小鼠附睾脂肪组织中间充质干细胞的分离、体外扩增和表征

摘要

脂肪组织是间充质干细胞的极好来源。在这里，我们带来了从瑞士小鼠附睾脂肪组织中逐步提取、培养和表征脂肪组织衍生干细胞 （ADSC） 的过程。

摘要

间充质干细胞 （MSCs） 作为一种新的治疗方法已被广泛研究，主要用于阻止炎症加剧，因为它们具有调节免疫反应的潜力。间充质干细胞是一种免疫特权细胞，能够在免疫互容的同种异体移植受者中存活，这些受体基于 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子的低表达以及使用基于细胞的疗法进行同种异体移植。这些细胞可以从多种组织中分离出来，最常用的是骨髓和脂肪组织。我们提供了一种简单的方案来分离、培养和表征小鼠附睾脂肪组织中的 MSC。附睾脂肪组织通过手术切除，物理破碎，并用 0.15% II 型胶原酶溶液消化。然后，在 体外培养和扩增原代脂肪组织来源的干细胞（ADSC）细胞，并通过流式细胞术进行表型表征。我们还提供了将ADSC分化为成骨细胞、产脂细胞和软骨生成细胞的步骤，然后对每个细胞谱系进行功能表征。此处提供的方案可用于 体内 和 离体 实验，作为替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞。

引言

间充质干细胞 （MSC） 是分化成成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞等细胞的成体多潜能细胞 ^1,2。这些细胞存在于多个器官中，因此，它们可以从骨髓、肌肉、脂肪、毛囊、牙根、胎盘、真皮、软骨膜、脐带、肺、肝脏和脾脏等成人组织中提取 ^3,4。

间充质干细胞对生理学和免疫系统的影响已有报道 ^5,6。这些细胞在人类和兽医学中都有望治疗多种疾病。间充质干细胞可以通过不同的机制控制炎症并促进血管生成和组织稳态，例如细胞间接触、可溶性因子和小细胞外囊泡 7,8,9,10。此外，间充质干细胞是免疫特权细胞，能够在免疫不相容的同种异体移植受体中存活，因为这些细胞显示出 I 类主要组织相容性复合体 （MHC） 分子的低表达，并且用于基于细胞的同种异体移植疗法^11,12。低免疫原性与再生潜力相结合，使间充质干细胞成为细胞疗法的理想候选药物，例如移植物抗宿主病 （GvHD）¹³、系统性红斑狼疮 （SLE）¹⁴ 和多发性硬化症¹⁵ 等^16,17。

尽管间充质干细胞存在于几种成体组织中，但脂肪组织比其他来源具有优势，例如易于收获，手术干预最少;可用电池数量多，扩增率高;使用易于执行的方案轻松进行体外扩增，无需特定设备和低成本材料 18,19,20。一旦提取，脂肪组织来源的干细胞 （ADSC） 必须按照国际细胞治疗学会 （ISCT） ²¹ 的规定进行表征。因此，间充质干细胞必须表现出形态成纤维细胞样，对塑料培养物的粘附，表达高百分比 （≥95%） 的间充质标志物，如内分泌素 （CD105）、胞外-5'-核苷酸酶 （CD73） 和 Thy-1 （CD90），以及低百分比 （≤2%） 的造血标志物，如白细胞共同抗原 （CD45）、跨膜磷酸糖蛋白 （CD34）、糖脂锚定膜糖蛋白 （CD14）、整合素 α M （CD11b）、B 细胞抗原受体复合物相关蛋白 α 链 （CD79α） 或B 淋巴细胞表面抗原 B4 （CD19） 和 II 类人类白细胞抗原 （HLA-II）。此外，还需要进行功能表征，并且细胞应该能够分化为成骨细胞、软骨母细胞或脂肪母细胞²¹。

在这里，我们展示了如何使用机械解离和酶消化从附睾脂肪组织获得MSCs，用于 体外 研究以及ISCT预先确定的形态学表征。

方案

所有动物实验均根据国际动物伦理准则进行，并由圣克鲁斯州立大学护理和使用机构委员会根据协议编号021/22批准。瑞士雄性小鼠（6-8周）购自动物育种，维护和实验实验室 - 圣克鲁斯州立大学（LaBIO-UESC）动物研究设施，维持在特定的无病原体条件下，自由接受水和食物，12小时光/暗循环。

