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方法文章

从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术

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⸱

DOI：

10.3791/65723

⸱

2023年11月10日

 ,  ,  ,  , 
1Manipal Institute of Regenerative Medicine, Bengaluru, Manipal Academy of Higher Education, Manipal, 2HIV-AIDS Laboratory, Molecular Biology and Genetics Unit, Jawaharlal Nehru Centre for Advanced Scientific Research (JNCASR)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了采用单细胞分选方法对人源间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的应用。具体而言，当单细胞分选与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，可从异质性细胞群体中获得纯度达99%的免疫表型细胞。

摘要

生物体的间充质干细胞（MSCs）具有分化为体内多种成体细胞谱系的非凡能力，并以其免疫调节和抗炎特性而著称。这些干细胞的应用为再生生物学领域带来了福音，但与此同时，由于其伴随的多种细胞层面的不确定性，也给再生医学和治疗应用带来了挑战。这些不确定性可能源于干细胞来源的多样性以及其体外（in vitro）培养条件的差异，二者均导致了其功能上的异质性。

这需要采用相应的方法以获得纯化且均一的间充质干细胞群体 用于治疗应用。流式细胞术领域的进展使得利用多参数方法检测单细胞群体成为可能。本方案概述了一种识别和纯化单细胞群体的方法 干细胞来自 通过荧光辅助单细胞分选技术分离人脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）。通过同时检测表面标志物CD90-异硫氰酸荧光素（FITC）、CD73-多甲藻叶绿素蛋白复合物（PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白（APC）和CD44-V450的表达，鉴定出 "明亮的，" 间充质干细胞的阳性表达细胞 使用多参数 流式细胞术。然而，从第7代开始至后续各代，这些阳性标志物的四重表达细胞比例显著下降。

采用单细胞分选模式对免疫表型亚群进行分选，分选条件仅包括两种阳性标记物和一种阴性标记物。该方法可确保分选后细胞群体的存活率，并维持分选后的细胞增殖能力。此类分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该策略可推广至其他单细胞体系，以优化分离条件并获取多种细胞表面标记物信息。

引言

间充质干细胞（MSCs）可被视为适用于细胞治疗的可扩展细胞来源，或可被认为是再生医学中的金标准体系。这些细胞可从体内多种不同组织来源中分离获得。1根据来源组织的不同，每种MSC均表现出一定的模糊性 体外 行为2这一点在它们的形态学和功能特性中表现得十分明显3多项研究表明，间充质干细胞（MSCs）在尺寸方面存在克隆内变异，包括成体组织分化能力、基因组状态以及代谢和细胞结构。2,4.

细胞的免疫表型分析一直是流式细胞术的常见应用，用于鉴定干细胞，而这是 国际社会所采用 细胞与基因治疗国际学会（ISCT）于2006年制定了一套最低标准，用于鉴定细胞是否为间充质干细胞（MSCs）。该标准指出，细胞需具备贴壁生长特性，并具有向三个谱系（成骨、成软骨和成脂肪）分化的潜能。 体外通过流式细胞术检测，≥95%的细胞群体必须表达CD105、CD73和CD90，且这些细胞必须不表达（≤2%阳性）CD34、CD45、CD11b、CD14和HLA-DR。5尽管间充质基质细胞（MSCs）可通过国际细胞治疗学会（ISCT）最低标准中定义的一组生物标志物进行鉴定，但这些生物标志物无法用于评估其免疫特性，因此需要在上述标准之外建立更多指标，以更便于开展跨研究比较并量化克隆间的差异2.

尽管ISCT制定了相关指南，但大量关于间充质干细胞（MSCs）的研究表明，这类细胞群体中存在异质性，这种异质性可能由多种因素引起，主要源于MSC供体之间6、组织来源之间7、克隆群体内单个细胞之间8以及培养条件之间的普遍差异2,9,10。从多种组织来源中对这些原代细胞进行鉴定和纯化，以确保其质量和细胞命运，是其生产过程中的关键步骤。为了理解该群体中表现出的变异，需要一种有效的方法将细胞群体分解为可分别分离和收集的亚群11。单细胞水平的分析有助于克服细胞间变异带来的挑战，降低来自异质性群体的生物学噪声，并能够研究和鉴定稀有细胞12。

根据实验目的和选定的参数，可采用多种方法对目标细胞群体进行分选和富集。细胞分选技术包括群体分选和单细胞分选方法。群体分选可通过磁珠激活细胞分选（MACS）富集目标细胞群体13，组分分离14和洗脱15单细胞分选可通过荧光激活细胞分选技术（FACS）富集更均一的细胞群体11. 比较分析 这些方法各自的优缺点在下文中被重点阐述 表1.

