电子 von Frey 与小鼠面部表情量表联合用于评估异常性疼痛及疼痛反应 Trypanosoma evansi感染的小鼠

摘要

本文介绍了一种利用电子 von Frey 仪评估感染布氏锥虫（Trypanosoma evansi）小鼠伤害感受的实验方案，通过测定后肢足底及内脏的机械痛阈值来实现。

摘要

传染病的发病机制研究仍然是一个复杂的领域。在家畜中可观察到多种临床症状的发展过程，例如异常性疼痛和疼痛。然而，要了解这些症状的发生通路并实施正确治疗，需要开展受控实验，其中许多实验需使用实验动物。测量后肢足底和内脏机械阈值的变化，是观察啮齿类动物疼痛感知变化的一种有效技术。首先可通过基础状态测试测量缩足反应，从而更好地控制实验分组。在诱导感染并加入药物干预后，可进行后续测试。结合使用电子 von Frey 仪器与面部评分量表观察类似疼痛的变化，可实现对小鼠异常性疼痛和疼痛的简单、精确且一致的评估。因此，采用本方法研究Trypanosoma evansi感染，是评估实验感染动物异常性疼痛和疼痛的有效手段，该方法也可应用于家畜常规治疗的相关研究。

引言

Trypanosoma evansi 是南美洲称为“"苏拉病"或“"马瘫病"”的疾病的病原体^1,2。该病常感染马科动物和牛，也可感染野生动物，主要通过吸血蝙蝠、虻类及螫蝇叮咬传播^1,3。苏拉病是家畜中的一种重大疾病，在缺乏正确治疗的情况下可能致死，临床症状无特异性，包括贫血、食欲减退、体重下降、肌肉无力和流产等，症状表现可因宿主种类和地理区域不同而有所差异^2,4,5,6。

在疾病发展过程中，感染动物出现痛觉过敏和疼痛的表现仍是一个较新的研究课题^2,7。深入了解这些症状背后的发病机制，是改进和完善当前治疗方案的重要一步，可通过在经典的抗锥虫治疗方案中添加有效的镇痛药物来实现^5,6。在此背景下，利用小鼠模型复制该疾病具有明显优势，因为小鼠易于在实验室受控环境中饲养，因此相较于在牲畜中进行的田间试验，能够获得更为一致的研究结果。

在大量实验中，通常使用电子 von Frey（EvF）装置来测定机械痛阈，以评估异常性疼痛^2,8,9。该设备用于评估组织对机械刺激的敏感性：当装置通过其连接的 20–200 µL 尖端接触动物足爪时，记录动物回缩足爪所施加的力。

啮齿类动物通常被用作这些实验的标准动物，大多数结果被外推至其他物种，因为大多数被研究的疾病来源于其他物种，而在这些物种中进行受控研究将十分困难。此外，异常性疼痛与疼痛密切相关。使用特定的面部评分量表来评估感染小鼠的疼痛，在证实T. evansi感染过程中疼痛的存在方面具有重要的辅助确认作用^2,10。

在本实验方案中，我们展示了一种新型模型，用于评估实验性感染T. evansi的小鼠的异常性疼痛和疼痛反应，该模型中各变量之间表现出高度相关性，因而证明其为一种可靠的模型。此外，该模型仅需少量研究人员即可完成全部操作，降低了实验过程中人为干扰的可能性。同时，该模型使研究者能够在急性病程中复制目标疾病，并在实验设计中加入多种不同的治疗药物，从而在较短时间内获得一致的结果。

方案

所有实验均使用10周龄的成年雌性Swiss小鼠（35-55 g）进行。动物饲养在聚砜笼具中（每笼3-5只），饲养环境温度控制在（21 ± 1 °C），光照周期为12小时光照/12小时黑暗，可自由摄取标准实验室饲料和水。ad libitum。每次实验每组分配10只动物，以验证药物处理效应的一致性。实验设计已提交并获得圣卡塔琳娜州立大学伦理委员会（CEUA）批准（批准号：6019201123）。所有动物实验均遵循ARRIVE指南（动物研究：in vivo实验报告规范），并按照美国国家研究委员会《实验动物护理与使用指南》进行。

1. Trypanosoma evansi 的制备与接种

警告：处理感染性血液样本、试剂及其他化学化合物时，应穿戴一次性实验服、手套、口罩和护目装备。

1. 开启水浴设备，并将其调节至37 °C的恒定温度。
2. 从超低温冰箱（-80 °C）中取出含有保存血液样本的微量离心管，放入水浴中直至血液完全解冻。
   注意：在不同实验的每组小鼠中，应使用相同的分离株进行感染，以保持血液传代次数一致。
3. 使用含60% D-(+)-葡萄糖的磷酸盐缓冲液（PBS, 0.1 M, pH 7.4）对样本进行连续稀释（体积比10:1），直至每0.1 mL溶液中含有1 × 10⁴个锥虫。在显微镜下使用100倍物镜，通过血球计数板（Neubauer计数室）进行人工细胞计数，以确定寄生虫数量²。
4. 使用连接胰岛素注射器的26 G ½"针头，将0.1 mL稀释后的感染血液溶液（感染组）或等体积的0.9%生理盐水载体（对照组）进行腹腔注射。

