兔膝骨关节炎模型中的推拿干预

摘要

本方案描述了一种在膝骨关节炎兔模型中进行推拿干预的方法。

摘要

膝骨关节炎（KOA）主要表现为膝关节软骨及周围软组织的退行性改变。推拿治疗KOA的有效性已得到证实，但其潜在机制仍需进一步研究。本研究旨在建立一种科学可行的推拿治疗KOA兔模型，以揭示其作用机制。实验选用18只6月龄正常级雄性新西兰兔，随机分为假手术组、模型组和推拿组，每组6只。通过向膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液建立KOA模型。推拿组采用推拿手法结合膝关节旋转矫正法干预4周，假手术组和模型组仅进行标准抓握和固定操作。干预1周后，观察膝关节活动范围（ROM），并进行软骨组织苏木精-伊红（HE）染色。研究结果显示，推拿可抑制软骨细胞凋亡，修复软骨组织，并恢复膝关节ROM。综上所述，本研究证实了推拿治疗KOA模型兔的科学可行性，凸显其在KOA及相关膝关节疾病研究中的潜在应用价值。

引言

膝骨关节炎（KOA）是一种膝关节的退行性疾病，主要表现为膝关节疼痛、肿胀、变形和活动受限，致残率高，在女性中更为常见。2019年全球骨关节炎患者达5.2781亿人，其中膝骨关节炎占全球骨关节炎总患病率的60.6%¹。临床上，KOA的治疗通常分为非手术治疗和手术治疗。非手术治疗包括物理治疗、药物治疗以及富血小板血浆注射治疗^2,3。推拿是中医中一种常见、安全、可靠且有效的治疗方法。本研究采用推拿结合膝关节旋转矫正法治疗膝骨关节炎。其中，旋转揉按等推拿手法可调节肌肉组织平衡、减轻疼痛、调节炎症因子水平、改善组织代谢，并抑制关节软骨退变^4,5。膝关节旋转矫正法可调整下肢骨与关节的力线排列，改善膝关节间隙，恢复正常的力学传导线，平衡下肢生物力学状态^6,7,8,9。抗阻训练可增加肌肉质量和力量，促进软骨组织更新^10,11。一项初步研究表明，该推拿方案治疗膝骨关节炎的疗效显著优于口服硫酸氨基葡萄糖胶囊，起效更快，并能显著抑制软骨细胞退变，修复受损软骨组织¹²。在膝骨关节炎治疗中，与推拿疗法相比，非甾体抗炎药存在不良反应且长期疗效不理想，手术治疗则具有相对较高的风险和费用，需严格掌握适应证，且术后可能出现相关问题及假体周围并发症^13,14,15。相较于药物治疗和手术治疗，推拿治疗膝骨关节炎具有副作用少、风险低、安全性高、经济实惠以及疗效持久等优势。此外，还可有效缓解膝关节疼痛、肿胀、弹响及活动受限等症状^6,13,16,17。

然而，推拿治疗膝骨关节炎（KOA）的作用机制尚需阐明，这限制了KOA治疗方案的改进与完善。因此，通过动物实验研究推拿干预KOA的机制是一种有效的方法。相较于大鼠，兔子性情温顺，膝关节较大，其解剖结构和软骨生化指标与人类相似，是研究推拿治疗膝关节疾病机制的适宜实验对象¹⁸。通过向兔膝关节腔内注射木瓜蛋白酶建立的KOA模型具有造模时间短、创伤小、成功率高、存活率高以及病理机制与KOA相似等优点¹⁹。本研究旨在建立一种科学可行的推拿干预KOA的动物实验方案，并探讨推拿的作用机制。

方案

本研究经山东中医药大学附属医院伦理委员会批准（批准号：2020-29）。

1. 实验动物

1. 将18只6月龄正常级别的雄性新西兰兔（体重2.75 ± 0.25 kg）饲养于标准单笼中（12小时光照/12小时黑暗循环，温度20–24 °C，空气湿度40%–60%）。

2. 分组方法

1. 采用随机数字法从18只新西兰兔中选取6只作为假手术组，其余12只分配至造模组。
2. 成功造模后，采用随机数字法将造模组兔子分为模型组和推拿组，每组各6只。
3. 对推拿组实施推拿干预；假手术组和模型组进行相同的抓握与固定操作，但不实施推拿。每隔一天操作一次，持续4周（图1）。