表1：不同技术的比较分析： MACS、组分分离、离心淘析和FACS，重点说明各技术原理的差异以及选择某一技术相较于其他技术的优缺点。缩写：MACS = 磁珠激活细胞分选；FACS = 荧光激活细胞分选。请点击此处下载该表格。

自该技术问世以来，单细胞流式细胞术在异质性样本中特定细胞群体的计数16、检测和表征方面发挥了重要作用17。Hewitt 等人于2006年建立了自动细胞分选方法的基础，以增强分化后人胚胎干细胞（hESCs）同质群体的分离效率18。单细胞分选富集了GFP转导的hESCs群体，促进了基因修饰克隆的分离，为临床研究开辟了新的方向。为了提高分选效率，通常采用两种策略：一是调整分选后细胞收集所用的培养基，以维持分选后细胞的存活率和增殖能力19；二是对细胞分选算法或软件进行适当优化12。

随着技术的进步，商用流式细胞仪和细胞分选仪已能够帮助解决在无菌分选脆弱且稀有的细胞群体（尤其是不同来源的干细胞）过程中所遇到的挑战。 干细胞生物学家面临的主要挑战之一是在基因编辑研究所需的转染操作后，实现人多能干细胞的单克隆分离19。该问题通过将单个细胞分选至涂有小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）并添加补充物及商用小分子ROCK抑制剂的96孔板中得以解决。然而，借助索引分选（index sorting）技术可大幅优化细胞分离策略，该技术是分选算法的一种功能，可识别被分选单个细胞的免疫表型12。这种改进的单细胞分选模式不仅提高了干细胞分选效率（特别是针对稀有的造血干细胞群体），还能高效地将单细胞克隆与其后续功能分析实验相关联20。

本文重点介绍免疫表型分选的单细胞分选技术 人类干细胞 脱落乳牙（SHEDs）用于富集亚群，以研究其功能分化能力。通过联合使用两种间充质干细胞阳性标志物CD90和CD73，以及阴性造血标志物CD45，对间充质干细胞进行免疫表型分析，并鉴定出弱表达和无表达的细胞。根据其免疫表型特征，将亚群分为纯间充质干细胞、单阳性及双阴性群体。采用单细胞分选模式对这些亚群进行分选，以获得纯化且富集的细胞亚群，用于后续功能研究，以确定标志物表达差异是否为技术假象 体外 培养条件是否会影响其功能特性。那些并非均一表达的细胞 "阳性MSC标志物" 用于研究其功能特性。

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方案

伦理批准与参与同意：人脱落乳牙牙髓样本的获取均在获得知情同意及斯里拉吉夫甘地牙科医学院与医院（SRGCDS）口腔颌面外科部门（班加罗尔）的全面伦理批准后进行，相关程序符合该医院伦理审查委员会所制定的标准。随后进行SHEDs的分离、培养、维持与应用 由Manipal再生医学研究所（MAHE - 班加罗尔）机构干细胞研究委员会（IC-SCR）批准，并符合其推荐的指导方针。参见 材料表 有关本方案中使用的所有材料和试剂的详细信息。

