使用基于细胞的疗法进行同种异体移植。这些细胞可以从多种组织中分离出来，最常用的是骨髓和脂肪组织。我们提供了一种简单的方案来分离、培养和表征小鼠附睾脂肪组织中的 MSC。附睾脂肪组织通过手术切除，物理破碎，并用 0.15% II 型胶原酶溶液消化。然后，在 体外培养和扩增原代脂肪组织来源的干细胞（ADSC）细胞，并通过流式细胞术进行表型表征。我们还提供了将ADSC分化为成骨细胞、产脂细胞和软骨生成细胞的步骤，然后对每个细胞谱系进行功能表征。此处提供的方案可用于 体内 和 离体 实验，作为替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞。
间充质干细胞 （MSC） 是分化成成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞等细胞的成体多潜能细胞 1,2。这些细胞存在于多个器官中，因此，它们可以从骨髓、肌肉、脂肪、毛囊、牙根、胎盘、真皮、软骨膜、脐带、肺、肝脏和脾脏等成人组织中提取 3,4。
间充质干细胞对生理学和免疫系统的影响已有报道 5,6。这些细胞在人类和兽医学中都有望治疗多种疾病。间充质干细胞可以通过不同的机制控制炎症并促进血管生成和组织稳态，例如细胞间接触、可溶性因子和小细胞外囊泡 7,8,9,10。此外，间充质干细胞是免疫特权细胞，能够在免疫不相容的同种异体移植受体中存活，因为这些细胞显示出 I 类主要组织相容性复合体 （MHC） 分子的低表达，并且用于基于细胞的同种异体移植疗法11,12。低免疫原性与再生潜力相结合，使间充质干细胞成为细胞疗法的理想候选药物，例如移植物抗宿主病 （GvHD）13、系统性红斑狼疮 （SLE）14 和多发性硬化症15 等16,17。
尽管间充质干细胞存在于几种成体组织中，但脂肪组织比其他来源具有优势，例如易于收获，手术干预最少;可用电池数量多，扩增率高;使用易于执行的方案轻松进行体外扩增，无需特定设备和低成本材料 18,19,20。一旦提取，脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 必须按照国际细胞治疗学会 （ISCT） 21 的规定进行表征。因此，间充质干细胞必须表现出形态成纤维细胞样，对塑料培养物的粘附，表达高百分比 （≥95%） 的间充质标志物，如内分泌素 （CD105）、胞外-5'-核苷酸酶 （CD73） 和 Thy-1 （CD90），以及低百分比 （≤2%） 的造血标志物，如白细胞共同抗原 （CD45）、跨膜磷酸糖蛋白 （CD34）、糖脂锚定膜糖蛋白 （CD14）、整合素 α M （CD11b）、B 细胞抗原受体复合物相关蛋白 α 链 （CD79α） 或B 淋巴细胞表面抗原 B4 （CD19） 和 II 类人类白细胞抗原 （HLA-II）。此外，还需要进行功能表征，并且细胞应该能够分化为成骨细胞、软骨母细胞或脂肪母细胞21。
在这里，我们展示了如何使用机械解离和酶消化从附睾脂肪组织获得MSCs，用于 体外 研究以及ISCT预先确定的形态学表征。
所有动物实验均根据国际动物伦理准则进行，并由圣克鲁斯州立大学护理和使用机构委员会根据协议编号021/22批准。瑞士雄性小鼠（6-8周）购自动物育种，维护和实验实验室 - 圣克鲁斯州立大学（LaBIO-UESC）动物研究设施，维持在特定的无病原体条件下，自由接受水和食物，12小时光/暗循环。
注意:可以使用其他小鼠谱系;我们建议使用成年小鼠（6-8周），因为它们具有更发达的脂肪组织和具有高增殖活性的细胞。
1. 准备工作
注意:在继续之前，请准备以下所述的试剂。有关试剂和材料供应商信息，请参阅 材料表 。在所有实际程序中都必须佩戴个人防护设备，例如口罩、帽子、实验室外套和手套。
根据此处介绍的方案从脂肪组织中提取的细胞显示出符合ISCT提出的MSCs最低标准的形态。该协议的概述如图 1 所示。从表型上看，ADSCs在细胞培养的第一天表现出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附（图2A）。此外，它们均匀生长并形成殖民地。此外，ADSCs的造血标志物CD34（2.12%）和CD45（1.81%）表达低，CD71（42.6%）、CD29（74.2%）和CD90（55.1%）均为间充质细胞标志物（图2B）。
图 2:脂肪组织来源细胞的表型表征。 （A） 培养后第2、4、8天ADSCs形态由圆形变为成纤维细胞样;比例尺 = 22.22 μm。 （B） ASC 表达（CD71、CD29 和 CD90）或不表达（CD34 和 CD45）标记的直方图。该图经Miranda等人许可转载24。 请点击这里查看此图的较大版本.
