人脱落乳牙免疫表型间充质干细胞的单细胞分选

Summary

该协议描述了使用单细胞分选方法对人间充质干细胞进行荧光激活细胞分选的使用。具体而言，当与基于多参数流式细胞术的方法相结合时，使用单细胞分选可以实现来自异质群体的免疫表型细胞的 99% 纯度。

Abstract

生物体的间充质干细胞 （MSC） 具有非凡的能力，可以在体内分化成多种成体细胞谱系，并以其免疫调节和抗炎特性而闻名。这些干细胞的使用对再生生物学领域来说是一个福音，但同时也是再生医学和治疗学的祸根，因为与它们相关的多种细胞模糊性。这些模糊性可能源于这些干细胞来源的多样性和它们的 体外 生长条件，这两者都反映了它们的功能异质性。

这就需要为治疗应用提供纯化、均质的间充质干细胞群体的方法。流式细胞术领域的进步使得使用多参数方法检测单细胞群成为可能。该协议概述了一种通过荧光辅助单细胞分选从人脱落乳牙（SHED）中鉴定和纯化干细胞的方法。同时表达表面标志物，即 CD90-异硫氰酸荧光素 （FITC）、CD73-peridinin-叶绿素蛋白 （PerCP-Cy5.5）、CD105-别藻蓝蛋白 （APC） 和 CD44-V450，使用多参数流式细胞术鉴定了 MSC 的"明亮"阳性表达基因。然而，从第 7 次传代到后来的传代，观察到这些阳性标志物的四重表达者的百分比显着下降。

使用单细胞分型模式对免疫表型亚群进行分选，其中只有两个阳性标记物和一个阴性标记物构成纳入标准。该方法确保了分选群体的细胞活力，并在分选后保持细胞增殖。这种分选的下游应用可用于评估门控亚群的谱系特异性分化。该方法可以应用于其他单细胞系统，以改善分离条件并获取多个细胞表面标记物信息。

Introduction

间充质干细胞（MSCs）可以被视为适用于细胞疗法的可扩展细胞来源，可以被认为是再生医学的金标准系统。这些细胞可以从体内具有不同组织来源的各种来源中分离出来¹.根据其来源组织，每种类型的间充质干细胞都表现出模棱两可的体外^行为2。这在它们的形态和功能特性中得到了很好的观察³.多项研究表明，间充质干细胞的克隆内变异，包括成体组织分化、基因组状态以及代谢和细胞结构 ^2,4。

细胞免疫表型分析一直是流式细胞术鉴定干细胞的常见应用，国际细胞和基因治疗学会 （ISCT） 于 2006 年利用它来规定将细胞识别为 MSC 的最低标准列表。它指出，除了可塑性粘附和在体外分化为三个谱系（成骨性、成软骨性和产脂性）的能力外，≥95% 的细胞群必须表达 CD105、CD73、CD90，并且这些细胞必须缺乏 CD34、CD45、CD11b、CD14 和 HLA-DR 的表达（≤2% 阳性），如流式细胞术测量的那样⁵.尽管间充质干细胞是在ISCT的最低标准下由一组生物标志物定义的，但它们的免疫特性无法与这些生物标志物进行基准测试，并且需要超越这些标准，以使交叉研究比较和克隆变异更容易量化^2。

尽管 ISCT 制定了指南，但对 MSC 的广泛研究表明，该群体中存在异质性，这可能是由于多种因素造成的，主要是由于 MSC 供体⁶、组织来源⁷、克隆群体中的单个细胞⁸ 和培养条件^2,9 之间出现的异质性无处不在^，10.从各种组织来源中表征和纯化这些原代细胞，以确保质量和细胞命运是其生产的关键步骤。需要了解种群中显示的变异，需要一种有效的方法将其分解为可以单独划分和收集的亚种群¹¹。单细胞水平分析有助于克服细胞间变异的挑战，减少异质性群体产生的生物噪声，并提供研究和表征稀有细胞的能力¹²。

根据目的和选择的参数，可以采用几种方法来对选定的种群进行排序和富集。细胞分选技术可以包括批量分选和单细胞分选方法。批量分选可以通过磁激活细胞分选 （MACS）13、分馏 14 和洗脱¹⁵ 富集靶细胞群，而单细胞分选可以通过荧光激活细胞分选 （FACS）¹¹ 富集更均匀的细胞群。表1重点介绍了每种方法及其优缺点的比较分析。

表1:不同技术的比较分析:MACS、分馏、洗脱和FACS，突出了其原理的差异以及选择特定技术优于另一种技术的优缺点。 缩写:MACS = 磁活化细胞分选;FACS = 荧光激活的细胞分选。 请按此下载此表格。

