实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症的动物模型。本文介绍了一种对EAE小鼠脊髓中的炎症、脱髓鞘和轴突损伤进行评分的方法。此外，还提供了一种定量检测小鼠血清中可溶性神经丝轻链水平的方法，有助于在活体小鼠中评估轴突损伤。
本文内容
摘要
摘要
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种常见的基于免疫的多发性硬化症（MS）模型。该疾病可通过使用髓鞘蛋白成分与完全弗氏佐剂（CFA）对啮齿类动物进行主动免疫，或通过将经髓鞘蛋白/CFA致敏的啮齿类动物体内获得的髓鞘特异性效应T细胞转移至未致敏的受体动物体内而诱导产生。EAE的严重程度通常采用5分制临床评分标准进行评估，该标准用于衡量上升性瘫痪的程度，但此评分系统在评估EAE恢复程度方面并不理想。例如，在某些EAE模型（如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白[MOG]多肽诱导的EAE模型）中，尽管炎症已经消退，临床评分仍可能维持在较高水平。因此，有必要将临床评分与组织学评分相结合，后者还可用于研究中枢神经系统（CNS）内细胞损伤的潜在机制。
本文介绍了一种简单的实验方案，用于制备和染色小鼠的脊髓和脑组织切片，并对脊髓中的炎症、脱髓鞘及轴突损伤进行评分。该用于评估脊髓白细胞浸润的方法也可应用于实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中脑部炎症的评分。此外，还描述了一种利用小分子检测法（SIMOA）测定小鼠血清中可溶性神经丝轻链（sNF-L）的方案，该指标可 反映活体小鼠中枢神经系统总体损伤的程度。
引言
实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究人类脱髓鞘疾病多发性硬化症（MS）最常用的小鼠模型。1经典的多发性硬化症（MS）炎症病理，包括产生干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-17（IL-17）的辅助性T细胞浸润2，炎性单核细胞的浸润3血管周围和软脑膜下炎性脱髓鞘病变的形成4，以及轴突损伤的发生4 在中枢神经系统（CNS）中也观察到实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的表现5,6,7,8,9EAE与MS在免疫机制上的相似性使其成为测试多种已获批的免疫疗法对MS疗效及作用机制的合适临床前模型，这些疗法包括那他珠单抗（natalizumab）、芬戈莫德（fingolimod）、富马酸二甲酯（dimethyl fumarate）和醋酸格拉替雷（glatiramer acetate）（详见综述于1,5）。某些EAE方案可模拟进行性多发性硬化病理的其他方面，除轴突损伤外，还包括脑部软脑膜下炎症的形成、慢性脱髓鞘、脊髓萎缩、突触及神经元丢失6,10,11,12因此，EAE可用于筛选治疗多发性硬化症的神经保护疗法的有效性。
可通过多种方式在啮齿类动物中诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。最常用的诱导方法是主动免疫，即用髓鞘抗原（完整蛋白或肽段）与完全弗氏佐剂（CFA）乳化后对啮齿类动物进行免疫，并在CFA中添加灭活的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）13。根据小鼠品系的不同，通常在免疫当天（第0天）和第2天给予百日咳毒素（PTX），以提高疾病的发生率13。此外，EAE也可通过过继转移来自经髓鞘抗原/CFA致敏小鼠的髓鞘特异性T细胞至健康小鼠体内来诱导14 ，或在过表达针对主要髓鞘抗原的T细胞受体的小鼠中自发产生5。
EAE疾病的严重程度和进展通常采用离散的5分制临床评分标准进行评估：1分——尾巴无力，2分——后肢或足部无力，3分——单侧或双侧后肢完全瘫痪，4分——前肢无力，5分——濒死或死亡13。该临床评分系统在记录疾病初期出现的上升性瘫痪进展方面是可靠的，但在反映中枢神经系统炎症发作后恢复程度方面敏感性较低。例如，在EAE评分中，行走困难的小鼠和虽能轻松行走但存在足部抓握无力的小鼠均被评分为2分。即使炎症反应已经消退，由于存在永久性的轴突损伤或丢失，在EAE的急性后期评分仍可能保持较高水平9。已有多种尝试开发更精细的评分系统、行为学测试、后肢力量和抓握力测量方法以及红外监测系统 ，以更准确地捕捉EAE中临床缺陷的差异9,16,17,18；然而，这些更复杂的评分方法仍无法区分炎症与组织损伤对潜在神经功能缺陷的各自贡献。因此，评估EAE严重程度的金标准方法是同时进行临床评分和组织病理学评分。
本文介绍了一种对小鼠脊髓和脑组织进行解剖并包埋于石蜡中的实验方案，该方法能够捕捉实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中病灶形成的随机过程。同时提供了一种使用Luxol快蓝（Luxol fast blue, LFB）对切片进行染色的方案，该染色法最初由Kluver和Barrera19建立，可用于检测中枢神经系统（CNS）中的髓鞘。切片可单独使用LFB染色（用于脱髓鞘分析），或联合苏木精和伊红（H&E）进行复染，以帮助观察和评分炎性病灶。此外，本文还提供了利用 commercially available 抗体、免疫组织化学（IHC）技术以及公开可获取的软件，对脊髓中总白细胞（CD45）、髓鞘丢失程度以及受损轴突数量（SMI-32）进行定量分析的实验流程。用于定量脊髓中白细胞的方案同样适用于脑组织中白细胞的定量分析。
脑部轴突丢失与损伤的组织学评估相较于脊髓更为困难，因为脑内白质纤维束并非彼此平行排列。血清神经丝轻链（sNF-L）的检测已成为一种有前景的生物标志物 多发性硬化症中的神经元损伤20,21近期研究已将该技术拓展应用于EAE。22,23,24本文介绍了一种利用单分子免疫阵列分析法（SIMOA）在活体小鼠中检测血清神经丝轻链（sNF-L）的方法。该方法仅需少量血清样本，可在半日内完成活体小鼠的检测，从而快速评估待测疗法对中枢神经系统（CNS）损伤的整体影响。文中所述所有方法均适用于任何性别和品系的小鼠。
方案
所有涉及小鼠的实验均在 Unity Health Toronto 动物护理委员会批准的动物使用方案下进行，并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南。在整个实验操作过程中，务必穿戴实验服、防护手套和护目用具。
1. 脑和脊髓的采集与固定
- 根据机构规定对小鼠实施安乐死。将小鼠俯卧于解剖台上，使用手术剪自上而下剪断头部。
