方法文章

利用光转换技术追踪肺转移灶中肿瘤细胞的播散

DOI：

10.3791/65732

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2023年7月7日

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1Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 2Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 3Gruss-Lipper Biophotonics Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 4Department of Cell Biology, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 5Montefiore Einstein Cancer Center, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 6Integrated Imaging Program for Cancer Research, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 7Department of Surgery, Albert Einstein College of Medicine/Montefiore Medical Center, 8Department of Cancer and Cellular Biology, Lewis Katz School of Medicine, Fox Chase Cancer Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种研究肿瘤细胞从肺转移灶重新扩散的方法，该方法包括一种选择性光转化肺转移灶的手术方案，随后在三级器官中鉴定重新扩散的肿瘤细胞。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

转移——癌症的系统性扩散——是癌症相关死亡的首要原因。尽管转移通常被认为是一个单向过程，即原发性肿瘤的细胞扩散并形成转移灶，但已有转移灶中的肿瘤细胞也可以再次扩散，在第三部位形成新的病灶，这一过程被称为"转移灶来源的转移"或"转移灶到转移灶的播种"。转移灶到转移灶的播种可能增加转移负荷，并降低患者的生活质量和生存率。因此，深入了解这一现象背后的机制，对于优化转移性癌症患者的治疗策略至关重要。

关于转移灶之间的播散，目前所知甚少，部分原因在于技术和操作上的限制。对转移灶间播散的研究主要依赖测序方法，而这些方法对于研究转移灶间播散事件发生的确切时间或影响其发生促进或抑制因素的研究人员而言，可能并不实用。这凸显了目前尚缺乏能够有效支持转移灶间播散研究的方法学体系。为解决这一问题，我们开发了一种小鼠手术方案，并在本文中予以详细描述：该方案可实现对肺转移灶的选择性光转化，从而特异性地标记从肺部再播散至第三部位的肿瘤细胞，并追踪其命运。据我们所知，这是目前唯一一种无需基因组分析即可研究肿瘤细胞再播散及肺部转移灶间播散的方法。

引言

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转移是癌症相关死亡的主要原因1。 当原发肿瘤的细胞扩散至全身并在远处器官中增殖形成临床可检测的肿瘤时，即产生转移性癌症2,3。

尽管转移通常被认为是一个单向过程，即肿瘤细胞从原发性肿瘤扩散并定植于远端器官4，但越来越多的临床和实验证据表明，这一过程实际上更为复杂且具有多向性。已有研究表明，循环肿瘤细胞可以重新定植原发性肿瘤（如果原发灶仍然存在）5,6,7,8,9，而已有转移灶中的肿瘤细胞也可迁移至第三部位，形成新的病灶10,11,12,13。事实上，近期基因组分析的证据显示，部分转....

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方案

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本方案中描述的所有操作均按照脊椎动物使用指南和相关规定进行，并已事先获得阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

手术前，需使用表达光转化/光转换蛋白的癌细胞在小鼠体内建立肺转移模型；已有多种建立肺转移的实验方案被发表26,27,28。

1. 手术准备

  1. 准备独立的工作区域，分别用于小鼠准备（脱毛和插管）、手术和恢复。
  2. 将所有手术器械在高压灭菌器中灭菌。
    注意：由于本手术采用仅使用尖端的技术，可使用热珠灭菌器对器械进行重复灭菌，以用于后续操作。
  3. 打开加热手术平台，并使其升温并稳定在 37–40 °C。
  4. 使用 5% 异氟烷诱导麻醉，随后将异氟烷浓度降低至 3%。在整个操作过程中定期进行足趾夹捏试验，以评估麻醉深度是否充分。
  5. 将麻醉后的小鼠置于右侧卧位。在左上胸部/体侧区域（见图1A）涂抹脱毛膏以去除毛发。用浸湿的纱布或纸巾擦拭，清除毛发和脱毛膏。必要时重复操作，直至手术区域所有毛发完全清除。
    注意：脱毛....

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结果

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本方案中所述手术步骤的示意图如下所示 图1简而言之，小鼠经麻醉后，去除左侧胸壁的毛发。随后对小鼠进行气管插管并实施通气，以确保在胸腔开放期间小鼠能够获得氧气。清除软组织以暴露肋骨，于第6肋处做一切口th 或 7th 肋间肌。将牵开器插入肋间切口并释放，以撑开相邻的肋骨，暴露左肺及其表面任何可光转化的转移灶。随后将肺组织及转移灶暴露于蓝光下，以实现对可见病灶的光转化。光转化完成后，移除牵开器，缝合肋骨，关闭表层皮肤。最后，排出胸腔内多余空气，减轻肺部压力，使小鼠恢复自主呼吸。

此处所述方案可适用于多种不同的光转化/光切换蛋白。确保光转化后的细胞在光转化通道中达到其荧光强度峰值，有助于在其他器官中识别这些细胞。光转化后达到最大荧光强度所需的条件应通过实验确定，因为这些条件可能因实验的其他因素而异，例如所使用的光转化蛋白种类以及用于光转化的光照强度。 图2B，C 展示荧光强度在FITC（非光转.......

