人外周血单个核细胞的冷冻保存与生物能量学评估

摘要

分离的外周血单个核细胞可用于免疫功能和免疫相关疾病、代谢性疾病或线粒体功能的研究分析。本文中，我们描述了一种从全血中制备外周血单个核细胞（PBMCs）并进行后续冷冻保存的标准方法。冷冻保存使得实验在时间和空间上具有独立性。

摘要

真核细胞的生理功能主要依赖于线粒体提供的能量。线粒体功能障碍与代谢性疾病及衰老相关。氧化磷酸化在此过程中起决定性作用，对维持细胞能量稳态至关重要。外周血单个核细胞（PBMCs）已被确定为一种微创样本，可用于检测线粒体功能，并已被证明能够反映疾病状态。然而，在人体样本中，线粒体生物能量功能的测定可能受到多种因素的限制，包括采样量、采样时间（通常跨越数天）以及采样地点。对采集的样本进行冷冻保存可确保样本收集和检测的一致性。应注意确保冷冻保存细胞与新鲜制备细胞之间所测参数具有可比性。本文描述了从人血液样本中分离并冷冻保存PBMCs以分析其线粒体生物能量功能的方法。按照本方案冷冻保存的PBMCs在细胞数量和活力、三磷酸腺苷（ATP）水平以及呼吸链活性测定方面，与新鲜收获的细胞相比仅有轻微差异。本方法仅需8–24 mL人血液，使得在多中心临床研究中采集样本并在现场测定其生物能量学成为可能。

引言

人外周血单个核细胞（PBMCs）在多个科学领域中具有广泛的应用，包括免疫学和生物能量学相关问题的研究，例如与衰老过程或退行性疾病相关的研究^1,2。PBMCs在组成上具有异质性，主要包括淋巴细胞（B细胞、T细胞和NK细胞）、单核细胞以及树突状细胞。这些细胞在不同个体之间，甚至同一个体内部有时会表现出显著差异，因此需要标准化的操作流程来处理这些细胞。细胞活性和分离纯度等重要参数是其操作的基本要求，同时还会受到采样时间、褪黑激素水平、受试者是否空腹等环境因素的影响^3,4。

基于对PBMCs生物能量学的研究，本文介绍了一种适用于其他方法的PBMCs分离、冷冻保存和培养技术。尽管肌肉活检被认为是线粒体能量代谢的金标准⁵，但血液细胞的检测是一种快速且微创性较小的操作。此外，越来越多的研究表明，衰老和阿尔茨海默病（AD）中线粒体功能的变化不仅发生在脑组织中，也出现在外周组织中^6,7,8,9,10。该方法还可用于研究其他疾病和状态，包括糖尿病和肥胖^11,12,13。多发性硬化症患者的基因表达模式可借此分析，也可广泛用于免疫功能及其影响因素的研究^14,15,16。

外周血单个核细胞（PBMCs）通常依赖氧化磷酸化（OXPHOS）产生三磷酸腺苷（ATP）^17,18。因此，PBMCs 作为替代模型具有广泛的应用前景。在以往的研究中，PBMCs 的能量代谢已被用于研究器官功能障碍，例如早期心力衰竭¹⁹、脓毒性休克²⁰，以及线粒体功能的性别相关差异⁴。建立一种通用的 PBMCs 冷冻保存、分离与培养方法，将有助于提高不同研究机构所获得结果之间的可比性。目前各步骤的实验方案存在较大差异^21,22，本方法的目标是为 PBMCs 的生物能量学测定提供操作指南。

本文介绍了一种用于测量外周血单个核细胞（PBMCs）生物能量参数的方法。我们阐述了从人血液中分离、冷冻保存以及检测PBMCs生物能量学特性的实验方法。该方法可用于确定患者的生物能量参数，并在临床背景下对其进行评估。要实施这些检测，研究人员需要能够获得可采集新鲜血液样本的患者群体。

方案

本手稿中所述的血液采集、分离与分析的所有方案均已通过德国吉森大学机构审查委员会的审核与批准。已获得患者同意将其样本用于本研究。分离与细胞培养的所有步骤均在生物安全柜内进行。

