本文详细描述了一种优化的接种方案，该方案利用分离的玉米叶鞘进行可重复的细胞学、生理学和分子水平研究，以分析玉米与真菌植物病原体之间的互作。叶鞘有助于在未固定的组织中实时观察活体植物与真菌之间的细胞相互作用。
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本文内容
摘要
摘要
我们优化了一种在玉米叶鞘上接种兼性生物营养和坏死营养型叶部致病真菌的实验方案。该方法改编自最初应用于水稻叶鞘的接种技术，可实现对活体植物细胞内真菌生长与发育过程的直接显微观察。取具有两个完全展开叶环的玉米幼苗叶鞘，用20 µL、浓度为5 x 10⁶孢子/mL的孢子悬液滴注接种，在28°C、相对湿度>95%的黑暗条件下共培养3天。接种后不同时间点取样，经台盼蓝乳酸酚棉蓝染色后封片，利用亮场或微分干涉相差显微镜观察真菌侵染结构、菌丝扩展及宿主细胞反应。该方法避免了叶片表面蜡质层和气孔开闭对侵染过程的干扰，提高了图像清晰度与实验重复性，适用于研究玉米与叶部真菌病原体之间的互作机制。 关键词：玉米，叶鞘接种，兼性生物营养真菌，坏死营养真菌，活体显微观察，真菌侵染，宿主-病原互作5 孢子/mL真菌孢子悬浮液，置于23 °C、持续荧光光照的保湿培养箱中孵育。24–72小时后，用剃刀片去除多余组织，仅保留单层表皮细胞，获得光学透明的样品，可直接成像，无需化学固定或透明处理。在整个实验过程中，植物和真菌细胞均保持活性，可实时观察二者间的相互作用。可通过染色或质壁分离处理叶鞘，以研究侵染和定殖过程中寄主与病原菌细胞的发育细胞学特征及细胞活性。表达荧光蛋白的真菌菌株可单独或混合接种于叶鞘上，以提高分辨率，并便于评估菌株间的竞争性或协同性相互作用。表达荧光融合蛋白的真菌菌株可用于追踪并定量分析这些特定蛋白的生成及其亚细胞定位 在植株中接种后的叶鞘组织可用于提取核酸、蛋白质或代谢物。这些叶鞘检测方法的应用极大地推动了对玉米中真菌致病机制的深入研究，以及对参与致病性的真菌蛋白效应子和次级代谢产物的研究。
引言
在细胞水平上进行空间和时间分析对于理解真菌-植物相互作用的生理学和细胞学至关重要。以往的研究曾使用化学固定1,2,3或透明染色4的叶片组织以及人工膜5来研究叶部病原菌发育及植物-真菌相互作用的细胞学过程。然而，由于在制备光学透明样品以进行成像时存在技术难题，对活体寄主组织中侵染过程进行实时观察（无需固定或透明处理）仍然具有挑战性。
20世纪40年代末，为在明场显微镜下研究活体水稻表皮细胞对稻瘟病菌Magnaporthe oryza6的抗性，建立了一种离体叶鞘接种方法。近年来，通过将该叶鞘方法的改良版本与表达荧光蛋白的真菌转化子相结合，并辅以包括落射荧光显微镜和共聚焦显微镜在内的高性能活细胞成像技术，极大地促进了对Colletotrichum和Magnaporthe属真菌侵染寄主过程的分子、生理及细胞学层面的详细观察7,8,9....
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方案
注意：该方法的工作流程见图1。
图 1：使用离体玉米叶鞘优化接种方案的步骤。 孢子悬浮液制备、叶鞘接种以及活细胞显微镜样品制备分别用绿色（A）、紫色（B）和橙色（C）方框标出。图片由 BioRender.com 生成。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 植物与真菌材料
- 植物生长
- 在温室中种植玉米幼苗（见材料表），光照/温度条件为14小时光....
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结果
以下示例描述了采用玉米叶片鞘接种方法后获得的代表性结果。这些示例展示了利用该优化检测方法实时观察和比较玉米-真菌互作过程的简便性、快速性和精确性。活细胞成像还可提取定量信息，为比较性的分子、细胞学和生理学研究提供了有力工具。各项成功应用的更多详细信息可参见所引用的原始文献。
示例数据1：利用染色和质壁分离方法对接种后的玉米叶鞘进行染色，以评估真菌状态并检测植物对真菌侵染的响应
玉米叶鞘已被用于在活体寄主细胞中通过明场显微镜观察并比较Colletotrichum graminicola和Stenocarpella maydis的侵染过程，从而能够详细描述其定殖模式和时间进程（未发表结果；图6）。
这些研究结果表明 S. maydis 通过未分化的菌丝膨大直接快速侵入表皮细胞，不同于 C. graminicola 产生黑色素化的附着胞。进入表皮细胞后，两种.......