2. 电子Von Frey仪器的设置与操作

注意：记录所获得数据时需谨慎。某些EvF设备具有特定程序，可将仪器获取的数据传输至其他电子设备，如计算机、平板电脑或智能手机。

1. 打开EvF仪器。在开始实验前，确保设备已充分充电，观察设备屏幕上显示的电池电量，必要时进行充电。
2. 通过Wi-Fi将EvF仪器连接至选定的电子设备，以传输并保存获得的数据。
3. 将一个10 µL聚丙烯吸头插入EvF仪器的锥形接口中，然后按下带有爪印符号的按钮，将读数归零（0.00 g）。
4. 观察到对被评估组织进行探测后，EvF仪器显示屏上会显示施加的最大压力值。随后，按下带有天线符号的按钮，将该数据传输至选定的电子设备以安全保存。
5. 将读数重新归零，再次按下带有爪印符号的按钮，即可准备进行下一次测量。

3. 机械阈值评估的一般注意事项

1. 所有实验均应在温度控制在 21 °C、具有 12 小时光照/12 小时黑暗循环的安静房间内进行，并确保在每天同一时间进行各项评估，以尊重小鼠的昼夜节律²。
2. 应由同一人完成基线和实验性机械痛阈的评估，以减少偏差并确保测量的一致性；确保实验过程采用盲法。
3. 将每只小鼠轻轻放入由聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）制成的独立观察室中，观察室顶部带孔，底部置于 5 mm² 网格地板支架上^2,8。
4. 在测定基线和实验性机械痛阈之前，让小鼠在 PMMA 观察室内适应环境 30 分钟²。
5. 将网格地板支架放置在便于操作的高度（置于稳固的平面上），以便从各个方向接触动物。确保小鼠的腹部及四肢均能通过网格地板的孔洞方便地接触。
6. 在放置观察室的稳固平面上覆盖吸水材料，以吸收或收集小鼠的排尿和排便。确保实验人员在操作 EvF 装置时，手臂可在观察室下方自由移动。

4. 基线机械痛阈评估及小鼠对刺激的反应

1. 进行腹部测量时，将腹部分为三个虚拟部分（颅侧、中间和尾侧区域）。选择颅侧区域（解剖学上包含肝脏）作为内脏异常性机械痛阈评估的标准靶组织。进行足掌测量时，选择右后足作为标准化部位。
2. 在感染前48小时，对每只小鼠进行基线测量。操作时，将小鼠放入容纳箱中，准备好电子冯弗雷斯特计（EvF）装置，并用双手缓慢抬起探针以刺激目标组织。
3. 逐渐增加对组织的压力，直至小鼠表现出伤害性行为。评估右后足时，观察足部回缩、舔足或四足跳跃^2,8,9；评估内脏反应时，观察腹部急剧回缩、立即舔舐或抓挠受刺激部位，或四足跳跃^2,11。
4. 通过将数据传输至预装特定EvF程序的电子设备或记录在记分本中，保存所获得的数值。将显示屏归零后重复该过程四次，共获得五次测量值⁸。
   NOTE: 仅考虑其中三次相近的测量值以计算平均值²
5. 接着测量相邻箱内小鼠的机械痛阈，直至每只小鼠均完成五次探测，并为每只动物计算出一个平均值。
6. 24小时后重复基线测量，排除平均值低于3.00 g或基线测量间差异大于2.00 g的小鼠^2,8。
   ​NOTE: 每次实验中，每只小鼠必须仅选择一个目标组织进行探测，以避免动物因短时间内接受过多检测而适应刺激。

5. 实验性右后爪及内脏异常性疼痛机械阈值评估

1. 在感染后1小时评估右后爪或内脏异常性机械痛阈值，作为第0天的评价。
2. 在感染后连续5天内，每隔24小时重复一次该操作。
   注意：如果需要给予治疗干预，请在实验设计中选择合适的时间点进行。
3. 测量完成后，将小鼠放回原笼，以防止动物之间相互争斗，并可自由获取标准实验室饲料和饮水 ad libitum。
4. 进行正态性检验，以评估数据的正态分布情况，并对所收集的数据进行相应的统计学分析。