在功能上，当在条件培养基中为每个谱系培养 14 或 21 天时，ADSC 显示出多能性，可分化为成骨细胞、脂肪母细胞和软骨细胞（图 3）。Von Kossa染色显示细胞外基质中存在矿化结节，这是成骨过程的特征（图3）。Oil-red O 染色证实 ADSC 细胞质中存在脂质空泡，Alcian Blue 染色证实细胞外基质中存在糖胺聚糖（图 3）。总之，表型和功能特征证实了从附睾脂肪组织中提取的细胞群为间充质干细胞。
图 3:脂肪组织来源细胞的功能表征。 培养 14 天和 21 天后 ADSC 的成骨、成脂和成软骨多系潜力。比例尺 = 50 μm（顶部面板），100 μm（中间和底部面板）。该图经Miranda等人许可转载24。 请点击这里查看此图的较大版本.
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脂肪组织是间充质干细胞的极好来源。在这里，我们带来了从瑞士小鼠附睾脂肪组织中逐步提取、培养和表征脂肪组织衍生干细胞 （ADSC） 的过程。
该研究得到了 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico （480807/2011-6） 和米纳斯吉拉斯州佩斯基萨保护基金 （APQ-01237-11） 的资助。这项研究部分由 PROPP UESC （073.6764.2019.0021079-85） 资助。MGAG 和 URS 分别感谢 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia （FAPESB） 和 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível de Nível （CAPES） 颁发的奖学金。
| 140 &度C 高温灭菌 CO2 培养箱 | 中国 RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD | C180 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯I7018 | |
| 醋酸冰川 | Sigma-Aldrich，美国密苏 | 里州圣路易斯PHR1748 | |
| Alcian Blue 8GX | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯A9186 | BioReagent，适用于糖蛋白的检测。1% 乙酸溶液，pH 2.5 |
| 酒精 70% | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯65350-M | 70% 水溶液 |
| 两性霉素B | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯PHR1662 | |
| 抗小鼠抗CD29 FITC（克隆Ha2/5） | BD Biosciences，美国加利福尼亚州 | 圣地亚哥555005 | 在细胞中的功能：粘附和活化、胚胎发生、白细胞、DC、血小板、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞 |
| 抗体 抗小鼠抗CD34 PE（克隆RAM34） | BD Biosciences，美国加利福尼亚州 | 圣地亚哥551387 | 细胞中的功能：细胞粘附因子。造血干细胞 |
| 抗体 抗小鼠抗CD45 APC（克隆30-F11） | BD Biosciences，美国加利福尼亚州 | 圣地亚哥559864 | 在细胞中的功能：协助激活白细胞 |
| 抗体 抗小鼠抗CD71 FITC（克隆C2） | BD Biosciences，美国加利福尼亚州 | 圣地亚哥553266 | 在细胞中的功能：控制细胞增殖过程中的铁摄取。增殖细胞、网织红细胞和前体 |
| 抗体 抗小鼠抗 CD90 PerCP （克隆 OX-7） | BD Biosciences， San Diego， CA， USA | 557266 | 在细胞中的功能：信号传导、粘附。T 淋巴细胞、NK、单核细胞、HSC、神经元、成纤维细胞 |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯PHR1008 | |
| 自动移液器 | Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆 | 4700850N | Finnpipette F1 良好实验室移液 （GLP） 套件 |
| 烧杯 | 不适用 | 1 单位 | |
| 血清白蛋白 | Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国 | A7906 | |
| 细胞培养板（6 孔） | 默克，德国达姆施塔特 | Z707759 | 07 单位无菌。TPP 组织培养板 |
| 细胞培养板（96 孔。圆形或 V 形底） | 默克，达姆施塔特，德国 | CLS353077 | 01 单位无菌。孔，96，组织培养 （TC） 处理的表面，圆底透明孔，无菌 |
| 软骨形成培养基 | Stem Pro 软骨形成分化–Life Technologies | A1007101 | TGF-β;2、TGF-&β;3、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、ITS、钠-l - 抗坏血酸、丙酮酸钠、抗坏血酸-2-磷酸 |
| II型胶原酶 | Life Technologies，美国加利福尼亚州 | 17101015 | |
| 软木或聚苯乙烯泡沫塑料板覆盖铝 | 不适用 | 1 | |
| 棉花 | 不适用 | 50克 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州 | 圣路易斯D4902 | |
| 解剖剪刀 | 不适用 | 03 单位无菌 | |