3. 建立骨关节炎模型

1. 第1周在标准条件下对兔子进行适应性喂养。自由饮水和进食。将兔子置于右侧卧位，放入兔固定箱中，每日安抚15分钟。将兔子头部固定在头固定板上，安装固定板和螺钉，确保兔子无法移动。在抓取和固定兔子时佩戴防护手套（图1）。
2. 第2周的第1、4、7天， 将全部18只兔子以右侧卧位放入兔固定箱中 （图1）。 执行以下操作。
3. 通过兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1 ml/kg）。使用动物专用剃毛器剃除兔左膝关节处毛发，使暴露皮肤无毛。
4. 使用医用碘伏和75%酒精由内向外对兔左膝关节进行消毒（图2A）。
5. 将兔左膝关节屈曲至60°。从外膝眼（Waixiyan）进针（22G，0.7 mm × 30 mm），向造模组膝关节腔内注射4%木瓜蛋白酶溶液（0.1 mL/kg，平均2.5 kg动物注射0.275 mL ）。向假手术组注射等量0.9%氯化钠溶液。该剂量动物耐受良好，无疼痛或痛苦表现（图2B）。
   注：外膝眼（EX-LE5）位于髌韧带外侧隐窝，内膝眼（EX-LE4）位于髌韧带内侧隐窝^20,21,22。
6. 按压针孔2分钟，防止溶液外溢。
7. 双手分别置于兔左膝关节上下方，在生理活动范围（ROM）内轻柔被动地屈伸膝关节10次，使溶液均匀渗入膝关节腔¹⁵。造模期间每8小时观察一次兔子状态。当兔子出现躲藏、肢体颤抖、呼吸浅快，甚至咬人或抓挠等表现时，给予缓释布托啡诺（buprenorphine SR，0.18 mg/kg）。
8. 第7周时，观察兔左膝关节呈屈曲状态，表现为肿胀，膝周肌肉张力增高，伴有结节和条纹，局部疼痛刺激反应增强，膝关节活动范围（ROM）减小，步态跛行，重心偏向健侧。以上表现表明膝骨关节炎（KOA）模型建立成功（图1，图2C）^23,24。

4. 推拿手法

1. 在进行推拿操作前，使用推拿手法参数测定仪进行训练。由同一名专业人员每天训练1小时，持续1个月。
   1. 在推拿手法模拟平台上，以拇指施加5 N的力、频率为60次/min，进行旋转揉按法操作（图3A，C）。
   2. 通过推拿手法参数处理软件分析X、Y、Z三个方向的受力情况，并查看屏幕上显示的力的大小、频率及作用时间（图3B，D）。
   3. 在训练过程中，利用软件评估推拿手法的力学参数并实现手法标准化。保持标准化的拇指旋转揉按法，施力为5 N，频率为60次/min，持续操作时间为10 min。标准化定量手法波形见图3B，D^25，26，27。
2. 将兔置于兔固定箱内，右侧卧位。轻抚兔体10 s，以安抚和放松兔子²¹，随后进行推拿干预。
3. 以拇指在兔左侧膝周肌肉僵硬处、肌腱结节及髌骨部位实施旋转揉按法，上下往返操作，施力为5 N，频率为60次/min，持续5 min。
4. 以拇指指端按压阳陵泉（GB 34）、阴陵泉（SP 9）、外膝眼（EX-LE5）、内膝眼（EX-LE4）、鹤顶（EX-LE2）、血海（SP 10）、梁丘（ST 34）和委中（BL 40）^20，21，22，施力为5 N，频率为60次/min，每穴操作30 s。
5. 对兔膝关节实施旋转矫正法，每只动物在组内分别重复操作3次。
   1. 一手固定股骨。另一手先置于膝关节后方，再以拇指和无名指分别固定胫骨外侧和内侧髁，食指和中指固定腘窝部，施加牵拉和扭转力。
   2. 一手固定股骨。另一手以拇指和小指分别固定髌骨内、外侧缘，食指、中指和无名指固定髌骨基底部，施加扭转力。
   3. 保持牵拉力方向与胫骨长轴平行，扭转力方向与下膝眼方向一致。用手指固定皮肤位置，避免皮肤与手指之间产生摩擦。