1. 静脉穿刺

1. 准备所有采血所需设备，包括消毒喷雾剂、无菌棉签、带80 mm试管和多通接头的采血套管、止血带/血压袖带、9 mL含锂肝素的Monovette采血管。
   注：EDTA作为抗凝剂同样有效。
2. 从最合适的上臂静脉采血，通常为肘正中静脉或头静脉。
3. 使用止血带/血压袖带施加轻度压力，约为80 mm/Hg。
4. 用含酒精的消毒喷雾剂对手套和穿刺部位进行消毒，并让消毒后的穿刺部位自然风干。
5. 由于血压袖带的压力，静脉会更加突出。以15°–20°的角度将针头（套管外径21G / 0.8 mm，长度19 mm）插入静脉，尽量避免造成创伤并减少探查。
6. 使用合适的采血系统采集血液，共采集4管，每管9 mL血液（单个实验人员难以正确处理超过7–8管的血液样本）。
7. 采血完成后，将采血管置于避光环境中静置5分钟，以确保抗凝剂均匀作用。

2. PBMC 的分离

1. 按照下述方法配制所有所需溶液。
2. 将杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS；1×浓度）和淋巴细胞分离液（1.077 g/mL）恢复至室温（20–25 °C）。
3. 将胎牛血清（FBS）置于室温下预热，并将一支含FBS的无菌50 mL离心管置于冰上。每份血液样本需要2 mL FBS。
4. 将冻存管置于 4 °C 保存，并将冻存管在 4 °C 预冷。
5. 将细胞培养基预热至 37 °C，培养基成分为含 50 mL 胎牛血清以及青霉素 50 U/mL、链霉素 50 U/mL 的 RPMI 1640 培养基。该溶液可在 3 °C 下保存长达 2 个月。
6. 在无菌的50 mL离心管中加入8 mL DPBS。在无菌的50 mL离心管中加入15 mL淋巴细胞分离液（该培养基对光敏感，应在开始分离前加入）。
7. 将8 mL血液加入8 mL DPBS中，再用3 mL塑料巴斯德吸管小心混匀。
8. 使用3 mL塑料巴斯德吸管，将血液/DPBS混合液轻轻铺加在淋巴细胞分离液上层。将第一层液体加至分离液时，倾斜离心管20°–30°，以减少血液-PBS混合液对下层介质的穿透。
9. 将血液-PBS混合液沿管壁缓慢地加至淋巴细胞分离液上方。操作时应保持稳定的速度，以确保血液流速恒定。
10. 下一步，将试管缓慢竖直，小心地将剩余血液沿试管侧壁叠加至已有的血层之上。
11. 离心10分钟，1000 x g g 在室温下，使用配有摆动桶转子且关闭刹车的离心机进行离心。离心后，血液/PBMC 混合物分为四层。最上层为血浆和血小板，第二层为 PBMC 层，其下为淋巴细胞分离介质层，最底层为红细胞和粒细胞。各层结构如图所示。 图1.
12. 去除三分之二^rd 用塑料巴斯德吸管吸取血浆层。
13. 使用1 mL移液器，收集淋巴细胞分离液层中的PBMCs，注意避免吸入任何分离液。
14. 将吸头置于PBMC层上方1 mm处。切勿刺穿PBMC层，否则培养基会流过细胞。通过移液器的吸力使PBMC聚集至此位置，从而可在该点多次收集细胞。
    注意：为了最大限度地收集外周血单个核细胞（PBMCs），在操作结束时应检查表面残留的细胞，并尽量收集这些区域的细胞。为稳定操作过程，可将离心管置于平面上。
15. 将PBMCs逐步转移至新的50 mL离心管中，直至完全收集该层。加入DPBS至25 mL刻度线，洗涤去除淋巴细胞分离液及其他残留物。
16. 以 100 × g 离心 10 分钟 g 在室温下刹车离心后，使用真空泵或类似装置小心移除上清液，注意不要破坏细胞沉淀。
17. 将沉淀重悬于1 mL DPBS中，并用DPBS定容至25 mL。重复洗涤一次，然后重悬于适用于后续步骤的培养基中。