- 用有齿镊（非优势手）夹住小鼠头顶皮肤，然后用手术剪在头部正中皮肤上做一条长约2.5 cm的切口。
- 用手指将头部皮肤向两侧推开，以暴露下方颅骨。
- 用标准有齿镊夹住眼眶以固定小鼠头部。
- 用精细剪刀（优势手）沿中线从颈椎至嗅球处对颅骨进行小段剪切。
注意：每次仅将剪刀尖端插入颅骨下方几毫米，以避免损伤下方脑组织。 - 使用带齿有齿镊将颅骨向两侧掀开，暴露下方脑组织。
- 用非优势手握住头部。将剪刀闭合（优势手），从颈椎处挖出脊髓，并轻轻推动将脑组织从颅腔中推出，同时剪断颅神经。
- 将脑组织放入已标记动物编号的锥形管中，管内含10 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液。
- 沿小鼠躯干中线从颈部至尾部切开毛皮。
- 用手指将皮肤向两侧推开，暴露脊柱。
- 使用手术剪在股骨与髋部连接水平处，自上而下剪断脊柱。
- 使用手术剪从髋部至颈部沿脊柱两侧剪开体壁，修剪掉任何附着的器官组织。
- 将含有脊髓的脊柱放入与脑组织相同的福尔马林管中。让脑和脊柱固定5–7天。
注意：固定时间至关重要。某些抗体在组织过度固定后将无法有效结合；若固定不足，则在步骤2中难以将脊髓从椎管中完整挤出。
2. 脊髓和脑的大体取材与处理
注意：以下步骤均在通风橱中进行。开始前，准备好两个 10 cm 的洁净培养皿、一个配有漏斗的锥形瓶（漏斗内衬滤纸）、两把解剖刀（一把用于切割骨骼，另一把用于切割中枢神经系统组织）、擦镜纸、铅笔、包埋盒以及预先装好 10% 甲醛的标本瓶。
- 使用剪刀剪取一小片滤纸（宽度与包埋盒相同，长度为其两倍），并将其放入一个培养皿中。
- 用铅笔在塑料包埋盒上标记样本编号。
- 将含有固定后脑组织和脊柱的试管内容物倒入漏斗中。将脊柱和脑组织转移至另一个空的培养皿中。
注意：使用过的福尔马林溶液将通过滤纸流入锥形瓶中，可在步骤 2.13 中重复使用。 - 使用解剖刀将脑组织大体分为六个冠状切片。在小脑尾侧做一切口，小脑中部做一切口，小脑嘴侧做一切口，剩余的前脑部分再做两处切口，形成另外三个厚度相等的冠状切片。
- 使用镊子将脑组织样本转移至培养皿中滤纸的一侧。
- 使用解剖刀将脊髓分为三段：第一刀在肋笼底部切断，第二刀在颈椎弯曲下方稍作切断。
- 使用同一把解剖刀，从尾端修剪骶段脊柱，直至可观察到脊髓。
- 用非惯用手拿起胸段脊柱。用惯用手握住带齿Adson镊子，镊尖闭合，轻轻以旋转动作将镊子尖端推入脊柱较小的一端开口。脊髓应从另一端露出。
注意事项：任何圆形末端、尺寸与脊髓相近的器械均可用于此操作。若脊髓未自然弹出，切勿强行推进。此时可使用精细剪刀沿脊柱侧面剪断骨骼，并将其向外翻开以暴露脊髓。或者，可将脊髓和脑组织在福尔马林中额外固定数日；但所有样本应保持相同的固定时间，以避免抗体染色结果出现变异。 - 用惯用手拿起标准Adson镊子。仍用非惯用手持住脊柱节段，用镊子轻轻将已露出的脊髓从椎管中拉出。将脊髓组织放入含有滤纸的培养皿中。
- 对腰/骶段和颈椎段脊柱部分重复上述操作。
- 使用解剖刀将三段脊髓（颈椎、胸椎、腰/骶椎）进一步切成更小的横截面片段。至少切出15个节段，每个节段厚度应小于2 mm。
注意：确保节段的长度小于其宽度，这有助于在步骤3的包埋过程中使组织切片更容易保持横截面方向。 - 将脊髓片段与脑组织片段一同放置在滤纸的同一侧。将滤纸对折，使组织被夹在中间，然后将此滤纸放入已标记的包埋盒中。
注意：滤纸可防止小块组织在处理过程中从包埋盒中逸出。 - 将包埋盒转移至装有回收或新鲜福尔马林的标本瓶中。
- 对剩余样本重复步骤 2.1–2.13。
- 固定5–7天后，将包埋盒从标本容器中取出，放入自动组织处理机的第一个福尔马林浴槽中（见材料表）。根据补充表1中描述的程序运行组织处理机过夜。样本将在温热的石蜡中保存，直至进行包埋。
3. 脑和脊髓切片的包埋与切片
- 将包埋盒从包埋机转移至石蜡包埋工作站的温控暂存室（参见 材料表).
- 将每只小鼠的脊髓和脑组织横切面共同包埋于同一个石蜡块中，具体步骤如下（图1):
- 首先，倒入石蜡蜡液，使其刚好覆盖模具底部。使用精细镊子将脑部冠状切片和脊髓横切片放入模具底部的石蜡中。
- 将模具转移至冷却表面，保持数秒 用以固定脑和脊髓组织块的位置。将模具移回加热表面，并用热石蜡注满至顶端。
- 将标有样本编号的包埋盒盖置于模具上方。在包埋盒盖上方倒入更多石蜡。将模具转移至冷却台，使石蜡凝固（冷却30–60分钟）。
注意：包埋脊髓切片需要经验。为提高成功率，建议使用较短的脊髓片段（<2 mm），因为较小的组织块更可能处于横切面。可佩戴外科手术放大镜以帮助判断脊髓组织是否处于横切面。 - 将石蜡包埋块安装于旋转式切片机上。修块至目标组织在石蜡切片中显现为止。
- 切取5 µM的切片 的 每个组织块的切片 并转移至 42 °C 水浴锅
- 将切片收集到载玻片上，并将载玻片放入玻璃载玻片架中。
- 在干燥烘箱中于37 °C过夜烘烤切片。染色前将载玻片冷却。
4. 脱蜡及复水组织切片以备染色
注意：所有步骤均在通风橱中进行。开始前，准备好溶剂浴。配制5 L 1×PBS（1 L去离子水）2O, 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4；所有洗涤步骤均使用含 0.05% Tween-20 的磷酸盐缓冲液（PBS-T，pH = 7.4）。
- 将切片置于摇床上的二甲苯或非二甲苯基溶剂中，连续进行两次脱蜡处理，每次5分钟，并轻轻振荡。
- 通过将切片依次转移至浓度递减的乙醇溶液中进行组织再水化：100%乙醇两次（每次5分钟），95%乙醇两次（每次3分钟），70%乙醇一次（3分钟）。如需进行LFB 染色，则将切片保存在95%乙醇中；如需进行免疫组织化学（IHC）染色，则继续再水化至70%乙醇，并将切片保存在PBS-T中。
5. LFB 用于髓鞘的 H 染色&E
- 配制0.1% LFB溶液（0.2 g LFB，参见材料表，200 mL 95%乙醇，0.5 mL冰醋酸）。混合后过滤至锥形瓶中。 避光保存，待用。
- 将切片从95%乙醇转移至置于含LFB染色缸中的玻璃载片架上。盖上染色缸，并用石蜡膜密封以防止蒸发。
- 在56 °C 烘箱中孵育切片过夜（最长16小时）。
- 次日早晨，将载片转移至ddH2O浴中并保持浸泡。
- 同时，配制以下溶液：（1）新鲜的0.05%碳酸锂溶液（0.05 g碳酸锂，100 mL ddH2O）；（2）伊红Y溶液（将2 g伊红染料加入40 mL ddH2O中，搅拌至完全溶解，再与160 mL 95%乙醇混合）。
- 按使用顺序准备以下溶液浴：1次碳酸锂溶液、3次70%乙醇、3次95%乙醇、2次100%乙醇、3次ddH2O。将各溶液浴按顺序排列（参见补充表2）。
