分离的外周血单个核细胞可用于免疫功能和免疫相关疾病、代谢性疾病或线粒体功能的研究分析。本文中，我们描述了一种从全血中制备外周血单个核细胞（PBMCs）并进行后续冷冻保存的标准方法。冷冻保存使得实验在时间和空间上具有独立性。
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本文内容
摘要
摘要
真核细胞的生理功能主要依赖于线粒体提供的能量。线粒体功能障碍与代谢性疾病及衰老相关。氧化磷酸化在此过程中起决定性作用，对维持细胞能量稳态至关重要。外周血单个核细胞（PBMCs）已被确定为一种微创样本，可用于检测线粒体功能，并已被证明能够反映疾病状态。然而，在人体样本中，线粒体生物能量功能的测定可能受到多种因素的限制，包括采样量、采样时间（通常跨越数天）以及采样地点。对采集的样本进行冷冻保存可确保样本收集和检测的一致性。应注意确保冷冻保存细胞与新鲜制备细胞之间所测参数具有可比性。本文描述了从人血液样本中分离并冷冻保存PBMCs以分析其线粒体生物能量功能的方法。按照本方案冷冻保存的PBMCs在细胞数量和活力、三磷酸腺苷（ATP）水平以及呼吸链活性测定方面，与新鲜收获的细胞相比仅有轻微差异。本方法仅需8–24 mL人血液，使得在多中心临床研究中采集样本并在现场测定其生物能量学成为可能。
引言
人外周血单个核细胞（PBMCs）在多个科学领域中具有广泛的应用，包括免疫学和生物能量学相关问题的研究，例如与衰老过程或退行性疾病相关的研究1,2。PBMCs在组成上具有异质性，主要包括淋巴细胞（B细胞、T细胞和NK细胞）、单核细胞以及树突状细胞。这些细胞在不同个体之间，甚至同一个体内部有时会表现出显著差异，因此需要标准化的操作流程来处理这些细胞。细胞活性和分离纯度等重要参数是其操作的基本要求，同时还会受到采样时间、褪黑激素水平、受试者是否空腹等环境因素的影响3,4。
基于对PBMCs生物能量学的研究，本文介绍了一种适用于其他方法的PBMCs分离、冷冻保存和培养技术。尽管肌肉活检被认为是线粒体能量代谢的金标准5，但血液细胞的检测是一种快速且微创性较小的操作。此外，越来越多的研究表明，衰老和阿尔茨海默病（AD）中线粒体功能的变化不仅发生在脑组织中，也出现在外周组织中6,7,8,
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方案
本手稿中所述的血液采集、分离与分析的所有方案均已通过德国吉森大学机构审查委员会的审核与批准。已获得患者同意将其样本用于本研究。分离与细胞培养的所有步骤均在生物安全柜内进行。
1. 静脉穿刺
- 准备所有采血所需的设备，包括消毒喷雾剂、无菌棉签、带80 mm试管和多通接头的采血套管、止血带/血压袖带、9 mL含锂肝素的Monovette采血管。
注：EDTA作为抗凝剂同样有效。 - 从最合适的上臂静脉采血，通常为肘正中静脉或头静脉。
- 使用止血带/血压袖带施加轻度压力，约为80 mm/Hg。
- 用含酒精的消毒喷雾剂对手套和穿刺部位进行消毒，并让消毒后的穿刺部位自然风干。
- 由于压力袖带的作用，静脉会更加突出。以15°–20°的角度将针头（套管外径21G / 0.8 mm，长度19 mm）刺入静脉，尽量避免造成创伤并减少探查。
- 使用合适的采血系统采集血液，共采集4管，每管9 mL血液（单个实验人员处理超过7–8管血液将难以充分分离）。
- 采血完成后，将采血管置于避光环境中静置5分钟，以确保抗凝剂均匀作用。
2. 外周血单个核细胞分离
- 按照下述方法配制所有所需溶液。
- ....