注意:可以使用其他小鼠谱系;我们建议使用成年小鼠（6-8周），因为它们具有更发达的脂肪组织和具有高增殖活性的细胞。

1. 准备工作

注意:在继续之前，请准备以下所述的试剂。有关试剂和材料供应商信息，请参阅 材料表 。在所有实际程序中都必须佩戴个人防护设备，例如口罩、帽子、实验室外套和手套。

1. 附睾脂肪组织摘除术
   1. 预留手术材料:三套无菌镊子和剪刀、五根针头和一个装有 200 mL 70% 乙醇的烧杯。
   2. 准备终末麻醉剂，混合氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）。
2. ADSCs文化
   1. 基础培养基:制备补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、50 μg/mL 庆大霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 高葡萄糖培养基。
   2. 消化溶液:在0.25μm过滤器中灭菌的PBS中制备0.15%的II型胶原酶。
      注意:没有必要使用基础培养基中描述的四种抗生素。这将取决于进行此操作的实验室的细胞培养条件。
3. ADSCs表型表征
   1. 在PBS中制备1%牛血清白蛋白（BSA）。
   2. 稀释表 1中提到的抗小鼠抗体。
   3. 在PBS中制备2%的甲醛。
4. ADSCs成骨分化
   1. 成骨分化培养基:制备补充有 5.67 M 抗坏血酸、10 nM 地塞米松、0.02 M β-甘油磷酸盐、10% FBS 和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM。
   2. 对于 Von Kossa 染色，制备以下溶液:70% 乙醇水溶液、5% 硝酸银水溶液、蒸馏水、5% 硫代硫酸钠水溶液和 1% 曙红 B 水溶液。
5. 成脂分化:

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结果

根据此处介绍的方案从脂肪组织中提取的细胞显示出符合ISCT提出的MSCs最低标准的形态。该协议的概述如图 1 所示。从表型上看，ADSCs在细胞培养的第一天表现出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附（图2A）。此外，它们均匀生长并形成殖民地。此外，ADSCs的造血标志物CD34（2.12%）和CD45（1.81%）表达低，CD71（42.6%）、CD29（74.2%）和CD90（55.1%）均为间充质细胞标志物（图2B）。

图 2:脂肪组织来源细胞的表型表征。 （A） 培养后第2、4、8天ADSCs形态由圆形变为成纤维细胞样;比例尺 = 22.22 μm。 （B） ASC 表达（CD71、CD29 和 CD90）或不表达（CD34 和 CD45）标记的直方图。该图经Miranda等人许可转载²⁴。 请点击这里查看此图的较大版本.

在功能上，当在条件培养基中为每个谱系培养 14 或 21 天时，ADSC 显示出多能性，可分化为成骨细胞、脂肪母细胞和软骨细胞（图 3）。Von Kossa染色显示细胞外基质中存在矿化结节，这是成骨过程的特征（图3）。Oil-red O 染色证实 ADSC 细胞质中存在脂质空泡，Alcian Blue 染色证实细胞外基质中存在糖胺聚糖（图 3）。总之，表型和功能特征证实了从附睾脂肪组织中提取的细胞群为间充质干细胞。

图 3:脂肪组织来源细胞的功能表征。 培养 14 天和 21 天后 ADSC 的成骨、成脂和成软骨多系潜力。比例尺 = 50 μm（顶部面板），100 μm（中间和底部面板）。该图经Miranda等人许可转载²⁴。 请点击这里查看此图的较大版本.