- 按照补充表2中列出的步骤进行操作。
- 切片干燥后，在显微镜下观察脱髓鞘病变。
6. LFB 无H髓鞘&E
- 进行此染色程序以分析髓鞘。
注意：该程序与步骤5相同（参见补充表2），但工作流程有所简化。在完成步骤4后，请从步骤10继续操作。
7. 免疫组织化学（IHC）染色的抗原修复与过氧化物酶淬灭
注意：开始前，在通风橱中配制100 mL甲醇中的过氧化氢溶液（1份30%过氧化氢溶液与9份100%甲醇混合）。配制1 L含Tween-20的10 mM柠檬酸盐缓冲液（将2.94 g三水合柠檬酸钠溶解于1 L去离子水中）。20 的烧杯置于搅拌器上，调节 pH 至 6.0，并加入 500 µl 吐温-20）。配制 PBS-T（见步骤 4）。所有洗涤步骤均为 除非另有说明，均在 PBS-T 缓冲液中进行，置于摇床中轻柔振荡。
- 将切片置于含3%过氧化氢的甲醇溶液中15分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性（在通风橱中操作）。随后用PBS-T缓冲液洗涤切片两次，每次2分钟。
- 将切片转移至金属切片架中，并放入盛有1升柠檬酸盐缓冲液的压力锅内。盖紧锅盖，并在蒸汽排放口顶部安装橡胶塞。
- 将压力锅放入微波炉中高火加热，直至压力锅上的黄色指示标弹起，表明已达到最大压力。达到最大压力后继续加热5分钟，然后佩戴防护手套将压力锅从微波炉中取出。
- 通过移除橡胶塞进行减压。 打开锅盖，让切片在柠檬酸盐缓冲液中冷却20分钟，随后进行所需的染色步骤。
警告：释放蒸汽时请退后，以免蒸汽造成烫伤。
8. CD45 免疫组织化学
注意：该免疫组化方法用于可视化浸润性白细胞。亲和素/生物素封闭步骤与封闭及一抗孵育步骤合并进行。
- 配制封闭缓冲液（含2% BSA和2%兔血清的1×PBS溶液）。
- 将切片转移至玻璃切片盒中，用PBS-T洗涤两次（每次2分钟）。配制亲和素/封闭液（在含2% BSA和2%兔血清的1×PBS中加入4滴/mL亲和素，见材料表）。
- 用实验室纸巾吸去组织周围的多余PBS-T。使用疏水笔在组织周围画圈，并将切片放入湿盒中。
- 向每个切片上加入亲和素/封闭液（400 µL/张）。
- 盖好湿盒，在室温下孵育30分钟。 此期间，在含生物素的封闭缓冲液（含4滴/mL生物素、2% BSA和2%兔血清的1×PBS）中配制抗CD45抗体（见补充表3）。
- 用无绒实验室擦拭纸吸去切片上的封闭液，并用擦拭纸轻拍组织周围以去除多余液体。
- 将切片重新放回湿盒中。向每个切片上加入400 μL CD45抗体溶液（见材料表），盖好湿盒，在4 °C下过夜孵育。
- 次日，倾去一抗溶液，用PBS-T洗涤切片3次（每次5分钟）。
- 用无绒实验室擦拭纸吸干切片周围液体，然后向每个切片上加入400 μL二抗（用封闭缓冲液按1:200稀释），在室温下孵育1小时。
- 同时，在5 mL 1×PBS中加入2滴试剂A并混匀，配制ABC试剂（见材料表）；再向同一溶液中加入2滴试剂B并混匀（使用前约30分钟配制）。
- 用3次更换的1×PBS-T洗涤切片（每次5分钟），并将切片放回湿盒中。
- 向切片上加入400 μL ABC试剂。盖好湿盒，在室温下孵育30分钟。
- 用3次更换的1×PBS-T洗涤切片（每次5分钟）。同时，根据厂家说明书，在铝箔包裹的15 mL离心管中配制适量DAB溶液（见材料表）。
- 取一张切片，在显微镜下对准脊髓切片区域。向切片上加入400 μL DAB溶液，并启动计时器。
- 在显色过程中观察切片，当白细胞呈现棕褐色时停止计时。将切片转移至ddH2O浴中终止反应，并在水中保持5分钟。其余切片采用相同的显色时间。
注意： DAB为致癌物。DAB废液及使用后的ddH2O应作为危险废物处理。 - 用Mayer苏木精对切片进行复染约4–10分钟（见补充表2）。用流动自来水冲洗切片10分钟。
- 依次在95%乙醇中脱水（1次，3分钟），然后在无水100%乙醇中脱水（2次，每次3分钟）。
- 转移至通风橱中，将切片浸入二甲苯或二甲苯替代溶剂中5分钟。用封片介质封片，并在通风橱中干燥1–2天。
注意： 若使用二甲苯，封片时应佩戴双层手套并使用镊子操作，因其具有毒性且可溶解手套。 - 用二甲苯清洁切片，并使用切片扫描仪以20倍放大倍数进行扫描。
9. 用于轴突损伤的 SMI-32 免疫组化染色
注意：本实验方案使用小鼠 SMI-32 抗体，该抗体可识别非磷酸化的神经丝重链，后者可在受损轴突中积聚25。由于该抗体由小鼠体内产生且用于检测小鼠抗原，建议使用小鼠抗小鼠（Mouse on Mouse, MOM）试剂盒。在本实验中，亲和素/生物素封闭步骤需独立于一抗孵育步骤进行。在开始本方案前，需按照步骤 4 和步骤 7 的描述进行脱蜡、再水化、淬灭内源性过氧化物酶活性以及抗原修复处理。
- 用 PBS-T 缓冲液（2 × PBS-T）清洗切片两次，每次 2 分钟。用实验室纸巾吸去切片周围的多余液体，并用疏水笔在组织周围画圈。
- 向切片上加入 400 μL 封闭缓冲液（含 2% (w/v) 山羊血清的 1× PBS-T），并加入亲和素（4 滴/mL）。室温孵育 15 分钟。
- 将载玻片在 1× PBS-T 中浸洗两次。向载玻片上加入 400 μL 含生物素（4 滴/mL）的封闭缓冲液，室温孵育 15 分钟。
- 将载玻片在 1× PBS-T 溶液中浸泡清洗 2 分钟。同时，通过将 2 滴储备液（见材料表）加入 2.5 mL 的 1× PBS 中，配制 MOM 封闭试剂。
- 向切片上加入 400 μL MOM 试剂，室温孵育 1 小时。
- 将载玻片在 1× PBS-T 溶液中清洗两次，每次 2 分钟。同时，通过将 300 μL 蛋白浓缩储备液加入 3.75 mL 的 1× PBS 中，配制 MOM 稀释液。
- 向切片上加入 400 μL MOM 稀释液，室温孵育 5 分钟。同时，将 SMI-32 抗体（见材料表）用 MOM 稀释液进行稀释。
- 轻敲去除载玻片上的稀释液，向切片上加入 400 μL SMI-32 抗体溶液。盖上湿盒，室温孵育 30 分钟。
- 将载玻片在 1× PBS-T 溶液中轻轻振荡清洗两次，每次 2 分钟。同时，在稀释液中稀释 MOM 抗小鼠 IgG 工作试剂 （每 2.5 mL 稀释液中加入 10 μL 储备液）。
- 每张载玻片加入 400 μL 抗小鼠 IgG 工作试剂，孵育 10 分钟。
- 将载玻片在 1× PBS-T 溶液中清洗两次，每次 2 分钟。随后按照 CD45 染色方案中的步骤（8.11–8.19）继续染色。
10. 脱髓鞘病变存在的LFB和H&E评分