图1：密度梯度离心的示意图，用于展示不同分层。 请点击此处查看此图的放大版本。

3. 冷冻保存

1. 将冻存容器冷却至 4 °C，将 FBS 置于冰上冷却。
2. 用 1 mL 移液器将 PBMC 沉淀重悬于 1 mL FBS 中，FBS 应处于室温。
3. 在冰上按 1:5 的比例将 DMSO 与预冷的 FBS 混合，终浓度为 20% DMSO，然后将 FBS:DMSO 混合液放回冰上。该溶液需现配现用。
4. 将含 FBS 的 PBMC 细胞悬液转移至预先标记好的 2 mL 冻存管中。每支收集管使用一支冻存管。调整细胞数量至每毫升 1 × 10⁷ 至 5 × 10⁷ 之间。使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和活率。
5. 用 1 mL 移液器将 1 mL FBS:DMSO 混合液逐滴加入冻存管中，速度约为每秒 1–2 滴。逐滴加入可实现持续且均匀的混合。
6. 将冻存管放入预冷的冻存容器中，再将冻存容器置于 -80 °C 超低温冰箱中保存 24 小时。冻存容器可提供每分钟 -1 °C 的可控降温速率。
7. 从 -80 °C 超低温冰箱中取出冻存管。取出后立即将冻存管转移至液氮气相中长期保存。记录每个样本的存放位置。

4. 解冻

1. 准备所有所需溶液：含 50 mL 胎牛血清及青霉素 50 U/mL、链霉素 50 U/mL 的 RPMI 1640 细胞培养基。该溶液可在 3°C 下保存最多 2 个月。
2. 将细胞培养基预热至 37 °C。向无菌的 50 mL 锥形管中加入 3 mL 预热的细胞培养基。
3. 从液氮罐中取出样本。在 37 °C 水浴中解冻约 3.5 分钟，一旦最后的冰晶开始融化即从水浴中取出。此时管内应仍可见针尖大小的冰粒。
   注意：DMSO 对 PBMC 有害，操作应尽可能迅速。
4. 用 1 mL 移液器从冻存管中取出细胞:FBS:DMSO 混合液。将 PBMC 样本加入已准备好的 50 mL 管中的细胞培养基中。分三次（2 mL、2 mL 和 1 mL）用共 5 mL 培养基冲洗冻存管，以回收残留细胞。
5. 将培养基转移至管中，以回收可能残留的细胞。在室温下以 100 × g 离心 10 分钟。
6. 弃去上清液，加入 1 mL 适用于后续实验的培养基。细胞即可用于后续实验。
   ​注意：然而，在使用新鲜或冻存细胞进行功能检测时，通常建议在基于淋巴细胞分离液的分离或细胞解冻后，在培养箱中静置一段时间（通常为过夜）。

5. 细胞培养

1. 在 37 °C、5% CO₂/95% 空气条件下，将分离或解冻后的细胞培养过夜。
2. 将细胞重悬于 1 mL RPMI 培养基中，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）、青霉素 50 U/mL、链霉素 50 U/mL。后续使用有多种选择，可根据实验需要对细胞进行相应处理。
3. 对于常规储存，使用无菌的 6 孔细胞培养板，在静置培养后收集细胞。用 1 mL 移液器将 1 mL 细胞悬液转移至一个孔中，并加入 4 mL 细胞培养基。
   注意：不同个体间分离得到的 PBMC 数量差异较大，每分离 8 mL 血液使用一个含 5 mL 细胞培养基的孔即可。然而，从血沉棕黄层（buffy coats）中分离 PBMC 时，所得 PBMC 数量显著高于全血样本，因此应将细胞分至多个孔中培养。
4. 将细胞置于 37 °C、含 5% CO₂ 的湿润环境中静置培养 24 小时。此孵育步骤适用于新鲜分离的细胞以及冻存后复苏的细胞。