讨论

间充质干细胞可以从不同的组织中提取。尽管骨髓在小鼠和人类中都是间充质干细胞的常见来源^25,26，^但我们选择在这项研究中使用脂肪组织，因为它富含间充质干细胞、在体内的分布以及易于获取。作为一种替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞²⁷。

对于此处共享的协议的成功，提取的一些要点值得特别关注。首先，我们强调必须在无菌条件下收集组织的注意。因此，在开始手术之前，请确保用70%的酒精对小鼠进行适当消毒。另一个重要的一点是不要使用同一套镊子和剪刀来拾取附睾脂肪组织，从而避免任何污染源。

第二个问题是组织的处理。锥形管中的片段必须在37°C下孵育10分钟，适当并剧烈地摇动。 第二天更换培养基非常重要，然后每 2-3 天更换一次。建议每天观察培养物，检查培养基颜色、细胞形状以及培养物环境中的任何干扰。

第三个问题是MSC表征的最佳时间/通道。在这里，我们建议在细胞的第三次传代时进行，但这不是强制性的。这取决于研究的目标。在第三次传代中，我们有大约 80% 的细胞被表征为 MSCs，这对于本研究的目标来说已经足够了。通过分析造血标志物（例如 CD34 和 CD45）和间充质标志物（例如 CD29、CD73、CD90 和 CD105）的表达进行表型表征。此外，国际细胞与基因治疗学会 （ISCT）²¹ 强调，ADSC 应具有成纤维细胞样形态并粘附在培养平台的塑料上。在生长培养过程中，可以在显微镜下观察形态。通过分析 ADSC 分化成成骨细胞、脂肪母细胞和软骨细胞的潜力来进行功能表征。在表型表征中，间充质和造血标志物的百分比可能根据动物种类和细胞来源而变化，不完全满足 ISCT 推荐的数字。例如，ISCT 推荐人类 MSC ≥95% 的 CD105、CD73、CD90 和 ≤2% 的 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a 或 CD19，人类白细胞抗原 - DR 同型 （HLA-DR）²¹。此外，进行功能表征并确认细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞谱系的多能性也很重要。建议至少使用这些谱系中的两个来证明多能性。

除了这些突出的要点外，这里建议的一些检测方法也可以替代，例如，用茜素红 S 代替 Von Kossa 染色，用高碘酸 Shiff 代替阿尔新蓝，用聚合酶链反应 （PCR） 代替流式细胞术。

在人类描述的三种脂肪组织（白色、棕色和米色）中，白色脂肪组织具有最高的 MSCs^{来源 28}。这种组织可以从皮下、腹部和腹股沟区域获得，例如此处报道的附睾上方的脂肪。此处共享的方案中使用的胶原酶的物理碎裂和酶消化得出了由许多细胞类型组成的基质血管部分（SVF），但脂肪细胞除外，脂肪细胞在处理过程中被耗尽。