注意：以下是一种可用于快速评估炎症性脱髓鞘严重程度的分析方法。该分析在脊髓不同节段（至少每个节段包括3个切面，分别为颈段、胸段和腰段）取样进行。可参考小鼠脑图谱数据库（Allen Brain Atlas）中的小鼠脊髓图谱26，以帮助确定脊髓切片的解剖学节段。本分析需要TIFF格式文件。若扫描图像为.czi格式，请参照补充表4中的说明，将czi文件转换为TIFF文件。
- 通过将文件拖放到 ImageJ 中来打开待分析区域的 TIFF 图像。观察脊髓切片的四个象限：背侧、左侧外侧、右侧外侧和腹侧（图 2A，B）。
- 根据 图 2 所示，对每个象限是否存在脱髓鞘病灶进行评分。
注意：若某象限存在病灶，则该象限计 1 分，每张切片最多可得 4 分。即使某一象限内存在多个病灶，也仅计 1 分。 - 将每只小鼠所有得分相加，再除以所检测象限的总数，得到含有软脑膜下病灶的象限比例。
11. 计算脊髓白质中LFB染色的面积分数
注意：该分析用于测量脊髓白质中经LFB染色部分的面积百分比。
- 通过将保存为 TIFF 文件的 LFB 染色切片拖放至 ImageJ 中将其打开。
- 点击 图像 > 类型 > 8 位，生成灰度图像。点击 图像 > 调整 > 阈值。调节底部滑块，使红色覆盖层包含肉眼可见的所有深色区域（髓鞘）（图 2C–E）。点击 应用。
- 点击 分析 > 工具 > ROI 管理器，打开 ROI 管理器。
- 在 ImageJ 工具栏中选择 多边形 绘图工具。该工具允许使用鼠标勾画脊髓的某一区域。
- 勾画脊髓背侧区域，并通过按下键盘上的 t 键将该多边形添加至 ROI 管理器。
- 勾画脊髓白质的前外侧区域，并将该多边形添加至 ROI 管理器。
注意：勾画时应排除大血管、组织撕裂、伪影以及背角附近通常髓鞘化程度较低的区域（图 2A、B 箭头所示）。勾画时应尽可能准确，因包含过多白色背景会扭曲结果。 - 点击 分析 > 设置测量值，并选择 面积分数。
- 在 ROI 管理器中点击 测量。此操作将给出被 LFB 染色区域占所勾画区域的比例。
- 从新生成的结果窗口中复制数值至 Excel，并关闭图像窗口。计算背侧和腹外侧区域染色面积的平均百分比。 将这些值取平均，得到该切片的代表值。
- 对每只小鼠的颈段、胸段和腰段切片重复步骤 11.1–11.9（N = 3/节段/小鼠）。
- 计算每只小鼠所有切片的平均髓鞘面积百分比。脱髓鞘百分比通过用 100 减去染色面积百分比来估算。
12. CD45+ 细胞数量与 SMI-32+ 轴突卵圆形结构的分析
- 将一张经 CD45 或 SMI-32 染色的 TIFF 图像拖放到 ImageJ 中。单击 分析 > 设定比例尺 > 全球 > 好的 设置所有图像的标尺。请注意，此操作仅对第一幅图像进行。
- 选择 多边形 使用鼠标在计算机上选择绘图工具并沿灰质边缘描迹。单击 分析 > 测量 并在 Excel 中将结果记录为“Grey Matter Area”。
- 在图像上保留已绘制的多边形，通过点击移除图像中的灰质 删除 键（键盘）。此操作仅保留白质用于分析。
- 使用以下方法勾勒整个脊髓切片的轮廓 多边形 绘图工具。排除任何缺失或受损的组织区域。
- 点击 分析 > 测量 在Excel文件中记录结果为“总组织面积”。
- 点击 图像 > 颜色 > 颜色解卷积从向量下拉窗口中选择 H DAB将出现三个新窗口——保留呈棕色色调的窗口（DAB通道），删除其他图像窗口。
- 点击 图像 > 调节 > 阈值调整底部滑块以设定图像阈值，使红色覆盖区域与肉眼观察到的棕色染色区域范围一致。单击 应用.
- 点击 过程 > 二元 > 分水岭在此步骤中，比较原始图像与二值图像，以确保两者一致。
- 点击 分析 > 分析颗粒. 选择 显示叠加层 并修改设置：尺寸 = 5 - 150 μm2，圆形度 = 0.4 – 1。点击 好的.
注意：这些设置可将未通过Watershed功能分离的单个细胞和小细胞群包含在分析中，而非将其排除。 - 在结果窗口中，将最左侧列的最后一个数值记录到 Excel 中，该数值代表颗粒总数。然后，计算白质面积（总组织面积 – 灰质面积，单位为 mm²）。2）。以每平方毫米白质区域的总颗粒数表示（颗粒数/mm²）2).
- 对每张保存的 RGB 图像重复上述步骤。待一只小鼠的所有脊髓切片分析完成后，计算每毫米的平均颗粒数2 该小鼠的组织
注意：用于分析脊髓白细胞的工作流程也可应用于脑区。
13. 使用 SIMOA 检测法测量 sNF-L
- 通过隐静脉采血法使用毛细管微量采血管从活体小鼠采集 100–200 μL 血液 通过 使用注射器和25 G针头进行心脏穿刺（终末操作）。对于后者，将血液转移至1.5 mL微量离心管中。
- 在室温下静置血液30–60分钟，使其凝固。
- 以 2660 x g 4 °C 下离心 5 分钟，用移液器将上层液体（血清）转移至 新的微量离心管中。将血清储存于 -80 °C，直至使用。
- 样本准备：将校准品和质控品（NF-light 检测试剂盒，参见 材料表使用前于室温放置1小时，使其升至室温。 将酶底物（RGP）从冰箱中取出，置于30 °C水浴中至少30分钟，每10分钟涡旋振荡一次。
- 将血清样本在冰上解冻。解冻后，轻轻涡旋混匀样本，并在10000 x g 5 分钟，以沉淀任何碎片。
- 加样：将校准品和质控品涡旋混匀。校准品加复孔， 将对照品和血清样本各设两个复孔，加入试剂盒提供的96孔板中。血清样本用试剂盒提供的稀释液按1:3比例稀释。 密封培养板。
- 打开 SIMOA 仪器（参见 材料表按照计算机、程序、然后机器的顺序进行操作。允许机器初始化并运行 开始一天 维持
- 涡旋振荡磁珠30秒。
- 加载试剂 点击屏幕上的标签，双击试剂瓶要放置的架位，然后扫描瓶子的条形码。
- 将磁珠置于摇床架上的振荡位置（位置1–3）。
- 继续将检测器、SBG试剂和RGP试剂加载到仪器中。
- 点击 设置 在软件中，确保样品模式设置为“板式”。在“设置运行”选项卡中，为实验命名。
- 在板上为校准品分配孔位，操作如下：单击孔位，然后选择检测项目。选择 校准 A 然后点击 上升. 高亮显示 A1-8 孔，然后点击 重复实验（2） 为需双份运行的校准品分配坐标。使用完整方案进行运行。
注意：请参考分析证书（制造商网站）以获取每个特定批号校准品的浓度。一旦分配了孔位，在未锁定板之前，离开此界面将导致工作丢失。 - 按照以下步骤分配样本：
- 从屏幕右下角点击 按钮 分配样本。标出样本将要放置的孔位。
- 从列表中勾选要运行的检测，选择重复次数，并指定4倍的上机稀释比例。
- 在仍选中各孔的情况下，输入样本编号的前缀及起始编号，然后点击 生成 为样本生成连续编号。对照样本重复上述步骤。
- 将酶标板放入板架中（A1 至 A12）。
- 在屏幕界面上，单击 完成样本编程 进入系统资源选项卡。检查所有试剂容器是否已装满，废液容器是否为空。
- 点击 运行.