6. ATP 检测

1. 将解冻的外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于1 mL RPMI培养基中，该培养基需添加10% 胎牛血清（FBS）、50 U/mL 青霉素和50 U/mL 链霉素。
2. 取样并测定细胞浓度，然后使用台盼蓝进行活死细胞鉴别。取10 µL重悬的细胞与90 µL细胞培养基混合，再从中取10 µL与10 µL台盼蓝混合。将混合液加入细胞计数板或自动细胞计数仪中，测定活细胞与死细胞的数量。
3. 在96孔白色聚苯乙烯板中，每孔加入100 µL细胞悬液，细胞密度为1 × 10⁵ 个细胞/100 µL。
4. 将细胞置于37 °C、含5% CO₂的湿润环境中静置培养24小时。
5. 使用ATP检测试剂盒测定ATP浓度。
   1. 利用ATP与荧光素结合时产生的光信号进行检测，发光强度可通过酶标仪读取。将培养板从培养箱中取出，室温静置15分钟使其冷却。裂解细胞后孵育5分钟，随后加入检测试剂，按照制造商说明书进行测定。使用内标法确定ATP水平。

7. 高分辨率呼吸测定法

1. 开启高分辨率氧电极仪，预热 30 分钟。
2. 根据图 1中描述的方案处理细胞，并按表 1准备所需的所有储备液。
3. 将 2.1 mL 呼吸缓冲液（表 1）加入高分辨率氧电极仪的两个检测室中，在 37 °C 条件下使用检测室内磁力搅拌子持续搅拌（750 rpm）30 分钟，直至极谱氧传感器获得稳定的氧通量信号。
   注：在氧电极仪的检测室中，通过极谱氧电极实时测量氧消耗量（通量）以及检测室内的氧饱和度。必须进行背景校准，以避免背景噪声，确保结果可靠。
4. 根据制造商的操作说明对极谱氧传感器进行空气校准²³。
5. 将分离的外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于 1 mL 线粒体呼吸介质（MIR05，其成分见表 1）中，并稀释至 8 × 10⁶ 个细胞/mL。
6. 完成空气校准后，吸出氧电极仪检测室中的呼吸介质，向每个检测室中加入 2.1 mL 细胞悬液。若测量过程中需要重新充氧（参见图 2中 h 点的开放操作），应确保检测室的氧饱和度不低于 100 µM。
7. 插入密封塞关闭检测室，检测室设计容量为 2.0 mL。吸出溢出的细胞悬液。
8. 在 37 °C 条件下，使用检测室内的磁力搅拌器（750 rpm）持续混匀细胞悬液，等待约 20 分钟，直至获得稳定信号。测定内源性呼吸（图 2中的 a 点）。
9. 为测定呼吸链中不同复合物的活性，通过密封塞上的钛制注射口加入线粒体呼吸的底物和抑制剂。使用以下终浓度加入检测室。
10. 为破坏细胞膜，通过检测室密封塞的钛制注射口加入 5 µL 8.1 mM 洋地黄皂苷，以去除内源性底物（图 2中的 b 点），同时保持线粒体膜完整。
11. 通过检测室密封塞的注射口加入 2 M 谷氨酸和 800 mM 苹果酸，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定。
    注：也可使用其他底物，如丙酮酸。
12. 通过检测室密封塞的注射口加入 8 µL 500 mM 二磷酸腺苷（ADP），记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 d 点）。
13. 通过检测室密封塞的注射口加入 20 µL 1 M 琥珀酸，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 e 点）。
14. 逐步滴加 1 M 碳酰氰-对-三氟甲氧基苯腙（FCCP），每次 0.5 µL，直至呼吸不再进一步增加。每次加样后等待 2–4 分钟，直至信号稳定（图 2中的 f 点）。当呼吸无进一步增加时，进入下一步。
    注意：操作 FCCP 时需谨慎，因其对人体具有健康风险。
15. 通过检测室密封塞的注射口加入 5 µL 0.1 mM 鱼藤酮，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 g 点）。
    注意：操作鱼藤酮时需谨慎，因其对人体具有健康风险。
16. 通过检测室密封塞的注射口加入 1 µL 4 mg/mL 寡霉素，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 h 点）。
    注意：操作寡霉素时需谨慎，因其为有毒物质，对人体具有健康风险。
17. 通过检测室密封塞的注射口加入 1 µL 5 mM 抗霉素 A，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 i 点）。
    注意：操作抗霉素 A 时需谨慎，因其为有毒物质，对人体具有健康风险。
18. 在分析实验数据时，为排除不参与氧化磷酸化的酶所消耗的氧气，需从所有其他测量值中减去抗霉素 A 处理后的数值。
19. 加入 200 mM N,N,N',N'-四甲基对苯二胺二盐酸盐（TMPD；电子供体）和 800 mM 抗坏血酸，以维持 TMPD 处于还原状态。通过检测室密封塞的注射口加入底物，记录呼吸直至信号稳定。信号通常在 2–4 分钟内稳定（图 2中的 j 点）。
20. TMPD 可发生自氧化，因此需从复合物 IV 的测量值中减去其引起的氧消耗量。
21. 通过检测室密封塞的注射口加入 NaN₃ ≥ 100 mM，记录呼吸直至信号稳定。信号在 2–4 分钟内稳定，以抑制复合物 IV 活性，此时仅剩 TMPD 的自氧化反应。
    注意：操作叠氮化钠时需谨慎，因其为有毒物质，对人体具有健康风险。