总之，使用脂肪组织作为间充质干细胞来源的主要优点包括其丰度和易于细胞分离的方法，这与间充质干细胞作为抗炎和再生特性的治疗潜力有关。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
140 &度C 高温灭菌 CO2 培养箱	中国 RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD	C180
3-异丁基-1-甲基黄嘌	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	I7018
醋酸冰川	Sigma-Aldrich，美国密苏	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	A9186	BioReagent，适用于糖蛋白的检测。1% 乙酸溶液，pH 2.5
酒精 70%	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	65350-M	70% 水溶液
两性霉素B	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	PHR1662
抗小鼠抗CD29 FITC（克隆Ha2/5）	BD Biosciences，美国加利福尼亚州	555005	在细胞中的功能：粘附和活化、胚胎发生、白细胞、DC、血小板、肥大细胞、成纤维细胞和内皮细胞
抗体 抗小鼠抗CD34 PE（克隆RAM34）	BD Biosciences，美国加利福尼亚州	551387	细胞中的功能：细胞粘附因子。造血干细胞
抗体 抗小鼠抗CD45 APC（克隆30-F11）	BD Biosciences，美国加利福尼亚州	559864	在细胞中的功能：协助激活白细胞
抗体 抗小鼠抗CD71 FITC（克隆C2）	BD Biosciences，美国加利福尼亚州	553266	细胞中的功能：控制细胞增殖过程中的铁摄取。增殖细胞、网织红细胞和前体
抗体 抗小鼠抗 CD90 PerCP （克隆 OX-7）	BD Biosciences， San Diego， CA， USA	557266	在细胞中的功能：信号传导、粘附。T 淋巴细胞、NK、单核细胞、HSC、神经元、成纤维细胞
抗坏血酸	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	PHR1008
自动移液器	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	4700850N	Finnpipette F1 良好实验室移液 （GLP） 套件
烧杯	不适用		1 单位
血清白蛋白	Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯，美国	A7906
细胞培养板（6 孔）	默克，德国达姆施塔特	Z707759	07 单位无菌。TPP 组织培养板
细胞培养板（96 孔。圆形或 V 形底）	默克，达姆施塔特，德国	CLS353077	01 单位无菌。孔，96，组织培养 （TC） 处理的表面，圆底透明孔，无菌
软骨形成培养基	Stem Pro 软骨形成分化–Life Technologies	A1007101	TGF-β;2、TGF-&β;3、地塞米松、胰岛素、转铁蛋白、ITS、钠-l - 抗坏血酸、丙酮酸钠、抗坏血酸-2-磷酸
II型胶原酶	Life Technologies，美国加利福尼亚州	17101015
软木或聚苯乙烯泡沫塑料板覆盖铝	不适用		1
棉花	不适用		50克
地塞米松	Sigma-Aldrich，美国密苏里州	圣路易斯D4902
解剖剪刀	不适用		03 单位无菌
DPX 组织学封固剂	Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA	6522
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	D5523	含 1000 mg/L 葡萄糖和 L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，粉末，适用于细胞培养
曙红 B	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	861006
胎牛血清 （FBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	F4135
甲醛	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	47608
福尔马林	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	HT501128
庆大霉素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	G1397
苏木精	Sigma-Aldrich，美国密苏	H3136
皮下注射针 （0.3mm x 13mm）	不适用		5
吲哚美辛	Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国密苏里	I0200000
胰岛素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	I3536
异丙醇	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	563935	70% 的 H 2O
氯胺酮-D4 盐酸盐溶液	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	K-006 1.0	mg/mL，甲醇（作为游离碱），认证参考物质，Cerilliant®
Neubauer 室	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	BR718620	BRAND 计数室 BLAUBRAND Neubauer 图案。带夹子，双尺
Nichiryo 移液器吸头 （0.1–10 μL）	德国达姆施塔特默克	Z645540	体积范围 0.1–10 μL 形，大包装。无菌
Nichiryo 移液器吸头 （1–10 mL）	德国达姆施塔特默克	Z717401	体积范围 1–10 mL，通用型，散装。无菌
Nichiryo 移液器吸头 （200 μL）	默克，达姆施塔特，德国	Z645516	最大体积 200 μL，已毕业，ministack。无菌
油红 O 溶液	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	O1391	0.5% 异丙醇
石蜡	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	107.151	46–48，块状
青霉素/链霉素	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	P4333	溶液稳定，含 10,000 单位青霉素和 10 mg 链霉素/mL，0.1 &μ;m 过滤，BioReagent，适用于细胞培养
磷酸盐缓冲盐水溶液 1x （PBS）。	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P3813	粉末，pH 7.4，用于制备 1 L 溶液。平衡无菌
聚丙烯锥形管 （15 mL）	Falcon， Fisher Scientific	14-959-53A	无菌
聚丙烯锥形管 （50 mL）	Falcon， Fisher Scientific	14-432-22	2 单位
手术刀（可选）	不适用		1 单位
硝酸银	Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA	85228
硫代硫酸钠	Sigma-Aldrich， San Luis， Missouri， USA	72049
手术镊子 （15 cm）	不适用		3 单位 不育
瑞士雄性小鼠 （6–8 周）	Bioterium，圣克鲁斯州立大学	021/22
注射器 （1 mL）	不适用		1 单位
台盼蓝染料	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路	T8154	0.4%，液体，无菌过滤，适用于细胞培养
胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	T3924
甲苯噻嗪	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易	PHR3263
&β;-甘油磷酸二钠盐水合物	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	G9422	BioUltra，适用于细胞培养，适用于植物细胞培养，≥99%（滴定）