- 运行结束后，在“数据处理”选项卡中选择检测项目和板名称，查看标准曲线。
- 进入“运行历史”并使用筛选器查找最近的一次运行记录。选择 运行 然后 所有结果. 点击 输出，保存 .csv 文件。单击 报告 然后选择 批次校准报告 并选择最近的运行记录。预览报告并导出。
- 运行制造商推荐的每日结束维护程序。关闭程序、关闭仪器，然后关闭计算机。
结果
图3 显示具有代表性的免疫组化和组织化学染色结果，包括急性（左）和较陈旧（右）的EAE病灶。代表性CD45染色以苏木精复染的结果如图所示 图 3A，B. 图3C–F 显示LFB染色的示例，包含（图 3C，D）或不包含（图3E，F) H&E 复染。尽管苏木精对免疫细胞无特异性，但免疫细胞的细胞核染色较深，可与中枢神经系统固有细胞相区分。 图3G，H 显示 SMI-32 的代表性染色结果+ 轴突，用苏木精复染。注意在较老的EAE病灶中该染色的着色增强。
在活动性小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中，有髓神经纤维束的损伤最常发生在脊髓，这是该疾病导致瘫痪的主要原因7,9。因此，在组织学分析中，优先评估脊髓中炎症和组织损伤的存在情况。EAE病灶在脊髓的不同区域（前部、侧部或背侧）（图2A、B）以及不同节段（骶段、腰段、胸段、颈段）随机出现。所描述的包埋方法可确保对整个脊髓中的病灶进行良好取样。包埋的切片数量多于实际分析的数量，因为部分切片可能在处理或切片过程中受损。为确保具有代表性的取样，每只小鼠的脊髓颈段、胸段和腰段各至少分析3个代表性切片。所有样本的身份信息均设为盲法，以确保分析人员在选择代表性切片时不受偏倚影响。
为了快速了解EAE组织学严重程度的差异，可对选定切面的脊髓象限中是否存在软脑膜下脱髓鞘病变进行评分（图2A、B）。这是一种快速的方法，可在扫描图像或光学显微镜下完成。当一组小鼠EAE严重而另一组较轻时，该分析方法足以检测出不同组间EAE组织学严重程度的差异。例如，在 图4 所示实验中，使用MOG p35-55/CFA联合PTX在雌性野生型（WT）小鼠和OGR1基因敲除（OGR1 KO）小鼠中诱导EAE。WT组小鼠出现严重EAE并完全瘫痪，而OGR1基因敲除组则表现为轻度疾病。这种临床评分的差异与存在软脑膜下病变的象限比例差异相对应（图4C）。
在评估脱髓鞘病灶时，结合髓鞘染色的百分面积分数进行评分至关重要，以全面反映自身免疫攻击过程中髓鞘和/或有髓轴突的丢失程度。图4中的示例显示，OGR1小鼠与野生型（WT）小鼠之间的髓鞘百分比面积分数也存在显著差异（图4D）。此外，髓鞘百分比面积分数与患EAE小鼠的累积EAE评分呈显著相关性（图4E），因此可作为评估该疾病整体组织损伤的良好指标。需要注意的是，本方案无法区分髓鞘染色的强度。若需获取染色强度信息，应针对髓鞘蛋白（如蛋白脂质蛋白或髓鞘碱性蛋白）进行免疫荧光染色，并定量分析其染色强度。
如果对照组中EAE病情均较为严重，则脊髓四分之一区域中含有炎性/脱髓鞘病变的比例会更高。此时，对炎症进行评分的一种更敏感方法是计数CD45+细胞的数量+ 每立方毫米白细胞数2 白质（参见代表性染色图 图3A）。此处描述的CD45抗体克隆可检测所有浸润性白细胞，仅偶尔染色在EAE中上调CD45表达的少量小胶质细胞（见空心箭头） 图3B因此可用于有效捕获外周免疫细胞的浸润。
在长期EAE研究（>20天）中，建议同时进行轴突损伤分析。脊髓切片中的SMI-32染色是一种检测受损轴突的敏感方法。尽管脊髓中的炎症会随时间减轻，且幸存的轴突可重新髓鞘化，但存活的轴突仍表现出不同程度的残留损伤9（图3G、H）。例如，在C57BL6/J小鼠的MOG p35-55诱导EAE模型中，轴突损伤和丢失的程度是炎症过程消退后决定临床评分的关键因素9。图5展示了一项EAE实验的结果示例，该实验比较了野生型（WT）小鼠与骨髓细胞系中缺乏一种称为过氧化物酶体增殖物激活受体-δ（PPAR-δ）基因的小鼠（LysMCre: Ppardfl/fl）在雄性和雌性中的表现。在雄性小鼠中，WT组恢复了后肢功能，但LysMCre: Ppardfl/fl组雄性小鼠的临床评分仍保持较高水平。相比之下，在雌性小鼠的实验中，两个实验组在整个观察期间均表现出高评分。初看之下，这一结果提示PPAR-δ在EAE中具有性别特异性作用；然而，脊髓的病理学评分显示，无论雄性还是雌性，LysMCre: Ppardfl/fl组小鼠的轴突损伤均较相应的WT小鼠更为严重（图5B）。在雌性小鼠中未观察到基因型对临床评分的显著影响，可能是因为WT雌性小鼠本身倾向于出现更严重的轴突损伤，从而导致慢性神经功能缺损。
在同一实验中，雌性 LysMCrePpardfl/fl 雌性小鼠的小脑中发现更广泛的T细胞浸润，这为脑部炎症评分在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的应用提供了实例。在EAE中，脑部炎症主要出现在小脑和脑干图6A，D，G），但也可能存在于脑膜中（在海马体下方可见） 图6C），靠近脑室（图6F），以及其他白质纤维束，包括视神经和胼胝体（图6B，E）。通过计数每平方毫米特定脑区（如小脑白质）内的CD45阳性细胞数量，对脑部炎症进行评分。2 使用与脊髓方案中所述相同的方法对组织区域进行取材。在此处概述的取材方法中，于小脑中部进行切割，从而获得如图所示的小脑与脑干的观视角度。 图6A.
使用SIMOA检测方法测量sNF-L已成为评估复发缓解型多发性硬化症（MS）中持续性轴突损伤及治疗反应的有用生物标志物20,21,27,28。用于检测人类sNF-L的同一SIMOA检测试剂盒也可用于测量小鼠sNFL22,23,24。为了探究该检测方法在EAE模型中检测轴突损伤的效果，在EAE实验终点检测了雌性C57BL6/J小鼠的sNF-L水平，并与无EAE的同性别健康对照小鼠进行比较。结果发现，EAE小鼠的sNF-L水平显著高于健康小鼠（图7A），且这些水平与脊髓中SMI-32+轴突的密度呈相关性（图7B）。与组织学评分法评估轴突损伤相比，SIMOA检测更快捷（从小鼠采血到获得结果仅需略超过半天时间），因此可快速反馈治疗在活体小鼠中的效果。该检测方法的另一优势在于其能够反映脊髓和大脑中的轴突损伤情况。
图1：脑和脊髓切片的代表性石蜡包埋块。5个冠状脑切片和脊髓横切片（厚度1.5–2 mm）包埋于同一蜡块中，以便一次性切片。应至少包埋15个脊髓切片，以确保有足够数量的切片可供分析时选择。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：胸段脊髓水平的脑膜炎症评分及髓鞘面积百分比。（A,B）显示了MOG p35-55诱导的EAE雌性C57BL6/J小鼠胸段脊髓的图像，经LFB/H&E染色。图中展示了用于观察四个象限的方法以及脱髓鞘病灶的示例（以虚线勾画）。A图中的小鼠四个象限均存在融合性脱髓鞘病灶（4/4），而B图中的小鼠仅一个象限受累（1/4）。B图中的小鼠其他象限虽存在一定程度的炎症，但尚未形成融合性病灶，因此不予计分。（C–E）LFB图像在ImageJ中转换为灰度图及阈值化处理图像的示例。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：脊髓切片经 CD45、LFB H&E、LFB 及 SMI-32 染色。显示脊髓中早期（A,C,E,G）和晚期（B,D,F,H）软膜下病灶的示例，分别使用 CD45 抗体（A,B）、LFB/H&E（C,D）、单独 LFB（E,F）以及 SMI-32 抗体（G,H）进行染色。黑色箭头指示各相应抗体染色细胞的示例。白色箭头指示被染成 CD45+ 的小胶质细胞样细胞。比例尺 = 50 µm。该图展示了雌性 C57BL6/J 小鼠在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）期间脊髓病灶的代表性染色结果，并突显了不同脊髓节段病理表现的差异。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：EAE中病灶评分与脱髓鞘百分比的应用。 图示为一项EAE实验示例，其中在C57BL6/J遗传背景下缺乏卵巢癌G蛋白偶联受体1（OGR1）基因的雌性小鼠，其临床EAE严重程度低于野生型（WT）C57BL6/J雌性小鼠。通过MOG p35-55/CFA联合PTX免疫诱导EAE，并按以下临床评分标准进行评分：1 = 尾巴麻痹；2 = 后肢和足部无力；3 = 后肢麻痹；4 = 前肢无力；5 = 濒死状态。（A）随时间变化的小鼠平均临床评分±标准误（SEM）。（B）示腰髓腹侧LFB/H&E染色示例。比例尺 = 50 µm。（C）包含脱髓鞘病灶的象限百分比的平均值±SEM。（D）各组脱髓鞘百分比的平均值±SEM。（E）显示了另一项在C57BL6/J小鼠中由MOG p35-55诱导的EAE实验结果，其中每只小鼠的EAE评分在30天观察期内累计，并与脊髓中的脱髓鞘百分比进行相关性分析。相关性分析采用Spearman检验。图（A–D）改编自Souza C等人的研究29。图（E）数据为原始数据。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：应用 SMI-32 染色以理解基因型对实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）临床表型的影响。该图展示了一项 EAE 实验的示例，其中在 C57BL6/J 背景下的雄性和雌性野生型（携带 Ppard 基因的 floxed 等位基因）与髓系特异性 Ppard 突变小鼠（LysMCre: Ppardfl/fl）被 MOG p35-55/CFA 和 PTX 免疫，并持续观察 45 天。（A）显示小鼠的平均临床评分及其标准误（SEM）。（B）显示脊髓中 SMI-32+ 轴突数量、软脑膜下病变所占象限百分比、血管周围套袖现象所占象限百分比以及小脑组织每 mm2 内 CD3 阳性病灶数量的组织学评分结果（均值 ± SEM）。该实验表明基因型对 SMI-32 染色结果具有影响。本图改编自 Drohomyrecky 等人.15。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：雌性C57BL6/J小鼠中由MOG p35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）脑冠状切片中CD45+/苏木精染色的示例。CD45+病灶呈棕色。 （A）冠状切片中脑干内的CD45+ 病灶。比例尺 = 150 μm。（B–G）CD45+ 病灶在视神经（B）、海马下方的脑膜延伸区域（C）、脑干（D）、胼胝体（E）、靠近脑室的内侧缰核（F）以及小脑（G）中的示例。比例尺：（B–G） = 50 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