自该技术问世以来，单细胞流式细胞术在异质样品¹⁷中特定细胞群的计数¹⁶、检测和表征中发挥了重要作用。Hewitt 等人于 2006 年奠定了自动细胞分选方法的基础，以增强分化人胚胎干细胞 （hESC） 的均质池的分离¹⁸。单细胞分选富集了GFP转导的hESCs群体，促进了转基因克隆的分离，为临床研究开辟了新的维度。为了提高分拣效率，一般采取两种方法;要么修改分选群体的收集培养基以维持分选后细胞的活力和增殖¹⁹，要么适当修改细胞分选算法/软件¹²。

随着技术的进步，商用流式细胞仪和细胞分选仪已经能够帮助解决在无菌分选脆弱和稀有细胞群（尤其是不同来源的干细胞）时遇到的挑战。干细胞生物学家面临的主要挑战之一是按照基因编辑研究所需的转染方案克隆分离人类多能干细胞¹⁹。通过将单细胞分选到涂有小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 以及补充剂和商业小分子 ROCK 抑制剂的 96 孔板中来解决此问题。然而，细胞分离策略可以通过使用索引分选来在很大程度上改进，索引分选是分选算法的一个特征，用于识别分选的单个细胞的免疫表型¹²。这种改进的单细胞分选方式不仅有助于提高干细胞的分选效率，特别是在罕见的造血干细胞群方面，而且还有效地将单细胞克隆与其下游功能测定联系起来²⁰。

本文重点研究对人脱落乳牙（SHEDs）的免疫表型干细胞进行单细胞分选，以富集亚群，研究其功能分化能力。使用两种 MSC 阳性标志物 CD90 和 CD73 以及阴性造血标志物 CD45 的组合，对 MSC 进行免疫表型分析，并鉴定出暗表达子和无效表达子。根据其免疫表型，将亚群鉴定为纯间充质干细胞、单阳性和双阴性群体。使用单细胞分选模式对它们进行分选，以获得纯度和富集的亚群，用于进一步的功能研究，以确定标记物的差异表达是否是 体外 培养条件的产物，或者它是否对功能特性也有任何影响。对不是"阳性MSC标志物"的均质表达者的细胞进行分类，以研究其功能特性。

Protocol

伦理批准和参与同意:根据医院伦理审查委员会制定的标准，在获得班加罗尔斯里拉吉夫甘地牙科学院和医院 （SRGCDS） 口腔颌面科的知情同意和完全伦理批准后，收到了人类脱落的乳牙髓样本SRGCDS。之后，SHED 的分离、培养、维护和应用得到了班加罗尔马尼帕尔再生医学研究所干细胞研究机构委员会 （IC-SCR） 的批准并符合其推荐的指南。有关本协议中使用的所有材料和试剂的详细信息，请参阅 材料表 。

1. 试剂和缓冲液的制备

1. 用于培养维持
   1. 使用未分化hESC的基础培养基，10%胎牛血清（FBS），1%L-谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素（Pen-strep）制备MSC细胞培养基（10%）（表2）。

6. 
   

1. 6. 
      
2. 4. 
      

5. 6. 
      

1. 1. 
      
2. 6. 
      
5. 4. 
      

Results

SHED通过标准免疫荧光测定法表征波形蛋白（红色，III型中间丝），肌动蛋白丝（Alexa fluor 488鬼笔环肽探针）和用DAPI染色的细胞核的表达（图1A）。为了估计它们的增殖和集落形成能力，进行了标准的短期细胞生长测定。从第2天到第8天，增殖速率增加了14.3倍，如图1B所示。SHED的克隆发生特性是通过图1C-E所示的CFU-F测定法确定的。根据 ISCT 标准，多能间充质干细胞能够分化为三个中胚层来源的谱系。用油红O进行细胞化学染色检测分化脂肪细胞中的油滴（图1F）;von Kossa染色用于对分化成骨细胞基质中发现的钙沉积物进行染色（图1G）;在分化的软骨母细胞中，将 3D 培养物中的聚集聚糖染色为阿尔新蓝（图 1H<...