图2：O₂通量的示意图。 示出了氧通量的示意图。该曲线在加入抑制剂和底物后分为a-k的不同阶段。a：内源性呼吸；b：透化细胞；c：解偶联的复合物I呼吸；d：偶联的复合物I呼吸；e：氧化磷酸化（OXPHOS）；f：复合物I和复合物II的最大解偶联活性；g：复合物II的解偶联呼吸；h：质子漏呼吸；i：残余呼吸；j：CIV_(U)解偶联呼吸及TMPD的自氧化；k：TMPD的自氧化。请点击此处查看该图的放大版本。

8. 柠檬酸合酶活性

1. 将柠檬酸合酶活性作为独立参数进行测定，并用其对高分辨率氧电极的测量结果进行归一化处理。
2. 将分离的外周血单个核细胞（PBMC）重悬于1 mL线粒体呼吸介质（MIR05）中，并稀释至8 × 10⁶个细胞/mL⁶ cells/mL
3. 在液氮中速冻，然后在 −80 °C 保存，直至进行实验或测定新鲜细胞。
4. 配制所需的所有溶液：0.1 M 三乙醇胺盐酸缓冲液（pH 8.0）、1.0 M Tris-HCl 缓冲液（pH = 8.1）、10% Triton X-100、10 mM 草酰乙酸溶于 0.1 M 三乙醇胺盐酸缓冲液（pH 8.0）、1.01 mM DTNB 溶于 1.0 M Tris-HCl 缓冲液（pH = 8.1）、12.2 mM Acetyl-CoA 溶于双蒸水₂O.
5. 制备反应液（表1) 含 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸) (DTNB; 0.1 mM)、乙酰辅酶A (0.31 mM)、EDTA (50 µM)、三乙醇胺盐酸盐 (5 mM) 和 Tris盐酸盐 (0.1 M)。
6. 制备起始试剂（表1) 加入溶于双蒸水的 0.5 mM 草酰乙酸₂O.
7. 将样品置于冰上解冻，因为柠檬酸合酶若解冻过快会不稳定。
8. 将40 µL样品加入预冷的96孔板中，置于冰上，随后使用多通道移液器加入110 µL反应液。
9. 将反应液和样品在培养箱中30 °C预热5分钟。将起始试剂在水浴中30 °C预热5分钟。
10. 使用多通道移液器向每孔加入50 µL起始试剂。通过酶标仪在30 °C、412 nm波长下测定20 min的吸光度。

结果

细胞活力与数量
为了成功进行分离和冻存，细胞数量和活力应尽可能高。在冻存前后，需对细胞进行计数并测定其活力，以确保细胞的健康状态和质量。图3 展示了外周血单个核细胞（PBMCs）在冻存前后的代表性图像，细胞数量和活力几乎没有差异，表明PBMCs的分离与保存成功。

图3：冻存对细胞数量和活力的影响。 实验分组包括对照组（新鲜分离的PBMCs）以及冻存1个月后的PBM...

