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从小鼠附睾脂肪组织中分离、体外扩增及表征间充质干细胞

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DOI：

10.3791/65722

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2024年1月12日

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1Laboratory of Immunobiology, Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Department of Medicine, Afya Medical Sciences College

本文内容

摘要

脂肪组织是间充质干细胞的优良来源。本文详细介绍了从小鼠附睾脂肪组织中分离、培养和鉴定脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的逐步操作方法。

摘要

间充质干细胞（MSCs）作为一种新的治疗手段已被广泛研究，主要因其具有调节免疫反应的潜力，可用于抑制过度炎症反应。MSCs属于免疫豁免细胞，由于其主要组织相容性复合体I类（MHC I）分子表达水平较低，因此可在免疫学上不相容的同种异体移植受体中存活，适用于同种异体移植中的细胞治疗。这些细胞可从多种组织中分离获得，最常用的来源为骨髓和脂肪组织。本文提供一种简便的实验方案，用于从小鼠附睾脂肪组织中分离、培养和鉴定间充质干细胞。手术切除附睾脂肪组织后，进行物理破碎，并用0.15% II型胶原酶溶液消化。随后，对原代脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）进行培养与扩增 关键词：间充质干细胞，MSCs，免疫调节，脂肪组织来源干细胞，ADSCs，胶原酶消化，细胞培养，小鼠，附睾脂肪组织，同种异体移植 体外，并通过流式细胞术进行表型鉴定。我们还提供了将ADSCs分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞的步骤，随后对各细胞谱系进行功能鉴定。本方案可用于 体内 和 离体 实验，以及作为替代方案，可使用脂肪来源的干细胞生成类似间充质干细胞的永生化细胞。

引言

间充质干细胞（MSCs）是一类具有多向分化潜能的成体细胞，可分化为成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞等1,4。这类细胞存在于多种器官中，因此可从成体组织中分离获得，如骨髓、肌肉、脂肪、毛囊、牙根、胎盘、真皮、软骨膜、脐带、肺、肝和脾等3,4。

间充质干细胞（MSCs）对生理功能和免疫系统的影响已有报道5,6。这些细胞在人类医学和兽医学中治疗多种疾病方面展现出良好前景。MSCs可通过细胞间接触、可溶性因子以及小细胞外囊泡等多种机制调控炎症反应，并促进血管生成和组织稳态7,8,9,10。此外，MSCs属于免疫豁免细胞，能够在免疫学上不相容的同种异体移植受者中存活，原因是这些细胞主要组织相容性复合体I类（MHC）分子的表达水平较低，因此可用于同种异体移植的细胞治疗11,12。MSCs低免疫原性与再生潜能的结合，使其成为细胞治疗的理想候选，可用于移植物抗宿主病（GvHD）13、系统性红斑狼疮（SLE）14、多发性硬化症15等多种疾病16,17。

尽管间充质干细胞（MSCs）存在于多种成体组织中，但脂肪组织相较于其他来源具有多项优势，如获取便捷、仅需最小程度的外科干预；可获得大量细胞且扩增速率高；以及易于操作 体外 使用一种操作简便的方案进行扩增，无需特殊设备且材料成本低廉18,19,20提取后，脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）必须根据国际细胞治疗学会（ISCT） established 的标准进行表征21因此，间充质干细胞必须呈现成纤维细胞样形态，能够贴壁生长于塑料培养皿表面，并高表达（≥95%）间充质细胞标志物，如内皮糖蛋白（CD105）、胞外5'-核苷酸酶（CD73）和Thy-1（CD90），同时低表达（≤2%）造血系标志物，如白细胞共同抗原（CD45）、跨膜磷糖蛋白（CD34）、糖脂锚定膜糖蛋白（CD14）、整合素αM（CD11b）、B细胞抗原受体复合物相关蛋白α链（CD79α）或B淋巴细胞表面抗原B4（CD19）以及Ⅱ类人白细胞抗原（HLA-II）。此外，还需进行功能特性鉴定，细胞应具备向成骨细胞、软骨母细胞或脂肪母细胞分化的潜能。21.