1. 试剂与缓冲液的配制

  1. 用于细胞培养维持
    1. 使用未分化hESC的基础培养基、10%胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素-链霉素（Pen-strep）配制MSC细胞培养基（10%）（表2）。
    2. 使用未分化hESC的基础培养基、20% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% Pen-strep配制MSC细胞培养基（20%）（表2）。
    3. 使用未分化hESC的基础培养基、1% L-谷氨酰胺和1%抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）配制中和培养基（表2）。
  2. 用于流式细胞术分析与分选
    1. 使用含2% FBS的磷酸盐缓冲液（PBS）配制染色缓冲液。
    2. 将1 µL DAPI溶于1 mL PBS中，配制成4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）储存液（1 µg/mL）。
  3. 用于MSC的谱系特异性分化
    1. 根据表3中描述的成分配制成骨、成软骨和成脂分化培养基。实验期间将配制好的分装样品储存于4 °C。
    2. 使用未分化hESC的基础培养基、2% FBS、1% L-谷氨酰胺和1% Pen-strep配制无血清培养基（2%培养基）（表2）。
媒体类型培养基的用途50 mL 配方
FBS青霉素-链霉素L-谷氨酰胺未分化人胚胎干细胞基础培养基
10% 培养基间充质干细胞的培养与维持5 mL500 μL500 μL44 mL
20% 培养基集落形成单位-成纤维细胞（CFU-F）实验10 mL500 μL500 μL39 mL
血清饥饿（2%）培养基分化方案中对照孔的培养基1 mL500 μL500 μL48 mL
中和培养基胰蛋白酶消化后用于中和细胞悬液的培养基 -500 μL500 μL49 mL 

表2：用于培养维持和检测的细胞培养基。 缩写：MSC = 间充质干细胞；CFU-F = 成纤维细胞集落形成单位。

组分成骨诱导培养基软骨诱导培养基成脂诱导培养基
基础培养基90 mL90 mL90 mL
诱导培养基10 mL10 mL10 mL
总体积100 mL100 mL100 mL

表3：SHEDs三系分化所需的分化培养基。

2. SHED细胞的培养与维持

  1. 将细胞维持在10% MSC培养基中，每2天或根据需要更换培养基。
  2. 使用0.25%胰蛋白酶-EDTA对95%融合度的细胞进行消化。
  3. 消化后使用中和培养基对细胞进行中和。
  4. 在室温下以300 × g 离心6分钟，获得细胞沉淀。
  5. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10% MSC培养基中。
  6. 将细胞接种至新制备的含10% MSC培养基的细胞培养皿中，用于后续实验或传代培养。
    注意：SHEDs的最佳接种密度为在100 mm培养皿中接种0.2 × 106个细胞，或在T-75培养瓶中接种0.8 × 106个细胞，以分别在90–100%融合度时获得1.5 × 106个细胞和4 × 106个细胞。