图7：MOG p35-55诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠血清中sNF-L水平。（A）在一项实验的终点采集雌性对照组和EAE小鼠的血清样本，检测神经丝轻链（NFL）水平。数据采用双尾Mann-Whitney检验进行分析。（****p 值 < 0.0001）。（B）在实验终点获取脊髓组织切片，并使用SMI-32抗体染色。测定每单位白质组织区域内阳性细胞数量，并通过Spearman检验分析其与终点血清NF-L水平的相关性。请点击此处查看该图的放大版本。
补充表1：组织处理中所用浸液的说明。 使用自动处理仪可将包埋盒自动移入这些系列浸液中。请点击此处下载该文件。
补充表2：Luxol快蓝与苏木精-伊红染色步骤。 本表列出了Luxol快蓝与苏木精-伊红染色方案的操作顺序。请点击此处下载该文件。
补充表3：用于免疫组织化学染色的抗体。 本文描述了本方案中所使用的抗体，以及可用于进一步研究炎症、小胶质细胞活化和星形胶质细胞活化的其他抗体。请点击此处下载该文件。
补充表4：如何将.czi文件转换为TIFF文件。 请注意，最好使用高分辨率图像，但如果计算机的工作内存有限，也可以保存中等分辨率的图像。在分析过程中必须使用相同分辨率的图像。此外，请注意该序列中的最后一张图像是载玻片标签，应避免读取标签内容，以确保分析过程处于盲态。30,31 请点击此处下载该文件
讨论
脊髓组织学染色是评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）疾病严重程度的重要工具，特别是在疾病急性期后的恢复阶段，当不同治疗组之间存在疾病恢复程度差异时尤为有用。通过免疫细胞浸润（CD45）、髓鞘（LFB）以及轴突损伤（SMI-32）的染色，有助于阐明小鼠临床评分变化的潜在原因。本文所述的组织学染色方案可反映炎症情况，以及髓鞘和轴突损伤的程度。此外，所示结果验证了血清神经丝轻链（sNF-L）检测作为评估EAE中总体神经元损伤程度的一种方法的可靠性。
该分析的关键参数是确保研究人员对切片的身份信息设盲，并且在不同小鼠的脊髓各节段进行等效取样。这是因为炎症的严重程度在脊髓较低节段可能更为显著。另一个关键参数是实验组的大小。通常在实验终点时，每组需采集6至8只小鼠的脊髓和脑组织，以便检测出治疗干预或基因型效应量较小时组间的显著差异。还需确保所选小鼠的平均评分能够代表整个组的平均分值。关于问题排查，初学者在操作本方案时常遇到的一个问题是脊髓固定时间不足，导致其难以从脊柱中完整挤出。若出现这种情况，可使用精细剪刀沿棘突剪开，手动解剖脊柱并打开椎管以暴露脊髓组织。或者，可将组织额外固定数天，这不会影响抗体染色的效果。本文所述的抗体克隆在经福尔马林固定长达2周的组织中仍可有效工作。
包埋脊髓组织片段需要技巧和练习。建议佩戴眼部放大镜，并将灯光对准包埋工作站，以便更清楚地观察切片是否呈横断面或纵切面。在大体取材时，将脊髓片段的长度控制在2 mm以内，有助于使其呈横断面放置。另一个初学者常遇到的问题是，在过夜孵育过程中Luxol固蓝（LFB）染液蒸发，导致载玻片一半染色、一半未染色。为防止蒸发，玻璃染色缸应先用热塑性封膜密封，再用塑料薄膜包裹。如果发生蒸发且切片染色不均，建议使用碳酸锂将载玻片完全褪色后，重新在LFB中过夜染色。另一个常见问题是，在LFB染色后未彻底褪去灰质的蓝色。在进行后续步骤前，必须在显微镜下仔细检查各个切片，确保灰质褪色程度充分。此外，尽管CD45和SMI-32免疫组化（IHC）染色效果通常稳定，但对于每一批新到的抗体，仍应在预实验中优化抗体浓度。可通过在阳性对照切片（EAE脊髓组织）上测试一系列不同浓度的抗体来完成。首次染色时还应设置阴性对照，即仅加入二抗而不加一抗。最后，在图像分析过程中，对单个图像进行阈值设定至关重要，因为染色在不同载玻片或切片之间可能存在不均一性。
本方案使用免费提供的软件。若无切片机、包埋机或超薄切片机，可将这些步骤委托给提供此类服务的医院病理科核心实验室。此外，若无切片扫描仪，可使用配备视频摄像头的光学显微镜来保存脊髓或脑区的TIFF图像。对于基于显微镜的工作流程，应在低倍镜下（40倍放大）采集Luxol固蓝（LFB）或LFB/苏木精-伊红（H&E）染色切片图像；对于CD45和SMI-32免疫染色，则需至少采集四个视野图像，分别位于脊髓的腹侧、背侧和外侧区域（CD45染色为200倍放大，SMI-32染色为400倍放大）。可对这些图像进行图像分析，以类似本文所述方法定量染色结果。
选择何种组织学方法来评估EAE评分，取决于各组之间临床评分的差异程度。例如，如果EAE临床评分存在显著差异（一组发生EAE而另一组未发生），这通常与外周介导的炎症差异有关。在这种情况下，对LFB/H&E染色切片上的脱髓鞘病灶进行评分已足够，并能揭示组间差异。如果各组在发病时的临床评分较为接近，而主要差异体现在临床恢复程度上（例如图5A中的实验），则最好采用此处所述的完整组织学流程，包括对脑干和小脑中的脑部炎症进行评分，以判断疾病慢性化差异是源于炎症还是组织损伤。 如果通过CD45计数发现炎症存在差异，可进一步开展免疫组化（IHC）研究，对T细胞（抗CD3）、浸润的单核细胞/巨噬细胞（Mac3）以及小胶质细胞（Iba-1/TMEM119）进行染色（推荐的抗体克隆见补充表3）。小胶质细胞的活化表现为双标Iba-1+TMEM-19+ 小胶质细胞中Iba-1染色强度增加，以及小胶质细胞突起的回缩增加，后者可通过Sholl分析在切片上进行评估32。此外，还可应用流式细胞术或单细胞RNA测序等技术，对脑和脊髓中免疫细胞群体的频率和表型进行更深入的表征。
计数 SMI-32+ 轴突是一种检测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）32,33 和多发性硬化症（MS）34 中轴突损伤的敏感方法。SMI-32 可识别神经丝重链或中链的非磷酸化形式，该形式会在被切断的神经元终球中积聚。另一种检测受损轴突的方法是使用淀粉样前体蛋白（APP）进行染色，APP 可因轴突运输受阻而在轴突内积聚33。尽管 SMI-32 和 APP 的染色模式均反映轴突损伤，但二者通常不重叠，表明它们检测的是不同的病理变化33。此外，还可通过检测血清神经丝轻链（sNF-L）来补充组织学对轴突损伤的评估，sNF-L 是评估脊髓和大脑中持续性轴突损伤的一种快速且敏感的指标。该方法的优势在于可在活体小鼠中于半天内完成检测。此方法的缺点是试剂盒价格昂贵，且所需仪器高度专业化。销售 sNF-L 试剂盒的公司为无法获得 SIMOA 仪器的研究者提供付费检测服务。评估轴突损伤的另一种方法是通过计数脊髓组织切片中甲苯胺蓝染色的轴突数量12，或计数脊髓白质区域中由 SMI-31 检测到的神经丝束数量32，以评估轴突丢失情况。这两种方法均比 SMI-32 染色或 sNF-L 检测更为耗时费力。
如果不同组之间的EAE临床评分存在差异，但炎症、脱髓鞘和轴突损伤的评分未能显示组间差异，则可考虑使用GFAP对星形胶质细胞活化进行染色（推荐的抗体克隆见补充表3）。星形胶质细胞活化与GFAP染色增强相关，已有研究表明，在某些EAE模型（包括DA大鼠的慢性EAE模型）中，GFAP染色增强与EAE病情进展相关35。
综上所述，本方案描述了进行实验性自身免疫性脑脊髓炎组织学评分的方法，并提供了一套分析流程。
披露
Shannon Dunn 为中国台湾 FSD Lucid Psycheceuticals 公司提供咨询服务。
致谢
我们感谢斯坦福大学的 Raymond Sobel 博士向我们展示其对脑和脊髓组织进行大体取材和固定的实验方法。我们感谢多伦多表型基因组学中心的 Kyle Roberton 和 Milan Ganguly 教授包埋技术，并为我们切片了大量脑和脊髓组织。我们感谢犹他大学的 Matthew Cussick 博士和 Robert Fujinami 博士分享其用于评估脊髓软脑膜下和血管周围炎症的评分方案。我们感谢 Shalina Ousman 分享 CD45 抗体的克隆。我们感谢 Xiofang Lu 在组织处理仪和组织包埋工作站方面的培训，以及其在圣迈克尔医院生物医学研究 Keenan 研究中心对这些设备的维护。本研究得到了加拿大 MS 协会生物医学基金（资助编号：SED）的支持。Carmen Ucciferri 获得加拿大政府研究生奖学金的支持。Nuria Alvarez-Sanchez 获得 Keenan 博士后奖学金的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 用于固定脊髓和脑组织标本 |
| 1000 mL 玻璃烧杯 | Pyrex | 1000 | |
| 15 mL Falcon 管 | Starstedt | 62.554.100 | 用于脊髓和脑组织的固定与储存 |
| 250 mL 锥形瓶 | Pyrex | 4980 | |
| 500 mL 玻璃烧杯 | Pyrex | 1003 | |
| 92 mm × 16 mm 培养皿 | Starstedt | 82-1473-001 | 用于组织大体检查步骤 |
| 95% 乙醇 | Commercial Alcohols | P016EA95 | 用于脱水和再水化步骤 |
| ABC Elite 试剂盒 | Vector Laboratories | PK6100 | 用于免疫组织化学标记 |
| Aqua Hold 2 防扩散笔 | Cole Parmer | UZ-75955-53 | 用于免疫组织化学染色中在组织切片周围画圈 |
| 亲和素/生物素封闭试剂盒 | Vector Laboratories | SP-2001 | |
| 生物安全柜 | Any | ||
| 生物素化兔抗大鼠 IgG | Vector Laboratories | BA-4000 | 用于 CD45 染色 |
| C57BL/6J 小鼠 | Jackson Laboratory | Stock # 664 | 本研究中所展示实验使用的小鼠品系 |
| 离心机 | Thermo Fisher Scientific | Sorvall ST Plus | |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 04-355-121 | 用于脱蜡，是二甲苯的替代品 |