在此，我们展示如何通过机械解离和酶消化法从附睾脂肪组织中分离获得间充质干细胞（MSCs） 体外 研究以及ISCT推荐的形态学表征。

方案

所有动物实验均按照国际动物伦理指南进行，并经圣克鲁斯州立大学机构动物护理与使用委员会根据协议编号021/22批准。实验所用雄性Swiss小鼠（6-8周龄）购自圣克鲁斯州立大学动物繁殖、维护与实验实验室（LaBIO-UESC）动物实验中心，在特定病原体-free环境中饲养，自由饮水和进食，光照/黑暗周期为12小时。

注意：可使用其他品系的小鼠；建议使用成年小鼠（6-8周龄），因为其脂肪组织更发达，且细胞具有较高的增殖活性。

1. 准备

注意：在开始之前，请准备如下所述的以下试剂。有关试剂和材料的供应商信息，请参见材料表。所有实验操作过程中必须佩戴个人防护装备，如口罩、帽子、实验服和手套。

  1. 附睾脂肪组织提取
    1. 准备手术器械：无菌镊子和剪刀各三套、针头五个，以及一个盛有 200 mL 70% 乙醇的烧杯。
    2. 准备终末麻醉剂，按酮胺（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的比例混合。
  2. ADSCs 培养
    1. 基础培养基：制备高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），添加 10% 胎牛血清（FBS）、50 µg/mL 庆大霉素、0.25 µg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。
    2. 消化液：在 PBS 中配制 0.15% II 型胶原酶，并通过 0.25 µm 滤器灭菌。
      注：无需使用基础培养基中所述的四种抗生素，具体取决于实验操作所在实验室的细胞培养条件。
  3. ADSCs 表型鉴定
    1. 在 PBS 中配制 1% 牛血清白蛋白（BSA）。
    2. 按照 表 1 中所述稀释抗小鼠抗体。
    3. 在 PBS 中配制 2% 甲醛。
  4. ADSCs 成骨分化
    1. 成骨分化培养基：制备添加 5.67 M 抗坏血酸、10 nM 地塞米松、0.02 M β-甘油磷酸钠、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。
    2. 用于 Von Kossa 染色时，配制以下溶液：水中 70% 乙醇、水中 5% 硝酸银、蒸馏水、水中 5% 硫代硫酸钠、水中 1% 伊红 B。
  5. 成脂分化：
    1. 成脂分化培养基：制备添加 0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、200 µM 吲哚美辛、1 µM 地塞米松、10 µM 胰岛素、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 培养基。
    2. 用于油红 O 染色时，配制以下溶液：去离子水中 10% 甲醛、去离子水中 60% 异丙醇、溶于 60% 异丙醇的溶酶染料（脂溶性染料）偶氮染料（油红 O 溶液）、去离子水中 1% 苏木精。
  6. 成软骨分化：
    1. 成软骨分化培养基：制备添加 10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的成软骨培养基。
    2. 在 PBS 中配制 10% 甲醛。
    3. 用于蛋白聚糖和糖胺聚糖染色时，配制以下溶液：醋酸中异多糖染色剂（阿利新蓝 1%），pH 2.5、石蜡、苏木精、水中梯度稀释乙醇（100%、96%、80% 和 70%）。

抗体/荧光染料稀释比例克隆号终浓度 (µg/mL)功能及表达该标记物的细胞
CD34-PE1:100RAM342细胞黏附因子。造血干细胞。
CD45-APC1:10030-F112辅助白细胞活化。在白细胞中表达。
CD71-FITC1:100C25调控细胞增殖过程中的铁摄取。增殖中的细胞、网织红细胞及前体细胞。
CD29-FITC1:100Ha2/55参与黏附与活化、胚胎发生过程。表达于白细胞、树突状细胞、血小板、肥大细胞、成纤维细胞及内皮细胞。
CD90-PerCP1:100OX-72参与信号转导与黏附。表达于T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、造血干细胞、神经元及成纤维细胞。