| DPX 组织学封固剂 | Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA | 6522 | |
| Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯D5523 | 含 1000 mg/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，粉末，适用于细胞培养 |
| 曙红 B | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯861006 | |
| 胎牛血清 （FBS） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯F4135 | |
| 甲醛 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯47608 | |
| 福尔马林 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯HT501128 | |
| 庆大霉素 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯G1397 | |
| 苏木精 | Sigma-Aldrich，美国密苏 | 里州圣路易斯H3136 | |
| 皮下注射针 （0.3mm x 13mm） | 不适用 | 5 | |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国密苏里 | 州I0200000 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯I3536 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯563935 | 70% 的 H 2O |
| 氯胺酮-D4 盐酸盐溶液 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯K-006 1.0 | mg/mL，甲醇（作为游离碱），认证参考物质，Cerilliant® |
| Neubauer 室 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯BR718620 | BRAND 计数室 BLAUBRAND Neubauer 图案。带夹子，双尺 |
| Nichiryo 移液器吸头 （0.1–10 μL） | 德国达姆施塔特默克 | Z645540 | 体积范围 0.1–10 μL 形，大包装。无菌 |
| Nichiryo 移液器吸头 （1–10 mL） | 德国达姆施塔特默克 | Z717401 | 体积范围 1–10 mL，通用型，散装。无菌 |
| Nichiryo 移液器吸头 （200 μL） | 默克，达姆施塔特，德国 | Z645516 | 最大体积 200 μL，已毕业，ministack。无菌 |
| 油红 O 溶液 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | O1391 | 0.5% 异丙醇 |
| 石蜡 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯107.151 | 46–48，块状 |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯P4333 | 溶液稳定，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，0.1 &μ;m 过滤，BioReagent，适用于细胞培养 |
| 磷酸盐缓冲盐水溶液 1x （PBS）。 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | P3813 | 粉末，pH 7.4，用于制备 1 L 溶液。平衡无菌 |
| 聚丙烯锥形管 （15 mL） | Falcon， Fisher Scientific | 14-959-53A | 无菌 |
| 聚丙烯锥形管 （50 mL） | Falcon， Fisher Scientific | 14-432-22 | 2 单位 |
| 手术刀（可选） | 不适用 | 1 单位 | |
| 硝酸银 | Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA | 85228 | |
| 硫代硫酸钠 | Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA | 72049 | |
| 手术镊子 （15 cm） | 不适用 | 3 单位 不育 | |
| 瑞士雄性小鼠 （6–8 周） | Bioterium，圣克鲁斯州立大学 | 021/22 | |
| 注射器 （1 mL） | 不适用 | 1 单位 | |
| 台盼蓝染料 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路 | 易斯T8154 | 0.4%，液体，无菌过滤，适用于细胞培养 |
| 胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸） | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | T3924 | |
| 甲苯噻嗪 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易 | 斯PHR3263 | |
| &β;-甘油磷酸二钠盐水合物 | Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯 | G9422 | BioUltra，适用于细胞培养，适用于植物细胞培养，≥99%（滴定） |