讨论

本方案提供了一种从人血中分离并低温冻存外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，适用于生物能量学分析。该方法可轻柔地大量分离PBMCs，细胞活力高，且能获得足够数量的细胞用于生物能量学检测。其缺点是即使尽量减少中断，分离过程仍耗时较长，但后续的低温冻存使得生物能量学检测可在不同时间点进行。采用此方法，样本可先收集，并在后续时间点统一检测。该方法也适用于多中心临床试验中的样本采集，并可在中心实验室统一进行参数测定。

冷冻保存技术使得细胞能够长期储存，并可在之后进行检测。外周血单个核细胞（PBMC）的分离是一个耗时约2-3小时的过程，且每次只能处理少量样本。单个实验人员若同时从超过两名个体中分离新鲜PBMC，将不可避免地导致细胞质量下降。若需使用新鲜细胞进行后续实验，则会增加操作复杂性，带来额外的压力和时间负担。将细胞分离与实验操作分步进行，可简化研究流程，并提高检测的标准化程度。具体而言，可先采集血液样本，完成分离后对样本群体进行冷冻保存，再择期开展特定实验。样本可来自不同地点和不同时间点，最终在同一时间、同一地点统一检测。

生物能...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.1 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液 (pH = 8.0)	自行配制	-
0.5 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液	自行配制	-
1.0 M Tris-盐酸缓冲液 (pH = 8.1)	自行配制	-
1.01 mM DTBB	自行配制	-
10 % Triton X-100	自行配制	-
10 mM 草酰乙酸	自行配制	-
14–20 G 无菌采血针 Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% 盐酸	Carl Roth GmbH & Co. KG	-
70% 乙醇 (EtOH)	自行配制	-
乙酰辅酶A	Pancreac Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
酒精棉片			(70% 异丙醇)
抗霉素A	Sigma-Aldrich	A8674
去离子水 (bidest.)	使用 MilliQ Academic 系统制备（自制）	-
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	A4034
ATP标准品	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll 分离液	Biochrom	6115
生物安全柜 MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙 (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
细胞计数仪 TC20 自动细胞计数器	Bio-Rad
离心机 Heraeus Megafuge 16 R	Thermo Fisher Scientific Inc.
双腔计数板，用于细胞计数仪	Bio-Rad	1450016
冻存管 Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
皂苷	Sigma-Aldrich	37008
二甲基亚砜 (DMSO)	Merck	102952
消毒喷雾剂
一次性手套（乳胶、橡胶或乙烯基）
移液器吸头 (12.5 ml) DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
乙醇 (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
胎牛血清 (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
超低温冰箱 (-80°C)	Thermo Fisher Scientific Inc.
谷氨酸	Sigma-Aldrich	G1626
支架/适配器
CO2 培养箱 Midi 40	Thermo Fisher Scientific Inc.
注射器	Hamilton
苹果酸	Sigma-Aldrich	M-1000
MIR05	自行配制	-
Mr. Frosty 冻存容器	Thermo Fisher Scientific Inc.	10110051
多功能酶标仪 CLARIOstar	BMG Labtech
液氮罐 Locator 6 plus	Thermo Fisher Scientific Inc.
寡霉素	Sigma-Aldrich	O4876
草酰乙酸	Sigma-Aldrich	-
Oxygraph-2k	Orobororus Instruments
青霉素-链霉素	PAA	15140122
移液器 Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL	VWR
Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
鱼藤酮	Sigma-Aldrich	R8875
蔗糖	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
叠氮化钠	Sigma-Aldrich	S2002
琥珀酸	Sigma-Aldrich	S2378
四甲基对苯二胺 (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
止血带/血压袖带
三(羟甲基)氨基甲烷	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
台盼蓝	Biochrom	T6146
真空泵	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
水浴锅 WNB22	Memmert GmbH & Co. KG