表1：通过流式细胞仪对ADSCs进行表型表征所使用的抗体。 列出了各抗体及其相应的荧光染料、稀释比例、克隆号、终浓度，以及在细胞中表达的功能。

2. 方法

注意：脂肪组织分布在全身的皮下或腹腔内区域。在小鼠中，实验最常用的脂肪组织包括皮下附睾脂肪、肠系膜脂肪和腹膜后脂肪22。此处展示获取附睾脂肪组织的步骤（图1）。

脂肪组织提取和干细胞分离过程；实验室图像、显微镜、生物学研究。
图1：从小鼠中获取脂肪组织来源干细胞的实验设计。（A）使用针头将动物固定在软木板或泡沫板上；（B）用镊子提起皮肤，在腹部中央做切口，并将皮肤与腹膜分离；（C）识别附着于附睾上方的白色脂肪组织；（D）将组织转移至添加了10% FBS和1%抗生素的DMEM培养基中，用PBS充分清洗附睾脂肪组织，然后将组织转移至消化液中；（E）将组织剪碎并（F）在37 °C条件下孵育1小时，每10分钟剧烈振荡一次；（G）细胞计数后接种于6孔板中，并在倒置显微镜下观察细胞形态。（F）细胞形态将由圆形变为成纤维细胞样。比例尺 = 22.22 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 提取附睾脂肪组织
    注意：为确保细胞培养的纯净且无污染，所有操作均须在层流柜内的无菌条件下进行。
    1. 通过腹腔注射方式，使用氯胺酮和赛拉嗪溶液（100 和 10 mg/kg，如步骤 1.1.2 所述）对动物实施安乐死。
      注意：也可使用其他安乐死方法23确认动物心跳停止，以确保其死亡。
    2. 将动物腹侧朝上放置在覆盖有铝箔的软木板或泡沫板上，并使用无菌针固定图1A).
      注意：为避免污染，用70%酒精喷洒腹部区域。或者，用手术刀剃除毛发。
    3. 用镊子在腹部区域中央提起皮肤，并用无菌剪刀剪开。
      注意：需要两套无菌镊子和剪刀以避免污染。第一套用于打开动物体腔，切割皮肤和腹膜层；第二套用于夹取附睾脂肪组织。此外，准备一个烧杯，盛装150 mL 70%乙醇，用于在操作步骤之间清洁剪刀和镊子。
    4. 将剪刀插入动物皮肤下方，打开剪刀以分离皮肤与腹膜图1B用镊子提起腹膜层，并用无菌剪刀剪开。
    5. 使用另一套无菌镊子和剪刀，辨认位于睾丸上方的附睾以及附睾上方的白色脂肪组织。用无菌镊子夹取整个附睾脂肪组织（大小约2 cm），并在紧邻附睾处剪下。图1C).
    6. 将脂肪放入含有基础培养基的50 mL无菌锥形管中，并置于冰上（图1D在通风橱中，按以下所述继续进行下一步操作。
  2. 脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的分离
    注意：应在生物安全二级层流罩内处理样本，操作人员应穿戴实验服、手套和外科口罩。
    1. 用 PBS 充分洗涤附睾脂肪组织。
      注意：此步骤对于去除样品中的血液及其他颗粒物至关重要。血液可能抑制II型胶原酶活性，从而影响实验结果。
    2. 使用无菌镊子将附睾脂肪组织转移至含有15–20 mL消化液的50 mL离心管中（消化液按步骤1.2.2配制）。用无菌剪刀将组织剪碎，并将组织在以下条件下孵育： 37 °C 1 小时（图1E，F).
      注意：使用水浴或培养箱，在 37 °C 此步骤中可使用。每隔10分钟必须剧烈振荡悬浮液以促进消化。孵育时间不得超过1小时。
    3. 通过将样品与基础培养基按1:1稀释使胶原酶失活，并将悬液在250 x g 10 分钟 4 °C 以获得基质中的血管组分。弃去上清液，将沉淀物重悬于1 mL基础培养基中。
    4. 使用台盼蓝染色排斥法，在Neubauer计数板中以1:10或1:100的稀释比例检测细胞活力并进行细胞计数。
      注意：预期产量约为每克处理后的脂肪组织获得0.5–1×10⁶个细胞，细胞活力为80%。
    5. 将分离的细胞（0.3–0.5 × 10⁶）接种于6孔板的一个孔中，每孔加入3 mL基础培养基。于37°C、5% CO₂培养箱中孵育过夜 37 °C 含5% CO₂2.
    6. 次日：移除孔中的培养基，用 PBS 洗涤细胞，加入 3 mL 基础培养基。每 2 天重复此操作，直至细胞融合度达到 90%。