| DAB 试剂盒 | Vector Laboratories | SK-4100 | 用于免疫组织化学显色 |
| ddH₂O | - | - | |
| 一次性手术刀 | Magna | M92-10 | 用于脊髓和脑组织的大体检查 |
| DWK Life Sciences（Wheaton）玻璃染色缸 | Cole Parmer | UZ-48585-60 | 用于组织化学染色和洗涤 |
| DWK Life Sciences（Wheaton）玻璃染色架 | Cole Parmer | 10061392 | 用于免疫组织化学和组织化学 |
| 伊红 Y | Bioshop | 173772-87-1 | 用于细胞质染色 |
| Feather 切片机刀片 | Fisher Scientific | 12-634-1C | 用于石蜡切片 |
| 滤纸 | Whatman | 1001110 | 用于过滤福尔马林（在大体检查过程中）和Luxol快蓝染液 |
| 精细外科剪刀 | Fine Science Tools | 14160-10 | 用于剪开脑组织和颅骨 |
| 通风橱 | Any | ||
| Gibco DPBS | Fisher Scientific | 14190944 | |
| 冰醋酸 | BioShop | ACE333.4 | 用于Luxol快蓝染色步骤 |
| Histoplex 组织学容器 | Starplex Scientific | 565-060-26 | 用于脊髓和脑组织的固定 |
| 过氧化氢 | Fisher Chemicals | H325-500 | 用于去除组织中的内源性过氧化物酶 |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Kimtech Science Kimwipes 纸巾 | Kimberly Clark Professional | 34155 | 用于免疫组织化学 |
| 镜头纸 | VWR | 52846-001 | 用于在处理过程中将脊髓组织固定在包埋盒内 |
| 光学显微镜 | Any | ||
| 碳酸锂 | Sigma Aldrich | 554-13-3 | Luxol快蓝染色后的褪蓝步骤 |
| Luxol蓝 | Sigma Aldrich | 1328-51-4 | 用于中枢神经系统髓鞘染色 |
| M.O.M 免疫检测试剂盒 | Vector Laboratories | BMK-2202 | 用于SMI-32染色 |
| 甲醇 | Fisher Chemicals | A454.2 | 用于固定 |
| Mayer's 苏木精 | Electron Microscopy Sciences | 26381-02 | 用于细胞核染色 |
| 带齿微型Adson镊 | Fine Science Tools | 11027-12 | 用于解剖过程中翻起颅骨 |
| 微量离心机 | Eppendorf | Model 5417R | |
| Microvette 毛细管 CB 300 Z | Starstedt | 16.440.100 | 用于血液采集 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12545A | 用于封片 |
| 小型摇床 | VWR | 12620-938 | 用于配制缓冲液 |
| NF 光检测试剂盒 | Quanterix | 103186 | 可用于检测小鼠或人血清中的可溶性神经丝蛋白 |
| 丁腈手套 | VWR | 76307-462 | 安全防护 |
| 正常山羊血清 | Vector Laboratories | S-1000 | 封闭试剂 |
| 正常兔血清 | Vector Laboratories | S-5000 | 封闭试剂 |
| OmniSette 组织包埋盒 | Fisher Scientific | M4935FS | 用于脊髓和脑组织的包埋 |
| p1000 移液器及吸头 | various | ||
| p200 移液器及吸头 | various | ||
| 石蜡包埋工作站 | Leica Biosystems | Model EG1160 | |
| Paraplast 组织浸润/包埋介质 | Leica Biosystems | 39601006 | 用于脊髓和脑组织的包埋 |
| Permount 封片介质 | Fisher Chemicals | SP15-100 | 用于将盖玻片封固在载玻片上 |
| pH 计 | Fisher Scientific | 13636AB315B | 用于调节缓冲液的 pH 值 |
| 塑料移液管 | Fisher Scientific | 13-711-20 | 用于调节缓冲液的 pH 值 |
| 氯化钾 | BioShop | 7447-40-7 | 用于配制 PBS |
| 磷酸二氢钾 | BioShop | 7778-77-0 | 用于配制 PBS |
| 高压锅 | Nordic Ware | Tender Cooker | |
| 纯化大鼠抗小鼠 CD45 | Vector Laboratories | 553076 | 用于检测白细胞 |
| 试剂级酒精 100% | VWR | 89370-084 | 用于脱水和再水化步骤 |
| 试剂级酒精 70% | VWR | 64-17-5 | 用于脱水和再水化步骤 |
| 旋转式切片机 | Leica Biosystems | Model RM2235 | |
| Simoa 仪器 | Quanterix | HD-X | |
| 切片扫描仪 | Zeiss | AxioScan.Z1 | |
| SMI-32 小鼠 IgG1 抗体 | Biolegend | 801701 | 用于检测受损的轴突 |
| 氯化钠 | BioShop | 7647-14-5 | 用于配制 PBS |
| 磷酸氢二钠 | Bioshop | 7558-79-4 | 用于配制 PBS |
| 标准 Adson 镊子 | Fine Science Tools | 11150-10 | 用于解剖步骤 |
| Superfrost Plus 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | 用于收集组织切片 |
| 外科耐用剪刀 | Fine Science Tools | 14110-15 | 用于剪开脊柱、体壁和皮肤 |
| 组织处理机 | Leica Biosystems | Model TP1020 | |
| 三水合柠檬酸钠 | Thermo Fisher Scientific | 03-04-6132 | 用于抗原修复 |
| Tween-20 | BioBasic | 9005-64-5 | 用于洗涤切片 |
| X-P Pierce XP-100 板封膜 | Excel Scientific | 12-140 | 用于sNF-L检测 |
| 二甲苯 | Fisher Chemicals | 1330-20-7 | 用于脱蜡和透明化切片 |
| 漏斗 | Cole Parmer | RK-63100-64 | 用于在组织大体检查前过滤福尔马林 |
| 磁力搅拌器 | Any | 用于配制溶液 | |
| 烘箱 | Any | 用于切片后烘烤组织切片 | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | 13-374-10 | 用于密封LFB染色缸 |
| 微波炉 | Any | 处理时间可能因微波炉型号而异 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich | 9048-46-8 | 用于配制封闭缓冲液 |
| 1.5 mL 微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408--129 | 用于储存小鼠血清样本 |
| 涡旋振荡器 | Any | 用于准备sNF-L检测样本 | |
| 水浴锅 | Any | 用于加热sNF-L检测中的酶底物 |
参考文献
- Constantinescu, C. S., Farooqi, N., O'Brien, K., Gran, B. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS). Br J Pharmacol. 164 (4), 1079-1106 (2011).
- Rasouli, J., et al. Expression of GM-CSF in T is increased in multiple sclerosis and suppressed by IFN-beta therapy. J Immunol. 194 (11), 5085-5093 (2015).
- Zrzavy, T., et al. Loss of 'homeostatic' microglia and patterns of their activation in active multiple sclerosis. Brain. 140 (7), 1900-1913 (2017).
- Kutzelnigg, A., Lassmann, H. Pathology of multiple sclerosis and related inflammatory demyelinating diseases. Handb Clin Neurol. 122, 15-58 (2014).
- Glatigny, S., Bettelli, E. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as animal models of multiple sclerosis (MS). Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (11), (2018).
- Kipp, M., Nyamoya, S., Hochstrasser, T., Amor, S. Multiple sclerosis animal models: A clinical and histopathological perspective. Brain Pathol. 27 (2), 123-137 (2017).
- Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
- Croxford, A. L., et al. The cytokine GM-CSF the inflammatory signature of CCR2+ monocytes and licenses autoimmunity. Immunity. 43 (3), 502-514 (2015).
- Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199 (1-2), 83-93 (2008).
- Zuo, M., et al. Age-dependent gray matter demyelination is associated with leptomeningeal neutrophil accumulation. JCI Insight. 7 (12), 158144(2022).
- Bannerman, P. G., et al. Motor neuron pathology in experimental autoimmune encephalomyelitis: Studies in thy1-yfp transgenic mice. Brain. 128, 1877-1886 (2005).
- Cahill, L. S., et al. Aged hind-limb clasping experimental autoimmune encephalomyelitis models aspects of the neurodegenerative process seen in multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (45), 22710-22720 (2019).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1810-1819 (2006).
- Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1 (4), 1952-1960 (2006).
- Drohomyrecky, P. C. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta acts within peripheral myeloid cells to limit the expansion of myelin-reactive T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). J. Immunol. 10, 2588-2601 (2019).
- Osorio-Querejeta, I., et al. The innovative animal monitoring device for experimental autoimmune encephalomyelitis ("I am D EAE"): A more detailed evaluation for improved results. Mult Scler Relat Disord. 63, 103836(2022).
- Wang, C., et al. Induction and diverse assessment indicators of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (187), e63866(2022).
- Shahi, S. K., Freedman, S. N., Dahl, R. A., Karandikar, N. J., Mangalam, A. K. Scoring disease in an animal model of multiple sclerosis using a novel infrared-based automated activity-monitoring system. Sci Rep. 9, 19194(2019).
- Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J Neuropathol Exp Neurol. 12 (4), 400-403 (1953).
- Disanto, G., et al. Serum neurofilament light: A biomarker of neuronal damage in multiple sclerosis. Ann Neurol. 81 (6), 857-870 (2017).
- Novakova, L., et al. Monitoring disease activity in multiple sclerosis using serum neurofilament light protein. Neurology. 89 (22), 2230-2237 (2017).
- Pouzol, L., et al. Act-1004-1239, a first-in-class CXCR7 antagonist with both immunomodulatory and promyelinating effects for the treatment of inflammatory demyelinating diseases. FASEB J. 35 (3), 21431(2021).
- Breakell, T., et al. Obinutuzumab-induced B-cell depletion reduces spinal cord pathology in a CD20 double transgenic mouse model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 21 (18), 6864(2020).
- Aharoni, R., et al. Neuroprotective effect of glatiramer acetate on neurofilament light chain leakage and glutamate excess in an animal model of multiple sclerosis. Int J Mol Sci. 22 (24), 13419(2021).
- Sternberger, L. A., Sternberger, N. H. Monoclonal antibodies distinguish phosphorylated and nonphosphorylated forms of neurofilaments in situ. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (19), 6126-6130 (1983).
- Mouse spinal brain map. , Available from: Https://Mousespinal.Brain-Map.Org/Imageseries/Showref.Html (2023).
- Kuhle, J., et al. Serum neurofilament is associated with progression of brain atrophy and disability in early MS. Neurology. 88 (9), 826-831 (2017).
- Benkert, P., et al. Serum neurofilament light chain for individual prognostication of disease activity in people with multiple sclerosis: A retrospective modelling and validation study. Lancet Neurol. 21 (3), 246-257 (2022).
- D'Souza, C. A., et al. OGR1/GPR68 modulates the severity of experimental autoimmune encephalomyelitis and regulates nitric oxide production by macrophages. PLoS One. 11 (2), 0148439(2016).
- Imagej. , Available from: Https://www.imagej.nih.gov/lj/download.html (2023).
- Openmicroscopy. , Available from: Https://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads (2023).
- Doroshenko, E. R., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-delta deficiency in microglia results in exacerbated axonal injury and tissue loss in experimental autoimmune encephalomyelitis. Front Immunol. 12, 570425(2021).
- Soulika, A. M., et al. Initiation and progression of axonopathy in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci. 29 (47), 14965-14979 (2009).
- Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med. 338 (5), 278-285 (1998).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 223-244 (2017).
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