3. 间充质干细胞的表征

  1. 短期细胞生长检测
    1. 接种 4 × 104 以每孔相同数量的细胞，每组三个复孔，接种于6孔板中，使用含10% MSC培养基的培养液。
    2. 将培养板在37°C、5% CO₂条件下孵育7天 37 °C，每2天更换一次培养基。
    3. 在第2、4和8天使用0.25%胰蛋白酶处理收集细胞，并用培养基洗涤。
    4. 将细胞在300 × g下离心 g 室温孵育6分钟，将沉淀重悬于1 mL培养基中。
    5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并通过台盼蓝排斥法测定细胞活力。
    6. 使用公式（计算增殖率1):
      figure-protocol-1    (1)
  2. 成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）实验
    1. 在100 mm培养皿中接种10,000个细胞，并在20% MSC培养基中培养。
    2. 将培养板在37°C、5% CO₂条件下孵育14天 37 °C，每3天更换一次培养基。
    3. 14天后，用PBS冲洗克隆，用甲醇中的结晶紫染料固定，再用PBS冲洗以去除残留染色。
    4. 计数并拍摄菌落图像。
      注意：计数菌落时 >50 个细胞。集落形成效率以集落形成单位数量计算。
  3. 免疫荧光检测
    1. 将MSCs接种于35 mm培养皿中，培养至细胞融合度达到80-90%。
    2. 吸去培养基，用 PBS 冲洗培养皿一次。
    3. 使用1 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定细胞，可在室温下孵育1小时，或在4℃过夜 4 °C.
    4. 固定后，在摇床上用PBST洗涤孔板，每次5分钟，共洗3次。
    5. 在PBST（含0.05% Tween 20的PBS溶液）中加入0.3% Triton X-100以透化细胞。室温下在摇床上孵育15分钟。
    6. 在摇床上用 PBST 洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    7. 加入3%牛血清白蛋白（BSA）进行封闭，在室温下于摇床中孵育1小时。
    8. 在摇床上用 PBST 洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    9. 添加 800 µL 使用1:500稀释的小鼠抗波形蛋白抗体，室温在摇床上孵育1小时，然后将板转移至 4 °C 过夜孵育。
    10. 次日，移除一抗，用 PBST 在摇床上清洗孔板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    11. 添加 800 µL 使用1:1,000稀释的山羊抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555标记，在室温下于摇床中孵育3小时。
    12. 在摇床上用 PBST 洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    13. 加入 Alexa Fluor 488 Phalloidin 探针 240 µL 在 1,000 µL PBS溶液 在摇床上室温孵育60分钟。
    14. 在摇床上用 PBST 洗涤孔板，每次 5 分钟，共洗 3 次。
    15. 添加 700 µL 滴加 DAPI 封片剂，然后在显微镜下观察细胞。
  4. 谱系特异性分化
    1. 二维培养后的分化
      1. 取两个48孔板，分别标记为成骨向和成脂向谱系。
      2. 每孔接种15,000个细胞，共四孔 每块培养板的孔中加入10% MSC培养基进行培养。
      3. 当细胞单层达到90%融合度时，将前两个孔标记为“对照组”，并更换为无血清培养基（2%培养基）。在标记为“实验组”的最后两个孔中，加入成脂或成骨两种谱系之一的分化培养基。将此日记为第0天。
      4. 每隔三天轻轻更换培养基，以防止脱落，并注意避免污染。
      5. 保持这些条件至第21天，然后进行染色实验。
    2. 3D 培养后的分化
      1. 取两个15 mL离心管，用于通过三维细胞球培养法进行软骨诱导分化。
      2. 转移 1 × 106 将细胞加入各管，300 × g 离心 × g 离心6分钟以形成沉淀。将其中一管标记为“对照组”，加入10% MSC培养基；另一管标记为“实验组”，加入软骨诱导分化培养基。将两管轻轻放入培养箱中，管盖松开旋紧。记为第0天。
      3. 每三天小心更换一次培养基，避免在换液过程中使细胞沉淀物脱落或解体。
      4. 保持这些条件至第21天，然后对细胞进行后续实验处理。
  5. 谱系特异性细胞化学染色
    1. 对于二维培养，使用已分化（实验组）和未分化（对照组）的MSC培养板（来自步骤3.4.1.5）进行染色，首先移除培养基，并用PBS洗涤两次。在室温下用4%多聚甲醛固定细胞30分钟，移除上清液后用PBS洗涤一次。按以下步骤对各谱系进行染色。
      1. 对于 脂肪细胞谱系，加入试剂盒中的通透化溶液，在室温下孵育5分钟。配制并加入1 mL油红O工作液，静置10分钟。去除染液，用蒸馏水洗涤五次。
      2. 对于 骨细胞谱系，向每个孔中加入5%新配制的硝酸银溶液（溶于蒸馏水），并将培养板置于紫外光下1小时。移除溶液后，加入2.5%硫代硫酸钠以去除未反应的银；作用5分钟。去除染色液，用蒸馏水洗涤两次，在显微镜下观察染色细胞。
    2. 对于三维培养，在步骤3.4.2.3的分化期结束后收集细胞沉淀，并将分化后的组织沉淀制备成冷冻切片。将载玻片置于室温下自然干燥后，再进行染色操作。
      1. 对于 软骨细胞谱系，按照染色试剂盒说明书加入足量洗涤液，去除洗涤液后加入固定液，孵育30分钟。用蒸馏水洗涤，加入染色液，孵育30分钟。用0.1 N盐酸洗涤三次，加入蒸馏水以中和酸性。在明场显微镜下观察染色后的细胞。

