从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

摘要

本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。

摘要

生物体的间充质干细胞（MSCs）具有分化为体内多种成体细胞谱系的非凡能力，并以其免疫调节和抗炎特性而著称。这些干细胞的应用为再生生物学领域带来了福音，但与此同时，由于其伴随的多种细胞层面的不确定性，也给再生医学和治疗应用带来了挑战。这些不确定性可能源于干细胞来源的多样性以及其体外（in vitro）培养条件的差异，二者均导致了其功能上的异质性。

这需要采用相应的方法以获得纯化且均一的间充质干细胞群体 用于治疗应用。流式细胞术领域的进展使得利用多参数方法检测单细胞群体成为可能。本方案概述了一种识别和纯化单细胞群体的方法 干细胞来自 通过荧光辅助单细胞分选技术分离人脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）。通过同时检测表面标志物CD90-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD73-多甲藻叶绿素蛋白复合物（PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白（APC）和CD44-V450的表达，鉴定出 "明亮的，" 间充质干细胞的阳性表达细胞 使用多参数 流式细胞术。然而，从第7代开始至后续各代，这些阳性标志物的四重表达细胞比例显著下降。

采用单细胞分选模式对免疫表型亚群进行分选，分选条件仅包括两种阳性标记物和一种阴性标记物。该方法可确保分选后细胞群体的存活率，并维持分选后的细胞增殖能力。此类分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该策略可推广至其他单细胞体系，以优化分离条件并获取多种细胞表面标记物信息。

引言

间充质干细胞（MSCs）可被视为适用于细胞治疗的可扩展细胞来源，或可被认为是再生医学中的金标准体系。这些细胞可从体内多种不同组织来源中分离获得。¹根据来源组织的不同，每种MSC均表现出一定的模糊性 体外 行为²这一点在它们的形态学和功能特性中表现得十分明显³多项研究表明，间充质干细胞（MSCs）在尺寸方面存在克隆内变异，包括成体组织分化能力、基因组状态以及代谢和细胞结构。^2,4.

细胞的免疫表型分析一直是流式细胞术的常见应用，用于鉴定干细胞，而这是 国际社会所采用 细胞与基因治疗国际学会（ISCT）于2006年制定了一套最低标准，用于鉴定细胞是否为间充质干细胞（MSCs）。该标准指出，细胞需具备贴壁生长特性，并具有向三个谱系（成骨、成软骨和成脂肪）分化的潜能。 体外通过流式细胞术检测，≥95%的细胞群体必须表达CD105、CD73和CD90，且这些细胞必须不表达（≤2%阳性）CD34、CD45、CD11b、CD14和HLA-DR。⁵尽管间充质基质细胞（MSCs）可通过国际细胞治疗学会（ISCT）最低标准中定义的一组生....

方案

伦理批准与参与同意：人脱落乳牙牙髓样本的获取均在获得知情同意及斯里拉吉夫甘地牙科医学院与医院（SRGCDS）口腔颌面外科部门（班加罗尔）的全面伦理批准后进行，相关程序符合该医院伦理审查委员会所制定的标准。随后进行SHEDs的分离、培养、维持与应用 由Manipal再生医学研究所（MAHE - 班加罗尔）机构干细胞研究委员会（IC-SCR）批准，并符合其推荐的指导方针。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料和试剂的详细信息。

1. 试剂与缓冲液的配制

1. 用于细胞培养维持
   1. 使用未分化hESC的基础培养基、10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（Pen-strep）配制MSC细胞培养基（10%）（表2）。
   2. 使用未分化hESC的基础培养基、20% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% Pen-strep配制MSC细胞培养基（20%）（表2）。
   3. 使用未分化hESC的基础培养基、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）配制中和培养基（表2）。
2. 用于流式细胞术分析与分选
   1. 使用含2% FBS的磷酸盐缓冲液（PB....

结果

SHEDs 通过标准免疫荧光实验进行表征，结果显示波形蛋白（红色，III型中间丝）、肌动蛋白丝（Alexa Fluor 488 Phalloidin 探针标记）以及 DAPI 染色的细胞核图1A）。为了评估其增殖能力和集落形成能力，进行了标准的短期细胞生长实验。结果显示，从第2天到第8天增殖速率增加了14.3倍 图1B通过CFU-F实验测定SHEDs的克隆形成能力，结果如图所示。 图1C-E根据国际细胞治疗学会（ISCT）标准，多能间充质干细胞能够分化为三种中胚层来源的谱系。采用油红O进行细胞化学染色，以检测分化后的脂肪细胞中的脂滴。图1F）；采用von Kossa染色法对分化成骨细胞基质中钙盐沉积进行染色（图1G）；在分化后的软骨母细胞中，三维培养中的聚集蛋白聚糖经阿利新蓝.......