      注意：始终在倒置显微镜下观察细胞形态，细胞形态由圆形逐渐变为成纤维细胞样（图1H).
  3. 脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）扩增
    注意：当细胞生长至约90%融合时，按如下所述进行传代培养。
    1. 从孔中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞。每孔加入 0.5 mL 胰蛋白酶/EDTA（0.05 % 胰蛋白酶；200 mg/L EDTA），将培养板置于 3–5 分钟，于 37 °C 消化细胞。
      注意：胰蛋白酶/EDTA消化时间不得超过5分钟。应在倒置显微镜下确认细胞是否完全脱落。可通过轻柔吹打或轻敲培养板侧壁来加速细胞脱落过程。
    2. 通过将样品与添加有10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM培养基按1:1比例稀释，使酶失活。
    3. 将细胞悬液分装至2个孔中，每孔加入3 mL基础培养基（DMEM，添加10% FBS和1%抗生素）。于37°C、5% CO₂培养箱中过夜培养。 37 °C 含5% CO2.
    4. 第二天更换培养基，之后每2天更换一次，直至细胞融合度达到90%。
    5. 重复该过程至第三代，然后进行表型及功能特性鉴定。
      注意：始终在倒置显微镜下观察细胞形态，其形态由圆形逐渐变为成纤维细胞样。
  4. 脂肪组织来源干细胞（ADSCs）的表征
    1. 通过流式细胞术进行表型表征
      1. 使用胰蛋白酶/EDTA 消化细胞，具体步骤如 2.3.1 至 2.3.2 所述。
      2. 将细胞收集至锥形管（50 mL）中，在250 x g条件下离心 g 10 分钟 4 °C弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL PBS中。
      3. 按照步骤 2.2.4 中所述计数细胞，并接种 0.5–1 × 106 细胞中 100 µL 在96孔板中加入PBS。
        注意：所需孔数取决于荧光染料偶联物的颜色以及流式细胞仪的滤光片/激光器配置。
      4. 加入抗体（表1在含1% BSA的PBS中稀释。
        注意：由于我们已使用 BSA 稀释抗体，因此无需使用 Fc 封闭来避免非特异性结合。保留一份未加抗体的细胞样本，作为染色对照。可根据实验室现有的荧光染料和流式细胞仪，将抗体组合于同一孔中。文中所述所有抗体均 表1 除了CD71 FITC和CD29 FITC由于使用相同的荧光素必须分置于不同孔中外，其余抗体可加入同一孔内。
      5. 在30分钟内将培养板孵育于 4 °C 在暗处。
      6. 洗涤细胞，然后补足体积至 200 µL 使用 PBS，以 252 x g 离心培养板 g 10 分钟 4 °C，弃去上清液。重复此步骤一次。
      7. 通过添加固定液来固定细胞 200 µL 每孔加入 PBS 中 2% 多聚甲醛。将细胞置于避光条件下保存于 4 °C 直至在流式细胞仪中进行分析。
        注意：为了获得最佳结果，应尽快在流式细胞仪上获取细胞。大多数荧光染料的荧光信号强度在48小时后会显著衰减。因此，读板时间不应超过48小时。建议获取30,000个事件。
      8. 使用所提供的设门策略 图2B 以筛选ASC群体。
    2. 功能鉴定：成骨分化
      1. 使用胰蛋白酶/EDTA 消化细胞（步骤 2.3.1 至 2.3.2 所述），收集细胞并离心（步骤 2.4.1.2 和 2.4.1.2 所述），然后计数（步骤 2.2.4 所述）。
      2. 以每孔2 x 10的细胞数，每组设三个复孔，进行接种5 6 孔板中每孔接种细胞，加入基础培养基（DMEM，添加 10% FBS 和 1% 抗生素）；于 37°C、5% CO₂ 培养箱中培养 37 °C 在5% CO₂中2.
        注意：需要两个6孔板，分别用于两个分化时间点（14天和21天）。