4. 免疫表型分析的细胞表面染色

注意：在步骤 4.2-4.5 中为获得最佳细胞数量，推荐使用的细胞培养板为 100 mm 培养皿或 T75 培养瓶。

  1. 流式细胞术实验的细胞准备
    1. 用胰蛋白酶消化并收集融合培养皿/培养瓶中的细胞，以 300 × g 离心 6 分钟，获得细胞沉淀。
    2. 将沉淀重悬于 1 mL 培养基中，使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥法测定活细胞数量。
    3. 计数后再次离心细胞悬液，并用 1 mL 染色缓冲液对沉淀进行两次洗涤。
    4. 弃去上清液，最后根据实验方案（见步骤 4.2 至 4.5）将沉淀重悬于适当体积的染色缓冲液中。
  2. 补偿对照的制备
    1. 取七支流式细胞术专用管，分别标记为未染色、DAPI、V450、FITC、PE、PerCP-Cy 5.5 和 APC。
    2. 将最终沉淀重悬于染色缓冲液中（见步骤 4.1），未染色管和 DAPI 管每管保持细胞密度为每 50 µL 含 0.5 × 106 个细胞。
    3. 按照 表 4 所述方法制备用于补偿调节的单染对照管。
    4. 制备后轻轻涡旋各管，并在避光条件下室温孵育 30 分钟。
    5. 孵育结束后，向每管加入 1 mL 染色缓冲液进行两次洗涤，每次短暂涡旋后于室温下以 200 g 离心 10 分钟。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中，置于一旁待上机检测。
    7. 对于 DAPI 管，先在 60 °C 水浴中孵育 5 分钟进行热激处理，随后置于冰上 15 分钟；向悬液中加入 5 µL DAPI，避光保存直至上机检测。
  3. 荧光减一（FMO）对照的制备
    1. 将最终沉淀重悬于染色缓冲液中（见步骤 4.1），每管保持细胞密度为每 50 µL 含 0.5 × 106 个细胞。
    2. 取五支流式细胞术专用管，分别标记为 CD44-V450 同型对照、CD90-FITC、CD45-PE、CD73-PerCP Cy5.5 同型对照和 CD105-APC 同型对照。
    3. 根据 表 5 配制细胞与抗体悬液。
    4. 轻轻涡旋各管，并在避光条件下室温孵育 30 分钟。
    5. 孵育结束后，向每管加入 1 mL 染色缓冲液进行两次洗涤，每次短暂涡旋后于室温下以 200 g 离心 10 分钟。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中，置于一旁待上机检测。
  4. 分析样品的制备
    1. 将最终沉淀重悬于染色缓冲液中（见步骤 4.1），每管保持细胞密度为每 50 µL 含 0.5 × 106 个细胞。
    2. 取两支流式细胞术专用管，分别标记为混合管 1 和 2。
    3. 根据 表 6 配制细胞与抗体悬液。
    4. 轻轻涡旋各管，并在避光条件下室温孵育 30 分钟。
    5. 孵育结束后，向每管加入 1 mL 染色缓冲液进行两次洗涤，每次短暂涡旋后于室温下以 200 g 离心 10 分钟。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中，置于一旁待上机检测。
  5. 单细胞分选样品的制备
    1. 取两支流式细胞术专用管，各加入 1 mL 胎牛血清（FBS），滚动试管使 FBS 在管内壁形成均匀涂层。在样品染色处理期间将试管孵育 1–2 小时。将这两支管标记为混合管 1 和 2。
    2. 将最终沉淀重悬于染色缓冲液中（见步骤 4.1），每管保持细胞密度为每 50 µL 含 2–3 × 106 个细胞。
    3. 根据 表 7 在混合管 1 和 2 中配制细胞与抗体悬液。
    4. 轻轻涡旋各管，并在避光条件下室温孵育 30 分钟。
    5. 孵育结束后，向每管加入 1 mL 染色缓冲液进行两次洗涤，每次短暂涡旋后于室温下以 200 g 离心 10 分钟。
    6. 弃去上清液，将沉淀重悬于 500 µL 染色缓冲液中并暂存。分选前 15 分钟加入 5 µL DAPI。
      注：请注意，分选实验建议每管使用更高的细胞密度。
试管类型阳性补偿微珠*阴性补偿微珠*细胞 添加的抗体 
FITC 试管1 滴 1 滴–抗人 CD90-FITC (2 µL)
V450 试管1 滴1 滴–抗人 CD44-V450 (2 µL)
PerCP-Cy 5.5 试管1 滴1 滴–抗人 CD73-PerCP Cy 5.5 (2 µL)
PE 试管1 滴1 滴–抗人 CD45-PE (2 µL)
APC 试管1 滴1 滴–抗人 CD105-APC (2 µL)
DAPI 试管––50 µL–
未染色试管––50 µL–
*1 滴 = 60 µL 微珠悬液 