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讨论
此处所述的优化版叶鞘接种方法源自最初为水稻叶鞘开发并应用的原始实验方案6,8,36它能够利用宽场或共聚焦显微镜对活体植物细胞中真菌的生长与发育进行直接、详细的观察。该实验方案适用于在玉米定殖过程中对多种微观现象进行表征、比较和定量分析，包括相容性与非相容性互作期间的真菌发育情况及寄主响应，以及特定真菌蛋白的产生与分泌 在植株中；以及玉米与真菌互作过程中产生的常见或新型致病因子的细胞学与生物化学特性。我们已将该方法应用于玉米的半活体营养型和坏死营养型病原菌。尽管尚未尝试用活体营养型病原菌（如锈菌）进行接种，但由于叶鞘在实验期间保持存活状态，因此该方法也适用于此类病原菌的研究。此外，我们还将该方法应用于高粱叶鞘，以研究寄主和品种特异性抗性的细胞学特征7,37对于高粱叶鞘，该方案的唯一调整是将孢子悬浮液注满整个叶鞘，而不是仅.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益，也无任何需要披露的内容。
致谢
作者感谢美国农业部-国家食品与农业基金会（USDA-NIFA）提供的经费支持（项目编号 2018-67013-28489 和 2020-70410-32901）。本手稿中表达的任何观点、发现、结论或建议均仅代表作者的观点，不一定反映美国农业部的立场。我们感谢来自巴西“科学无国界”项目的访问学生 Mayara de Silva 提供了 图6A 和 图7D 中的图像。同时感谢肯塔基大学植物病理学系提供使用奥林巴斯共聚焦显微镜的机会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Axiocam 单色显微镜相机 | ZEISS | 426560-9010-000 | 与 Axioplan 2 显微镜兼容；提供低读出噪声和高速性能，适用于活细胞成像 |
| Axioplan 2 落射荧光显微镜 | ZEISS | N/A | 允许实时观察以及图像/视频采集 生物样品 |
| 台式离心机 24 × 1.5/2 mL | Thermo Fisher Scientific | 75002431 | Sorvall Legend Micro 17；最大转速：13,300 rpm（17,000 × g） |
| 带盖 Falcon 细菌培养用培养皿 | Fisher Scientific | 08-757-105 | 聚苯乙烯材质；疏水表面 |
| 滤纸 | Fisher Scientific | 09-920-115 | Whatman 1 号级，用于培养皿湿润室 |
| FV 3000 激光扫描共聚焦显微镜 | Olympus | N/A | 用于真菌转化子的可视化' |
| 发芽纸 | Anchor Paper Co. | SD7615L | 76# 高克重，用于塑料盒湿润室 |
| 玻璃培养皿 | VWR International | 75845-542 | 1 类 A 级，33 膨胀系数硼硅酸盐玻璃； 完整套装（盖子 + 底部），用于培养皿湿润室 |
| 玻璃棉 | Ohio Valley Specialty Chemical | 3350 | 用于玻璃棉过滤装置 |
| 血细胞计数板/Neubauer 计数室及盖玻片 | VWR International | 15170-172 | 计数室深度 0.1 mm；配有两片 0.4 mm 厚盖玻片 |
| 显微镜盖玻片 | Fisher Scientific | 12-553-457 | 硼硅酸盐玻璃；每包 100 片；22 mm 长，22 mm 宽 |
| 玉米品种 Golden Jubilee 种子 | West Coast Seeds Ltd., Delta, BC, Canada | CN361 | 成熟期 为 95–105 天；种子类型：F1 |
| 微量离心管 | USA Scientific | 1415-2500 | 容量 1.5 mL |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-123 | Superfrost 白边载玻片；76 mm 长，25 mm 宽 |
| 燕麦培养基（OA） | VWR International | 255210 | Difco 燕麦培养基，BD；500 g |
| 透明指甲油 | Revlon | 43671 | 用于密封显微镜载玻片的透明指甲油；色号 771 Clear |
| 无裙边 96 孔 PCR 板 | USA Sientific | 1402-9500 | 板体积 100 μL |
| 微量离心管研磨杵 | USA Scientific | 1415-5390 | 锥形尖端；聚丙烯材质 |
| PlanApo 60X/1.00 WLSM 水镜物镜 | Olympus | 1-UB933 | 与 Olympus FV 3000 共聚焦显微镜兼容 |
| 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA） | VWR International | 90000-758 | Difco 马铃薯葡萄糖培养基，BD；500 g |
| Pro-Mix BX | Premium Horticulture Supply Co. | N/A | 优质通用型栽培基质，配方设计可提供 良好的保水性与适当的排水性能 |
| SC10 圆锥形容器 | Greenhouse Megastore | CN-SS-SC-10B | 直径 1.5 英寸，深度 8.25 英寸，容积 164 mL |
| SC10 圆锥形容器托盘 | Greenhouse Megastore | CN-SS-SCTR98 | 24 英寸长 × 12 英寸宽 × 6.75 英寸高；最多可容纳 98 个 SC10 圆锥形容器 |
| 单刃剃须刀片 | Thermo Fisher Scientific | 17-989-145 | AccuTec 刀片；钢制材质；刀片长度 38 mm |
| 带扣盖储存容器/盒 | Target | 002-02-0405 | 透明可视储存盒，用于湿润室； 外部尺寸：23 5/8 英寸 × 16 3/8 英寸 × 6 1/2 英寸；容量 32 夸脱 |
参考文献
- Cheng, Y., Yao, J., Zhang, H., Huang, L., Kang, Z. Cytological and molecular analysis of nonhost resistance in rice to wheat powdery mildew and leaf rust pathogens. Protoplasma. 252 (4), 1167-1179 (2015).
- Hickey, E. L., Coffey, M. D.
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重印与许可