Discussion

在组织工程和再生医学领域，在出生后来源中，口腔组织来源的间充质干细胞因其最小的伦理义务和显着的多谱系分化潜力而引起了人们的极大兴趣²¹。来自受影响的第三磨牙和 SHED 的牙髓干细胞 （DPSC） 因其在神经退行性疾病和创伤性疾病中的治疗潜力而在牙科间充质干细胞中获得了最多的关注²².本手稿中描述的方案有助于使用多参数方法表征 SHED，并使用单细胞分选方法进一步对感兴趣的群体进行排序。然而，该方案的应用不仅限于口服间充质干细胞，还可用于免疫表型分型和从人体其他来源组织中分选^MSCs23。

需要在这里讨论该协议中的几个关键步骤，以便成功实施所解决的生物学问题。每个分选方案的关键是检查两个重要组成部分:生物对照和实验对照。首先，清洁的培养维护可确保所使用的样品在分选时不会受到损害。单细胞悬液预分选中的细胞活力应确保从70%以上的活细胞群开始，然后对健康亚群进行分析和分选。单细胞悬液中使用的染色缓冲液应含有 2% FBS，实验最好在室温下进行。...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
阿尔新蓝染色	HiMedia	CCK029-1KT
抗生素 - 抗真菌剂 （100x）	ThermoFisher 的 Gibco	15240062
BD CompBead Plus 抗小鼠 Ig，κ/阴性对照 （BSA） 补偿 Plus （7.5 µm） 颗粒组	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop 珠子	BD Biosciences	345249	用于设置分选模块打开时的激光延迟。
BD FACS Aria Fusion流式细胞仪	BD Biosciences---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS鞘液	BD Biosciences	342003	用作BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&中分析和分选实验的鞘液T Research Beads	BD Biosciences	655050	用于仪器配置，具体取决于喷嘴尺寸。
BD Horizon V450 小鼠抗人 CD44BD	Biosciences	561292
BD Horizon V450 小鼠 IgG2b，κ同种型对照	BD Biosciences 560374		CD44-V450 同种型
BD Pharmingen APC 小鼠抗人 CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC 小鼠 IgG1，κ同种型对照	BD Biosciences 555751		CD105-APC 同种型
BD Pharmingen DAPI 解决方案	BD Biosciences	564907	1 mg/mL
BD Pharmingen FITC 小鼠抗人 CD90	BD Biosciences 555595
BD Pharmingen FITC 小鼠 IgG1，κ同种型对照	BD Biosciences 555748		CD90-FITC 同种型
BD Pharmingen PE 小鼠抗人 CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE 小鼠 IgG1， κ同种型对照	BD Biosciences	555749	CD45-PE 同种型
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠抗人 CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 小鼠 IgG1， κ同种型对照	BD Biosciences 550795		CD73-PerCP-Cy 5.5 同种型
BD Pharmingen 纯化小鼠抗波形蛋白	BD Biosciences 550513
牛血清白蛋白	Hi-Media	TC548-5G
晶紫	尼斯化工有限公司	C33809
Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBS 用于培养工作和维护。
乙醇	---	---	用于一般的灭菌。
胎牛血清	ThermoFisher 的 Gibco	10270-106
山羊抗小鼠 IgG （H+L） 交叉吸附二抗，Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	ThermoFisher 的 A-21422
KO-DMEM	Gibco	10829018	用于未分化 hESC 的基础培养基，用于制备
25030-081		L-谷氨酰胺 200 mM （100x）	Gibco
，用于分子生物学	Hi-Media	MB113
油红 O	HiMedia	CCK013-1KT
多聚甲醛	ThermoFisher的Loba Chemie	30525-89-4
青霉素链霉素（100x）	Gibco；	15140- 122
鬼笔环肽 （ActinGreen 488 ReadyProbes 试剂）	Invitrogen	R37110
硝酸银	HiMedia	MB156-25G
硫代硫酸钠五水合	Chemport	10102-17-7
球形彩虹荧光颗粒，3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences 556291
染色缓冲液	在 MIRM 中制备	----	它是在 PBS 中使用 2% FBS 制备的
StemPro 脂肪生成分化基础培养基	ThermoFisher 的 Gibco	A10410-01	用于脂肪生成培养基的基础培养基
ThermoFisher 的 StemPro 脂肪生成添加剂	Gibco	A10065-01	脂肪生成培养基的诱导培养基
StemPro 软骨生成添加剂	Gibco（由 ThermoFisher 提供）	A10064-01	软骨形成培养基的诱导培养基
StemPro 成骨补充剂	Gibco（由 ThermoFisher 提供）	A10066-01	骨培养基诱导培养基
StemPro 成骨/软骨生成分化基础培养基	ThermoFisher 的 Gibco	A10069-01	用于骨源和软骨源介质的基础培养基
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
台盼蓝	Life Technologies 的 Gibco	15250-061
胰蛋白酶 - EDTA 溶液 1x	Hi-media	TCL049
吐温-20	默克	9005-64-5