      3. 次日，将培养基更换为成骨诱导培养基（步骤 1.4.1）。
        注意：预留3个仅用基础培养基培养的孔，作为分化的对照。
      4. 在成骨诱导培养基和对照培养基中分别培养细胞14天和21天，每3天更换一次培养基。每个培养阶段结束后，进行Von Kossa染色（步骤1.4.2），以评估矿化结节的形成情况。
      5. 吸弃每孔中的培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。用 2 mL 70% 乙醇在室温（RT）下固定细胞，过夜。用流动水小心洗涤细胞。
      6. 加入2 mL 5%硝酸银溶液，将培养板置于紫外光下孵育1 h。用蒸馏水洗涤细胞。加入2 mL 5%硫代硫酸钠溶液，孵育5 min。用蒸馏水洗涤。
      7. 用2 mL伊红复染40秒。用蒸馏水洗涤至去除染色液，然后使用光学显微镜观察染色结果。
    3. 功能鉴定：脂肪成脂分化
      1. 使用胰蛋白酶/EDTA 消化细胞（步骤 2.3.1 至 2.3.2 所述），收集细胞并离心（步骤 2.4.1.2 和 2.4.1.2 所述），然后计数（步骤 2.2.4 所述）。
      2. 接种 2 × 105 每孔接种细胞于6孔板中，使用基础培养基（DMEM，添加10% FBS和1%抗生素）；置于37°C、5% CO₂培养箱中培养 37 °C 在5% CO₂中2.
        注意：需要两个6孔板，分别用于两个分化时间点（14天和21天）。
      3. 第二天，将培养基更换为成脂诱导培养基（步骤 2.5.1）。
        注意：预留3个仅用基础培养基培养的孔作为对照。
      4. 在成脂诱导培养基中培养细胞14天和21天，每3天更换一次培养基。每个培养周期结束时，进行油红O染色（步骤2.4.3.5–2.4.3.7），以检测细胞内脂质积累情况。
      5. 吸弃每孔中的培养基，用 PBS 洗涤细胞两次。加入 2 mL 10% 甲醛溶液，室温固定细胞 1 小时。用 PBS 洗涤一次，再用水洗涤一次。
      6. 用2 mL 60%异丙醇中的油红O溶液染色5分钟。用蒸馏水洗涤一次。
      7. 用1%苏木精（用蒸馏水按1:2稀释）2 mL复染1分钟。用蒸馏水洗涤至染色液去除，然后使用光学显微镜观察染色样本。
    4. 功能鉴定：软骨细胞分化
      1. 使用胰蛋白酶/EDTA 消化细胞（步骤 2.3.1 至 2.3.2 所述），收集细胞并离心（步骤 2.4.1.2 和 2.4.1.2 所述），然后计数（步骤 2.2.4 所述）。
      2. 将 5 x 105 将ADSCs分装至四个聚丙烯圆锥形试管中，在450 x g条件下离心 g 离心5分钟以形成沉淀，弃去上清液。
      3. 将沉淀物置于锥形管中，用软骨诱导培养基（步骤1.6.1）或仅用基础培养基（分化对照）培养14天和21天 37 °C 在5% CO₂中2每3天更换一次培养基，避免移除细胞沉淀。
        注意：每个细胞沉淀对应于各自的培养时间，以及仅用基础培养基培养的相应对照组。
      4. 在每个培养时间点结束时，使用尖头镊子收集沉淀物，并将其置于24孔板中。随后进行组织学切片以及蛋白聚糖和糖胺聚糖的染色（步骤2.4.4.5–2.4.4.9）。
        注意：每个沉淀物需在单独的孔中进行处理。
      5. 将沉淀物用2 mL 10%缓冲福尔马林固定30分钟。弃去福尔马林溶液，加入2 mL 70%乙醇。用枪头取出沉淀物，并将其包埋于石蜡中。
      6. 使用旋转式石蜡切片机，制作 5 µm 组织学切片。将切片在37°C下孵育15分钟 60 °C，然后将它们在二甲苯中浸洗两次（每次分别为5分钟和15分钟）。
      7. 将组织切片浸入浓度递减的酒精溶液（100%、96%、80% 和 70%）中各 2 分钟以复水，随后用去离子水冲洗 5 分钟。
      8. 用1%阿尔新蓝乙酸溶液（pH 2.5）对样本染色30分钟。
      9. 用苏木精复染1分钟，蒸馏水洗涤。用DPX（组织学封片剂）或其他封片剂封片，并使用光学显微镜观察样本。