表4：补偿对照样本。 缩写：Comp = 补偿；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚；FITC = 异硫氰酸荧光素；APC = 别藻蓝蛋白；PE = 藻红蛋白；PerCP = 多甲藻叶绿素蛋白。

试管类型 针对阳性标记物的抗体（2 µL）针对阴性标记物的抗体 （2 µL）添加的同型抗体 （2 µL）抗体总体积 添加的细胞悬液体积 添加的染色缓冲液体积 
CD90-FITC FMO 试管- 抗人 CD44-V450  抗人 CD45-PEFITC IgG1 同型抗体10 µL 50 µL 40 µL 
- 抗人 CD73 PerCP Cy 5.5
- 抗人 CD105-APC
CD73-PerCP Cy5.5 FMO 试管- 抗人 CD44-V450   抗人 CD45-PE PerCP Cy 5.5 IgG1 同型抗体10 µL50 µL 40 µL 
- 抗人 CD90-FITC   
- 抗人 CD105-APC
CD44-V450 FMO 试管- 抗人 CD90-FITC   抗人 CD45-PE V450 IgG1 同型抗体 10 µL50 µL 40 µL 
- 抗人 CD73-PerCP Cy 5.5 
- 抗人 CD105-APC
CD105-APC FMO 试管- 抗人 CD44-V450  抗人 CD45-PE APC IgG1 同型抗体10 µL50 µL40 µL 
- 抗人 CD90-FITC 
- 抗人 CD73-PerCP Cy 5.5 
CD45-PE FMO 试管- 抗人 CD44-V450  -PE IgG1 同型抗体 10 µL50 µL 40 µL 
- 抗人 CD90-FITC 
- 抗人 CD73-PerCP Cy 5.5 
- 抗人 CD105-APC

表5：FMO对照样本。 缩写：FMO = 荧光减一；FITC = 异硫氰酸荧光素；APC = 别藻蓝蛋白；PE = 藻红蛋白；PerCP = 多甲藻叶绿素蛋白。

试管类型 针对阳性标志物的抗体（2 µL）针对阴性标志物的抗体（2 µL）抗体总体积 加入的细胞悬液体积 加入的染色缓冲液体积 
混合管 1 - 抗人 CD44-V450  抗人 CD45-PE 10 µL 50 µL  40 µL 
- 抗人 CD90-FITC  
- 抗人 CD73-PerCP Cy5.5 
- 抗人 CD105-APC
混合管 2- 抗人 CD44-V450  抗人 CD45-PE 10 µL50 µL 40 µL
- 抗人 CD90-FITC  
- 抗人 CD73-PerCP Cy5.5
- 抗人 CD105-APC

表6：SHEDs多色免疫表型分析用样本管。 缩写：SHEDs = 人脱落乳牙来源干细胞；PE = 藻红蛋白。

试管类型 针对阳性标志物的抗体（3 µL）针对阴性标志物的抗体（3 µL）抗体总体积 加入的细胞悬液体积 加入的染色缓冲液体积 
混合管1 - 抗人CD90-FITC  抗人CD45-PE 9 µL 50 µL  41 µL 
- 抗人CD73-PerCP Cy5.5 
混合管2- 抗人CD90-FITC  抗人CD45-PE 9 µL50 µL 41 µL
- 抗人CD73-PerCP Cy5.5 