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结果
细胞活力与数量
为了成功进行分离和冻存，细胞数量和活力应尽可能高。在冻存前后，需对细胞进行计数并测定其活力，以确保细胞的健康状态和质量。图3 展示了外周血单个核细胞（PBMC）在冻存前后的代表性图像，细胞数量和活力几乎没有差异，表明PBMC的分离与保存成功。
图3：冷冻保存对细胞数量和活力的影响。 实验分组包括对照组（新鲜分离的外周血单个核细胞，PBMCs）以及经过1个月冷冻保存后的PBMCs。细胞计数.......
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讨论
本方案提供了一种从人血中分离并低温冻存外周血单个核细胞（PBMCs）的方法，适用于生物能量学分析。该方法可轻柔地大量分离PBMCs，细胞活力高，且能获得足够数量的细胞用于生物能量学检测。其缺点是即使尽量减少中断，分离过程仍耗时较长，但后续的低温冻存使得生物能量学检测可在不同时间点进行。采用此方法，样本可先收集，并在后续时间点统一检测。该方法也适用于多中心临床试验中的样本采集，并可在中心实验室统一进行参数测定。
冷冻保存技术使得细胞能够长期储存，并可在之后进行检测。外周血单个核细胞（PBMC）的分离是一个耗时约2-3小时的过程，且每次只能处理少量样本。单个实验人员若同时从超过两名个体中分离新鲜PBMC，将不可避免地导致细胞质量下降。若需使用新鲜细胞进行后续实验，则会增加操作复杂性，带来额外的压力和时间负担。将细胞分离与实验操作分步进行，可简化研究流程，并提高检测的标准化程度。具体而言，可先采集血液样本，完成分离后对样本群体进行冷冻保存，再择期开展特定实验。样本可来自不同地点和不同时间点，最终在同一时间、同一地点统一检测。
生物能.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢吉森-马尔堡大学医院临床团队提供的血液采集工作。本研究由吉森大学资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.1 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液 (pH = 8.0) | 自行配制 | - | |
| 0.5 M 三乙醇胺-盐酸缓冲液 | 自行配制 | - | |
| 1.0 M Tris-盐酸缓冲液 (pH = 8.1) | 自行配制 | - | |
| 1.01 mM DTBB | 自行配制 | - | |
| 10 % Triton X-100 | 自行配制 | - | |
| 10 mM 草酰乙酸 | 自行配制 | - | |
| 14–20 G 无菌采血针 Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% 盐酸 | Carl Roth GmbH & Co. KG | - | |
| 70% 乙醇 (EtOH) | 自行配制 | - | |
| 乙酰辅酶A | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| 酒精棉片 | (70% 异丙醇) | ||
| 抗霉素A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| 去离子水 (bidest.) | 使用 MilliQ Academic 系统制备（自制） | - | |
| 抗坏血酸 | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP标准品 | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll 分离液 | Biochrom | 6115 | |
| 生物安全柜 MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 羰基氰-对-三氟甲氧基苯腙 (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| 细胞计数仪 TC20 自动细胞计数器 | Bio-Rad | ||
| 离心机 Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 双腔计数板，用于细胞计数仪 | Bio-Rad | 1450016 | |
| 冻存管 Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| 皂苷 | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Merck | 102952 | |
| 消毒喷雾剂 | |||
| 一次性手套（乳胶、橡胶或乙烯基） | |||
| 移液器吸头 (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| 乙醇 (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| 胎牛血清 (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| 超低温冰箱 (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 谷氨酸 | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| 支架/适配器 | |||
| CO2 培养箱 Midi 40 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 注射器 | Hamilton | ||
| 苹果酸 | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | 自行配制 | - | |
| Mr. Frosty 冻存容器 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| 多功能酶标仪 CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| 液氮罐 Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| 草酰乙酸 | Sigma-Aldrich | - | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| 青霉素-链霉素 | PAA | 15140122 | |
| 移液器 Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 蔗糖 | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| 叠氮化钠 | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 琥珀酸 | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| 四甲基对苯二胺 (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| 止血带/血压袖带 | |||
| 三(羟甲基)氨基甲烷 | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| 台盼蓝 | Biochrom | T6146 | |
| 真空泵 | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| 水浴锅 WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
参考文献
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer's disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548(2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biology. 8 (2), 48(2019).
- Kleiveland, C. R. Peripher....
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