结果

根据本方案从脂肪组织中提取的细胞，其形态符合国际细胞治疗学会（ISCT）提出的间充质干细胞（MSCs）最低标准。本方案的概览见图1。在表型上，脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）在细胞培养初期表现出贴壁生长特性和成纤维细胞样形态（图2A）。此外，这些细胞生长均一，并形成集落。同时，ADSCs对造血细胞标志物CD34（2.12%）和CD45（1.81%）表达水平较低，而对间充质细胞标志物CD71（42.6%）、CD29（74.2%）和CD90（55.1%）表达水平较高（图2B）。

第2、4、10天的细胞生长情况；流式细胞术直方图显示分化标志物（CD34、CD45）表达。
图2：脂肪组织来源细胞的表型鉴定。（A）ADSCs在培养第2、4和8天时形态由圆形逐渐变为成纤维细胞样；比例尺 = 22.22 µm。（B）ASC表达（CD71、CD29和CD90）或不表达（CD34和CD45）的标志物直方图。本图已获 Miranda 等人24 许可转载。请点击此处查看此图的放大版本。

功能上，ADSCs在特定谱系的条件培养基中培养14或21天后，表现出向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞多向分化的潜能（图3）。Von Kossa染色显示细胞外基质中存在矿化结节，这是成骨过程的特征（图3）。油红O染色显示ADSCs胞质内含有脂滴，而阿利新蓝染色证实了细胞外基质中存在糖胺聚糖（图3）。综上，表型和功能特征均证实从附睾脂肪组织中提取的细胞群体为间充质干细胞（MSCs）。

干细胞分化阶段；成骨、成脂、成软骨分化途径；显微镜图像。
图3：脂肪组织来源细胞的功能表征。 脂肪源性间充质干细胞（ADSC）在培养14天和21天后的成骨、成脂和成软骨多向分化潜能。比例尺 = 50 µm（上图），100 µm（中图和下图）。本图经 Miranda 等人许可转载24。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

间充质干细胞（MSCs）可以从不同的组织中提取。尽管骨髓在小鼠和人类中均为MSCs的常见来源25,26，但本研究选择使用脂肪组织，因其富含MSCs，且在体内分布广泛，易于获取。作为替代方案，脂肪来源的干细胞可用于生成类似MSCs的永生化细胞27。

提取过程中的某些环节对于本文所共享方案的成功实施尤为关键。首先，需强调组织采集必须在无菌条件下进行。因此，在开始手术前，应确保使用70%酒精对小鼠进行充分消毒。另一个重要环节是，不得使用同一套镊子和剪刀来夹取附睾脂肪组织，以避免任何可能的污染源。

第二个问题是组织的处理。锥形管中的组织碎片必须在37 °C孵育10分钟，并在此期间充分且剧烈振荡。次日更换培养基，之后每2-3天更换一次，这一点非常重要。建议每天观察培养情况，检查培养基颜色、细胞形态以及培养环境中是否存在任何干扰因素。

第三个问题是关于间充质干细胞（MSC）表征的最佳时间或传代次数。我们建议在细胞的第三代进行表征，但这并非强制要求，具体取决于研究目的。例如，在第三代时，约有80%的细胞可被鉴定为MSCs，这已足以满足本研究的目标。表型表征通过分析造血细胞标志物（如CD34和CD45）以及间充质细胞标志物（如CD29、CD73、CD90和CD105）的表达来进行。此外，国际细胞与基因治疗学会（ISCT）21指出，脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）应具有成纤维细胞样形态，并能贴附于培养平台的塑料表面。该形态可在培养过程中通过显微镜观察。功能表征则通过分析ADSCs向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能来完成。在表型表征中，间充质和造血标志物的阳性比例可能因动物种类和细胞来源不同而有所差异，未必完全符合ISCT推荐的标准。例如，ISCT建议人源MSCs应满足：CD105、CD73、CD90的表达率≥95%，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19、人类白细胞抗原-DR同种型（HLA-DR）的表达率≤2%21。此外，进行功能表征以确认细胞具有向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞谱系分化的多向分化潜能非常重要。建议至少验证其中两个谱系的分化能力以证明其多能性。

除了上述重点之外，文中建议的一些检测方法可以相互替代，例如，可使用茜素红S染色替代冯库萨染色，使用过碘酸希夫染色替代阿新蓝染色，以及使用聚合酶链式反应（PCR）替代流式细胞术。

在人体中描述的三种脂肪组织（白色、棕色和米色）中，白色脂肪组织是间充质干细胞（MSCs）最主要的来源28。该组织可从皮下、腹部和腹股沟区域获取，例如本研究中所述的附睾上方脂肪组织。本方案中采用物理破碎结合胶原酶消化的方法，可获得基质血管组分（SVF），其中包含多种细胞类型，而脂肪细胞在处理过程中被去除。