表7：单细胞分选反应管。 缩写：FITC = 异硫氰酸荧光素；PE = 藻红蛋白；PerCP = 多甲藻素-叶绿素-蛋白。

5. 单细胞分选

  1. 细胞分选仪的准备
    1. 在分选仪中安装一个 100 µm 的喷嘴。
      注意：合适的喷嘴直径应至少为待分选颗粒直径的五倍。根据样本类型和实验的敏感性选择用于分选的鞘液；本实验中使用了专用的鞘液。
    2. 执行仪器每日质量检查（QC），并设置分选仪以进行实验。有关仪器设置的详细指南，请参考仪器使用手册。
  2. 设置补偿矩阵
    1. 使用步骤 4.2 中的单染补偿管设置补偿矩阵。
    2. 在专用软件中，从工具栏选择 实验 ，然后点击 补偿设置。打开 创建补偿对照。
    3. 检查标记物并确认。软件会自动在名为“Compensation”的新样本下添加以标记物命名的新管作为补偿对照。
    4. 选择未染色管并运行，记录 5,000 个事件。将门控圈定到细胞群，并将其应用到所有补偿对照中。此步骤用于设定每个荧光参数的电压和阴性门控。
    5. 同样，依次单独加载单染补偿管，记录并保存数据。选择划定目标细胞群的门控，并将其应用到所有补偿对照中。此步骤用于设定每个荧光参数的阳性门控。
    6. 从工具栏选择 实验 ，然后点击 计算补偿值 | 链接并保存。
      注意：一旦软件生成了自动补偿矩阵，则在混合管中任何通道的荧光染料电压参数均不可更改。
  3. 数据采集
    1. 对步骤 4.3 和 4.4 中的每根管记录 10,000 个细胞，以收集用于分析细胞免疫表型的数据。
  4. 收集装置的准备
    1. 根据分选后细胞群体的用途，选择 6 孔、24 孔、48 孔或 96 孔板。
    2. 用 200–500 µL 胎牛血清（FBS）包被孔板，并静置 2 小时。
    3. 2 小时后，移除残留的 FBS，并加入 200–500 µL 的 10% 间充质干细胞培养基。
  5. 单细胞分选模式下的细胞分选
    1. 运行混合管 1（来自步骤 4.5），记录 10,000 个事件 ，使用适当的门控策略对目标分选细胞群设置门控。
    2. 装载收集板，设定目标细胞数为 2,500 至 5,000 个细胞/孔，并选择 单细胞分选纯度掩模。
    3. 将分选后的细胞群体收集至收集装置中，并在分选实验结束前保持置于冰上。
    4. 完成后，将板转移至 5% CO2 培养箱中，以维持 37 °C 的培养条件。
      注意：数据采集后，原始数据文件以 .fcs 文件格式（v.3.0 及以上版本）导出。每次实验生成的分选报告记录了每个指定孔中分选的事件/细胞数量，并标明了被中止的冲突次数。

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结果

SHEDs 通过标准免疫荧光实验进行表征，结果显示波形蛋白（红色，III型中间丝）、肌动蛋白丝（Alexa Fluor 488 Phalloidin 探针标记）以及 DAPI 染色的细胞核图1A）。为了评估其增殖能力和集落形成能力，进行了标准的短期细胞生长实验。结果显示，从第2天到第8天增殖速率增加了14.3倍 图1B通过CFU-F实验测定SHEDs的克隆形成能力，结果如图所示。 图1C-E根据国际细胞治疗学会（ISCT）标准，多能间充质干细胞能够分化为三种中胚层来源的谱系。采用油红O进行细胞化学染色，以检测分化后的脂肪细胞中的脂滴。图1F）；采用von Kossa染色法对分化成骨细胞基质中钙盐沉积进行染色（图1G）；在分化后的软骨母细胞中，三维培养中的聚集蛋白聚糖经阿利新蓝...

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讨论

在组织工程与再生医学领域，与其他出生后来源相比，口腔组织来源的间充质干细胞（MSCs）因其伦理负担较小且具有显著的多向分化潜能而受到广泛关注21。在牙源性间充质干细胞中，来自阻生第三磨牙的牙髓干细胞（DPSCs）以及脱落乳牙牙髓干细胞（SHEDs）因其在神经退行性疾病和创伤性疾病治疗中的潜力而受到最多关注22。本文所述的实验方案有助于通过多参数方法对SHEDs进行表征，并进一步利用单细胞分选技术分离特定细胞亚群。然而，该方案的应用不仅限于口腔来源的间充质干细胞，也可用于对人体其他组织来源的间充质干细胞进行免疫表型分析与细胞分选23。

在针对所研究的生物学问题成功实施本实验方案时，有几个关键步骤需要在此讨论。每个分选方案的关键在于检查两个重要组成部分：生物学对照和实验对照。首先，保持无菌的培养环境可确保在分选过程中所用样本不受污染。在分选前，单细胞悬液中的细胞活力应保证起始时有超过70%的活细胞群体，随后对健康的亚群进行分析和分选。单细胞悬液...