讨论

在组织工程与再生医学领域，与其他出生后来源相比，口腔组织来源的间充质干细胞（MSCs）因其伦理负担较小且具有显著的多向分化潜能而受到广泛关注²¹。在牙源性间充质干细胞中，来自阻生第三磨牙的牙髓干细胞（DPSCs）以及脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）因其在神经退行性疾病和创伤性疾病治疗中的潜力而受到最多关注²²。本文所述的实验方案有助于通过多参数方法对SHEDs进行表征，并进一步利用单细胞分选技术分离特定细胞亚群。然而，该方案的应用不仅限于口腔来源的间充质干细胞，也可用于对人体其他组织来源的间充质干细胞进行免疫表型分析与细胞分选²³。

在针对所研究的生物学问题成功实施本实验方案时，有几个关键步骤需要在此讨论。每个分选方案的关键在于检查两个重要组成部分：生物学对照和实验对照。首先，保持无菌的培养环境可确保在分选过程中所用样本不受污染。在分选前，单细胞悬液中的细胞活力应保证起始时有超过70%的活细胞群体，随后对健康的亚群进行分析和分选。单细胞悬液.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
阿尔新蓝染色液	HiMedia	CCK029-1KT
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）	Gibco by ThermoFisher	15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照（BSA）补偿微球（7.5 µm）套装	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop 微球	BD Biosciences	345249	用于在分选模块开启时设置激光延迟
BD FACS Aria Fusion 流式细胞仪	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS 包被液	BD Biosciences	342003	在 BD FACSAria Fusion 上进行分析和分选实验时均用作包被液
BD FACSDiva CS&T 研究用微球	BD Biosciences	655050	根据喷嘴尺寸用于仪器配置
BD Horizon V450 小鼠抗人 CD44 抗体	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 小鼠 IgG2b，κ 同型对照	BD Biosciences	560374	CD44-V450 同型对照
BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD105 抗体	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	555751	CD105-APC 同型对照
BD Pharmingen DAPI 溶液	BD Biosciences	564907	DAPI 储存液，浓度为 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD90 抗体	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	555748	CD90-FITC 同型对照
BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD45 抗体	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	555749	CD45-PE 同型对照
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 CD73 抗体	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠 IgG1，κ 同型对照	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 同型对照
BD Pharmingen 纯化小鼠抗波形蛋白抗体	BD Biosciences	550513
牛血清白蛋白	Hi-Media	TC548-5G
结晶紫	Nice chemical pvt ltd	C33809
杜氏磷酸盐缓冲液	Sigma-aldrich	D5652-50L	用于细胞培养和日常维护的 dPBS
乙醇	---	---	用于常规消毒
胎牛血清	Gibco by ThermoFisher	10270-106
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 标记	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	未分化人胚胎干细胞的基础培养基，用于配制培养液
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）	Gibco by ThermoFisher	25030-081
分子生物学用甲醇	Hi-Media	MB113
油红 O	HiMedia	CCK013-1KT
多聚甲醛	loba chemie	30525-89-4
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
鬼笔环肽（ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂）	Invitrogen	R37110
硝酸银	HiMedia	MB156-25G
五水硫代硫酸钠	Chemport	10102-17-7
Sphero 彩虹荧光微球，3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
染色缓冲液	在 MIRM 配制	----	使用含 2% FBS 的 PBS 配制
StemPro 脂肪生成分化基础培养基	Gibco by ThermoFisher	A10410-01	脂肪生成培养基的基础培养基
StemPro 脂肪生成补充剂	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	脂肪生成培养基的诱导液
StemPro 软骨生成补充剂	Gibco by ThermoFisher	A10064-01	软骨生成培养基的诱导液
StemPro 成骨生成补充剂	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	成骨生成培养基的诱导液
StemPro 成骨/软骨生成分化基础培养基	Gibco by ThermoFisher	A10069-01	成骨和软骨生成培养基的共同基础培养基
曲拉通 X-100	Hi-Media	MB031
台盼蓝	Gibco by life technologies	15250-061
胰蛋白酶-EDTA 溶液 1x	Hi-media	TCL049
吐温-20	MERCK	9005-64-5