总之，使用脂肪组织作为间充质干细胞（MSCs）来源的主要优势包括其来源丰富、细胞分离方法简便，以及MSCs所具有的抗炎和再生治疗潜力。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到巴西国家科学技术发展委员会（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico，项目号：480807/2011-6）和米纳斯吉拉斯州研究资助基金会（Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais，项目号：APQ-01237-11）的资助。本研究部分由南巴伊亚联邦大学研究与研究生事务处（PROPP UESC，项目号：073.6764.2019.0021079-85）资助。MGAG 和 URS 分别感谢巴伊亚州研究资助基金会（Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia，FAPESB）和高等教育人员提升协调办公室（Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior，CAPES）提供的奖学金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
140 °C 高温灭菌 CO2 培养箱RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, 中国C180
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
冰醋酸Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
阿利新蓝 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186生物试剂，适用于糖蛋白检测。1% 乙酸溶液，pH 2.5
70% 乙醇Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% 水溶液
两性霉素 BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
抗小鼠 CD29 FITC 抗体（克隆 Ha2/5）BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005细胞功能：黏附与激活、胚胎发生、白细胞、树突状细胞、血小板、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞
抗小鼠 CD34 PE 抗体（克隆 RAM34）BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387细胞功能：细胞黏附因子。造血干细胞
抗小鼠 CD45 APC 抗体（克隆 30-F11）BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864细胞功能：协助白细胞活化
抗小鼠 CD71 FITC 抗体（克隆 C2）BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266细胞功能：调控细胞增殖过程中的铁摄取。增殖细胞、网织红细胞及其前体细胞
抗小鼠 CD90 PerCP 抗体（克隆 OX-7）BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266细胞功能：信号传导、黏附。T 淋巴细胞、NK 细胞、单核细胞、造血干细胞、神经元、成纤维细胞
抗坏血酸Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
自动移液器Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 良好实验室操作（GLP）套装
烧杯不适用1 个
牛血清白蛋白Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
细胞培养板（6 孔）Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 个无菌。TPP 组织培养板
细胞培养板（96 孔，圆底或 V 型底）Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 个无菌。96 孔，组织培养（TC）处理表面，透明圆底孔，无菌
软骨诱导培养基Stem Pro 软骨分化培养基–Life TechnologiesA1007101TGF-β2、TGF-β3、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、ITS、L-抗坏血酸钠、丙酮酸钠、抗坏血酸-2-磷酸
II 型胶原酶Life Technologies, California, USA17101015
铝箔包裹的软木或泡沫板不适用1 个
棉球不适用50 g
地塞米松Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
解剖剪刀不适用03 把无菌
组织学用 DPX 封片剂Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523含 1000 mg/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，粉末状，适用于细胞培养
伊红 BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
胎牛血清（FBS）Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
甲醛Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
福尔马林Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
庆大霉素Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
苏木精Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
皮下注射针头（0.3 mm × 13 mm）不适用5 支
吲哚美辛Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
胰岛素Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
异丙醇Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% H2O 溶液
氯化氘代酮洛芬溶液Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-006甲醇中 1.0 mg/mL（以游离碱计），认证标准物质，Cerilliant®
血细胞计数板（Neubauer 室）Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND 计数板 BLAUBRAND Neubauer 型式。带夹具，双线刻度
Nichiryo 移液器吸头（0.1–10 μL）Merck, Darmstadt, GermanyZ645540体积范围 0.1–10 μL，细长型，散装。无菌
Nichiryo 移液器吸头（1–10 mL）Merck, Darmstadt, GermanyZ717401体积范围 1–10 mL，通用型，散装。无菌
Nichiryo 移液器吸头（200 μL）Merck, Darmstadt, GermanyZ645516最大体积 200 μL，带刻度，小栈装。无菌
油红 O 溶液Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO1391异丙醇中 0.5%
石蜡Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48，块状
青霉素/链霉素Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333稳定化溶液，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，0.1 μm 过滤，生物试剂，适用于细胞培养
1× 磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813粉末，pH 7.4，用于配制 1 L 溶液。平衡且无菌
聚丙烯锥形管（15 mL）Falcon, Fisher Scientific14-959-53A无菌
聚丙烯锥形管（50 mL）Falcon, Fisher Scientific14-432-222 支无菌
手术刀（可选）不适用1 把
硝酸银Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
硫代硫酸钠Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
手术镊（15 cm）不适用3 把无菌
瑞士雄性小鼠（6–8 周）Bioterium, Santa Cruz 州立大学021/22
注射器（1 mL）不适用1 支
台盼蓝染料Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
赛拉嗪Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-甘油磷酸二钠盐水合物Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra，适用于细胞培养，适用于植物细胞培养，≥99%（滴定法）

参考文献

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