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披露

作者声明，本文发表不存在利益冲突。

致谢

我们感谢印度班加罗尔贾瓦哈拉尔·尼赫鲁高级科学研究中心流式细胞仪中心设施提供的流式细胞术核心设施支持。分化细胞团块培养物的冷冻切片工作在印度班加罗尔Neuberg Anand参考实验室完成。本研究得到了印度马尼帕尔高等教育学院（MAHE）为UC提供的院内经费支持。AG感谢MAHE提供的T. M. A. Pai博士奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
阿尔新蓝染色液HiMediaCCK029-1KT
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液） Gibco by ThermoFisher15240062
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig，κ/阴性对照（BSA）补偿微球（7.5 µm）套装BD Biosciences560497
BD FACS Accudrop 微球 BD Biosciences345249用于在分选模块开启时设置激光延迟
BD FACS Aria Fusion 流式细胞仪BD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4BD Biosciences---
BD FACS 包被液BD Biosciences342003在 BD FACSAria Fusion 上进行分析和分选实验时均用作包被液
BD FACSDiva CS&T 研究用微球BD Biosciences655050根据喷嘴尺寸用于仪器配置
BD Horizon V450 小鼠抗人 CD44 抗体BD Biosciences561292
BD Horizon V450 小鼠 IgG2b，κ 同型对照BD Biosciences560374CD44-V450 同型对照
BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD105 抗体BD Biosciences562408
BD Pharmingen APC 小鼠 IgG1，κ 同型对照BD Biosciences555751CD105-APC 同型对照
BD Pharmingen DAPI 溶液BD Biosciences564907DAPI 储存液，浓度为 1 mg/mL
BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD90 抗体BD Biosciences555595
BD Pharmingen FITC 小鼠 IgG1，κ 同型对照BD Biosciences555748CD90-FITC 同型对照
BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD45 抗体BD Biosciences555483
BD Pharmingen PE 小鼠 IgG1，κ 同型对照BD Biosciences555749CD45-PE 同型对照
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 CD73 抗体BD Biosciences561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠 IgG1，κ 同型对照BD Biosciences550795CD73-PerCP-Cy 5.5 同型对照
BD Pharmingen 纯化小鼠抗波形蛋白抗体BD Biosciences550513
牛血清白蛋白Hi-Media TC548-5G
结晶紫Nice chemical pvt ltd C33809
杜氏磷酸盐缓冲液Sigma-aldrich  D5652-50L用于细胞培养和日常维护的 dPBS 
乙醇 ------用于常规消毒
胎牛血清 Gibco by ThermoFisher 10270-106
山羊抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555 标记ThermoFisher Scientific A-21422
KO-DMEMGibco by ThermoFisher 10829018未分化人胚胎干细胞的基础培养基，用于配制培养液
L-谷氨酰胺 200 mM（100倍浓缩液）Gibco by ThermoFisher25030-081
分子生物学用甲醇 Hi-Media MB113
油红 OHiMedia CCK013-1KT
多聚甲醛 loba chemie30525-89-4
青霉素-链霉素（100倍浓缩液）Gibco by ThermoFisher 15140- 122
鬼笔环肽（ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂）Invitrogen R37110
硝酸银HiMedia MB156-25G
五水硫代硫酸钠Chemport10102-17-7
Sphero 彩虹荧光微球，3.0 - 3.4 µmBD Biosciences556291
染色缓冲液 在 MIRM 配制 ----使用含 2% FBS 的 PBS 配制 
StemPro 脂肪生成分化基础培养基 Gibco by ThermoFisher A10410-01脂肪生成培养基的基础培养基
StemPro 脂肪生成补充剂Gibco by ThermoFisher A10065-01脂肪生成培养基的诱导液
StemPro 软骨生成补充剂Gibco by ThermoFisher A10064-01软骨生成培养基的诱导液
StemPro 成骨生成补充剂Gibco by ThermoFisher A10066-01成骨生成培养基的诱导液
StemPro 成骨/软骨生成分化基础培养基 Gibco by ThermoFisher A10069-01成骨和软骨生成培养基的共同基础培养基
曲拉通 X-100Hi-Media MB031
台盼蓝 Gibco by life technologies 15250-061
胰蛋白酶-EDTA 溶液 1xHi-media TCL049
吐温-20 MERCK 9005-64-5

参考文献

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从人脱落乳牙中分选免疫表型鉴定的间充质干细胞的单细胞分离技术
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