6. 小鼠面部表情量表评估

1. 确保小鼠在容器内时能够被轻松观察到，并在实验前检查每只小鼠，确认其四肢、腹部或面部无任何损伤，且被毛无异常变化。
2. 观察小鼠的眼眶区域。将眼睛睁开分类为无疼痛（评分为0），而明显疼痛可能表现为小鼠闭眼（评分为2）。
3. 观察小鼠的鼻部。将鼻部正常视为无疼痛，而鼻梁处出现隆起则表示存在明显疼痛。
4. 观察小鼠的面颊。将面颊正常视为无疼痛，而双侧面颊均出现隆起则表示存在明显疼痛。
5. 观察小鼠耳朵的位置。将耳朵呈圆形视为无疼痛，而耳朵向外或向后旋转、远离面部并呈尖形，则表示存在明显疼痛。耳朵之间的间距随疼痛评分增加而增大。
6. 观察小鼠的胡须。将胡须保持自然向下弯曲视为无疼痛，而胡须向后紧贴面颊或向前伸展则表示存在明显疼痛。
7. 由于固有行为（如自我理毛）可能干扰面部表情的判断，因此不应将这些行为视为与疼痛相关的行为⁸。在每次动作单元评估前，需等待小鼠停止此类行为。
8. 对数据进行正态性检验，以确认数据是否呈正态分布，并据此对所收集的数据进行进一步适当的统计分析。
   注意：所有实验结束后，通过腹腔注射氯胺酮（90 mg/kg）和赛拉嗪（7.5 mg/kg）对小鼠实施人道安乐死。在确认达到深度麻醉状态后，进行颈椎脱位处死。

结果

通过电子 von Frey 仪器评估感染 T. evansi 后小鼠右后足及内脏组织机械阈值的降低
根据已有 T. evansi 样本的相关数据，实验持续进行5天²。感染组小鼠在感染后第3天开始表现出右后足机械阈值的显著下降，并在随后的2天内持续显著低于对照组（图1A），与未感染小鼠相比差异明显。腹部触觉敏感性的结果类似，感染小鼠在感染后第3天起出现内脏异常性疼痛（内脏痛觉过敏），并在之后2天内机械阈值持续显著低于对照组（图1B）。

图1：实验感染Trypanosoma evansi小鼠的痛觉过敏评估。（A）右后足痛觉过敏和（B）内脏痛觉过敏。数据以每组十只动物的平均值±标准差表示。统计分析：Student's t-检验，每个时间点进行一次非配对分析。星号表示在相同分析时间点下实验组之间的显著差异（p < 0.05）。请点击此处查看该图的高清版本。

小鼠感染T. evansi后疼痛相关面部特征的诱导及通过小鼠面部表情量表进行疼痛评估的数值解读
感染小鼠在感染后第3天开始表现出显著的疼痛相关面部特征，该时间点的平均评分为0.4 [0-1]。在整个实验过程中均观察到类似趋势，感染组与对照组相比呈现显著差异，在感染后第4天和第5天的平均评分分别为0.6 [0-1]和1.3 [0-2]。如预期所示，对照组在小鼠面部表情量表上无评分。采用Student's t-检验进行统计分析，每个时间点分别进行一次非配对分析，以p < 0.05为具有统计学意义。此外，Pearson相关系数（r）揭示了小鼠面部表情量表疼痛评估与右侧后肢痛觉超敏或内脏痛觉超敏之间的相互关系，其值分别为-96.35%和-84.08%。同时，小鼠面部表情量表疼痛评估与右侧后肢痛觉超敏或内脏痛觉超敏之间的决定系数（R²）分别为0.9283和0.7070。

本研究结果与既往数据一致，既往研究已证实T. evansi感染过程中存在炎症和疼痛^2,3,7,12。此外，所描述的方法提供了一种准确识别和测量小鼠异痛感及疼痛的实验方法。进一步地，在感染小鼠中应用小鼠面部表情疼痛评估量表（Mouse Grimace Scale）显示，与右后爪异痛评估结果相比，其负相关系数r值非常高（90%至100%），对于相同动物的内脏异痛评估，其负相关系数r值也较高（70%至89%）¹³。同样，在感染小鼠中使用小鼠面部表情疼痛评估量表时，与右后爪异痛评估结果相比，其R²值表现出极强的相关性（0.90至1.00），对于相同动物的内脏异痛评估，R²值也显示出较强的相关性（0.70至0.89）¹⁴。

讨论

在涉及感染动物的实验中，一个关键步骤是控制寄生虫血症水平。不同品系的T. evansi在小鼠体内可能表现出不同的行为，导致从急性到慢性感染的不同病程^2,4,5,6。此外，感染剂量的变化可能会缩短或延长小鼠的存活时间。因此，建议在正式实验前获得存活曲线，以确定实验的合适周期，并避免因小鼠意外死亡而造成实验中断^15,16。此外，这些数据还可用于确定实验中适用的人道终点。