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讨论

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本文描述了一种在肺部选择性光转化肿瘤细胞的手术方案。该技术使研究人员能够选择性地标记肺部的肿瘤细胞，并通过后续在体内重新识别这些细胞来追踪其命运，从而促进对肺转移灶转移过程的研究。利用该方案，我们能够在接受过光转化手术的小鼠的脑、肝以及未进行光转化的右肺中观察到光转化后的细胞，表明这些细胞从光转化的肺转移灶重新扩散到了这些三级部位。在未接受光转化的小鼠器官中未发现任何红色细胞，表明细胞的天然自发荧光强度不足以与光转化的肿瘤细胞相混淆。

仔细关注实验的某些方面可以提高该操作的成功率。首先，在建立肺转移模型时，必须考虑转移形成方案以及光转化/光转换蛋白的选择。已有报道指出，某些荧光蛋白具有免疫原性33,34,35,36。因此，表达此类蛋白的癌细胞在免疫健全的小鼠中可能无法自发转移。事实上，我们观察到，将6DT1-Dendra2细胞原.......

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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作者感谢Wade Koba在微型计算机断层扫描（S10RR029545）方面的协助，感谢分析成像中心的Vera DesMarais和Hillary Guzik在显微镜技术方面的培训与帮助，感谢爱因斯坦-蒙特菲奥里癌症中心、美国国家癌症研究所（P30CA013330、R01CA21248、R01CA255153）、格鲁斯-利珀生物光子学中心、癌症研究综合成像项目、惠康基金会亨利爵士博士后奖学金（221647/Z/20/Z）以及METAvivor职业发展奖的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0-30 V，0-3 A 电源供应器MPJA9616 PS
12 VDC，1.2 A 非稳压插头电源MPJA17563 PD
28 G 1 mL BD 胰岛素注射器BD329410
400 nm 发光二极管阵列灯LedEngin 公司897-LZPD0UA00光转换灯，定制（包括以下各个部件）
5-0 编织丝线缝合线，带 RB-1 切割针Ethicon, Inc.774B
9 cm 2-0 丝线结Ethicon, Inc.LA55G
拜耳灵100（恩诺沙星）拜耳（Santa Cruz Biotechnology）sc-362890Rx饮水中使用的抗生素
布托啡诺Hospira0409-2012-32镇痛剂
电缆（电缆组件）2.5 JK-ST 72" ZIP CD穆瑟172-0250
氯己定溶液Durvet7-45801-10258-3氯己定消毒液
压缩空气罐FalconDPSJB-12
超细显微解剖剪 4" 直型锐缘/锐缘 24 毫米Roboz SurgicalRS-5912锋利的微型解剖剪
光纤照明光源O.C. White 公司FL3000小鼠插管过程中使用
Gemini电凝套装哈佛仪器726067电烙笔
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120V珠式灭菌器
格拉夫钳RobozRS-5135
高功率LED——单色紫外90瓦穆瑟LZP-D0UA00
红外加热灯Braintree ScientificHL-1
异氟烷 SOL 250 mL PVLCovetrus29405麻醉剂
异氟烷蒸发器SurgiVetVCT302
带锁止装置的雅各布森持针器Kalson SurgicalT1-140
标签胶带Fisher ScientificS68702
LED照明反射器 CREE MP-L 单透镜反射器 &和 LOC PIN穆瑟928-C11395TM
长棉签棒Medline IndustriesMDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron 最高支持 3.4GHz / 滚珠轴承 / 铜芯 / CPU 散热风扇CompUSA#S457-1023
微型解剖剪 4" 直型钝端/钝端Roboz SurgicalRS-5980钝头显微解剖剪
小鼠呼吸机Kent Scientific PS-02PhysioSuite
Nair 脱毛乳液亚马逊B001RVMR7K脱毛膏
Personnet小型牵开器RobozRS-6504牵开器
1×磷酸盐缓冲液Fisher Scientific14190144PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.WAddgene51005Dendra2 慢病毒
PuralubeHenry Schein 动物健康008897眼部润滑剂
啮齿类动物插管架Braintree ScientificRIS 100
小型动物肺部膨胀球囊哈佛仪器72-9083
用于小鼠的多功能外科手术平台 SurgiSuite（带加热功能）Kent ScientificSURGI-M02加热手术平台
测试导线 48" 测试引线香蕉插头 - 黑色穆瑟565-1440-48-0
测试导线 48" 测试导线香蕉插头 - 红色穆瑟565-1440-48-2
气管导管 Exelint International2674622 G 导管
兽用伤口闭合系统套件Clay AdamsIN015兽医外科缝合器套装

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
  2. Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  3. Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J.

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