此外，为了保证血液传代次数相同，实验中所有小鼠必须使用同一菌株进行感染，具体原因见方案部分。同样，可用于感染小鼠的材料可以是冻存或新鲜的感染血液，因为某些冻存样本在水浴解冻后可能失活。然而，新鲜感染血液可能引起更快的寄生虫血症，从而导致更早的死亡事件^17,18。

实验中的修改，例如添加抗锥虫药物或镇痛药物，是可行的。新增实验组意味着需要更多的动物，重要的是要记住，即使是所选药物的对照组，也必须进行基线测量。根据我们的经验，在第二次基线测量后，大约有20-25%的小鼠会被排除在实验之外，这与先前的数据一致⁸。这意味着初始动物数量必须高于实际参与实验的动物数量，当评估的组别增多时，所需小鼠的总数相应增加，这可能成为一个问题。

在此模型中必须考虑药物代谢动力学和药效动力学。某些药物需要较长时间才能发挥其药理作用，这可能会影响实验模型的设计，因为小鼠通常在平均4至5天内死亡^2,6。此外，如果动物在接受所选治疗前需要禁食，则适应期可能是一个需要考虑的重要因素，因为它会影响药物动力学以及实验的时间安排和操作流程，相关说明见本方案部分。

本方法的一个显著改进在于，一名经过良好训练的研究人员即可完成全部EvF读数操作（包括基线和实验测量），同时保持对感染情况或处理措施的盲态。实验开始时的感染操作必须由另一名研究人员执行。但在感染操作完成后，这一要求不再必要，因为EvF仪器配备有特定的von Frey Wi-Fi测量程序，仅允许单人全程操作设备。此外，该方法比传统的细丝von Frey设备更快捷，操作也更简便^8,19。

然而，疲劳可能成为一个问题，因为同一位研究人员必须完成所有动物的检测，经过一段时间的重复操作后可能会产生疲劳感⁸。考虑到感染T. evansi小鼠的预期存活时间，不建议在实验设计中设置过多的组别。根据我们的经验，每次实验平均检测约10只小鼠（具体数量取决于实验设计），可在30分钟内完成。此外，每只小鼠在每次实验中只能选择一个目标组织进行检测，以避免动物对探查操作产生适应性，这一点在实验方案部分已有说明；同时，该做法也有助于降低研究人员产生疲劳的可能性。

此外，EvF（右后爪和内脏测量）和小鼠面部表情评分均需要经过良好训练的研究人员。在开展实验之前，研究者必须经过长时间的练习。为了准确评估小鼠面部表情的变化，研究人员不仅需要了解预期的改变，还必须熟悉普通小鼠的正常面部表情及其正常范围内的变异和行为特征^10,20。此外，为了使用EvF仪器准确评估小鼠的机械阈值，研究人员必须重复多次基线测量，直至能够清晰识别小鼠对探针刺激的反应并达到结果的一致性^2,8。

该实验方案的未来应用包括评估感染T. evansi的小鼠的异常性疼痛和疼痛症状及其治疗方法。本模型使科研人员能够在实验室可控环境中，利用小鼠评估常见于家畜疾病的疼痛相关发病机制。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
26 G 1/2" 针头连接胰岛素注射器	TKL	80288090100	用于向实验动物输注溶液
冯·弗雷镇痛仪配件	INSIGHT	EFF 303	带数字镇痛仪检测支撑装置的限制盒
D-(+)-葡萄糖	SIGMA-ALDRICH	G7021	一种单糖，是生物体以ATP形式获取能量的主要来源
数字镇痛仪	INSIGHT	von Frey Wi-Fi	冯·弗雷Wi-Fi是一种便携式设备，用于评估组织对机械刺激的敏感性
Gilson型10 µL聚丙烯吸头	CRALPLAST	18261	用于电子冯·弗雷装置的聚丙烯吸头，推荐用于后肢异常性疼痛评估
实验室水浴锅	BEING INSTRUMENT	BW-22P	用于将盛装在适当容器中的液体和半固体物质加热至特定温度
磷酸盐缓冲液	SIGMA-ALDRICH	806552	一种平衡盐溶液缓冲液，广泛用于多种细胞培养应用
瑞士小鼠（Mus musculus），雌雄均有	UFSC	Swiss Webster	用于受控实验的实验动物
Trypanosoma evansi冷冻保存样本	UDESC	-	用于感染所有小鼠的样本，由血源性寄生虫与媒介生物化学实验室提供
通用型10 µL聚丙烯吸头	CRALPLAST	18171	用于电子冯·弗雷装置的聚丙烯吸头，推荐用于内脏异常性疼痛评估