5. 膝关节活动范围的测量

注意：测量前需使兔子保持安静状态。测量人员与操作人员应为不同个体。

1. 在实验开始时及每周结束时，测量各组兔子左膝关节的活动度。
2. 将兔子置于右侧卧位，放入兔固定盒中，并用一只手固定其左股骨。
3. 将医用关节角度计的圆心与兔子左膝关节外侧中心对齐。伸展固定臂，使其与圆心至大转子连线的延长线平行；伸展活动臂，使其与胫骨的长轴平行。
4. 将另一只手置于胫骨长轴上，距离膝关节约 9 cm 处，以约 3°/s²⁸ 的角速度手动施加约 750–850 g 的扭矩。
5. 持续操作直至兔子膝关节不再移动，记录关节停止移动时角度计显示的度数，即为膝关节活动范围（ROM）。读数时应确保视线与刻度盘表面垂直。
6. 对每侧膝关节重复测量 3 次，取平均值作为最终结果²⁸。

6. 苏木精-伊红（HE）染色

1. 样本采集
   1. 在干预结束前1周（图1），将兔置于兔固定盒中右侧卧位（兔子侧卧于右侧时更易保持放松状态）。通过耳缘静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg）实施人道安乐死^29,30。
   2. 使用手术刀、剪刀和止血钳迅速打开左侧膝关节腔，去除附着在股骨远端软骨周围的软组织。
   3. 用咬合钳取约1 cm × 1 cm大小的股骨远端软骨-骨标本，置于生理盐水中清洗。
2. 固定与脱钙
   1. 将软骨置于4%多聚甲醛溶液中固定72小时。
   2. 流水冲洗12小时。使用乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙液脱钙6周，每3天更换一次EDTA脱钙液。当骨组织变软、富有弹性，易于弯曲，并能被针头顺利穿刺时，判定脱钙终点已达到³¹。
3. 包埋切片的脱水
   1. 将标本放入自动脱水机中进行脱水处理。
   2. 将浸蜡修整后的组织置于盛有熔化石蜡的方形容器底部，持续1小时。随后放入冷却烘箱中冷却并凝固成硬块。使用切片机将石蜡包埋组织块切成4 µm厚的切片。
   3. 在展片机中将切片展开，转移至防脱载玻片上，编号后使用切片烘烤仪和烘箱干燥。
4. 脱蜡与水化
   1. 将切片在65 °C条件下烘烤60分钟。
   2. 将切片浸入二甲苯中7分钟，随后再用新鲜二甲苯重复浸泡两次，每次7分钟。
   3. 将切片浸入无水乙醇中5分钟，随后依次在95%乙醇、85%乙醇和75%乙醇中各浸泡2分钟。
   4. 将切片浸入蒸馏水中2分钟。
5. 苏木精染色：将切片用苏木精染色20秒。用流水冲洗切片。将切片浸入盐酸乙醇分化液中3秒。用自来水冲洗切片5分钟。
6. 伊红复染：将切片用伊红染色30秒。用自来水冲洗切片。
7. 样本透明化脱水
   1. 将切片先后两次浸入95%乙醇中，每次3秒，随后浸入无水乙醇中3秒。
   2. 再次将切片浸入无水乙醇中1分钟，随后用二甲苯洗涤两次，每次1分钟。
8. 切片封片：取出切片，滴加中性树胶封固剂，加盖盖玻片，并置于通风橱中干燥至无味。
9. 样本拍照：在光学显微镜100倍视野下观察并拍照。
10. 评估：采用Mankin评分法对各组软骨组织进行评估³²。

7. 数据分析

1. 使用分析软件对实验数据进行统计学分析。当数据符合正态分布时，采用t检验比较两组样本，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多组样本。
2. 结果以均值 ± 标准差（SD）表示。使用商业软件绘制统计图表。当p < 0.05时，差异具有统计学显著性。

结果

膝关节活动受限程度和软骨组织损伤程度反映了膝骨关节炎（KOA）的严重性。膝关节活动范围（ROM）反映了膝关节活动受限的程度。膝关节ROM越小，表明膝关节活动受限越严重；反之，膝关节ROM越大，则膝关节活动越接近正常。通过苏木精-伊红（HE）染色观察软骨组织的形态与结构，可反映软骨组织损伤程度。软骨组织表面越不规则，裂隙和缺损越多，软骨细胞数量越少，软骨层厚度越薄，细胞排列越紊乱，细胞分布越不均匀，层次越不清晰，潮线越模糊、越不完整，Mankin评分越高，则膝关节软骨组织损伤越严重；反之，则软骨组织越接近正常³²。在建立KOA模型时，可通过观察兔膝关节活动受限的程度来判断造模是否成功^23,24。当对兔膝关节进行推拿干预时，通过观察膝关节活动受限程度及软骨组织损伤程度的改善情况，可评估推拿的疗效¹²。

第7周后，比较两组兔子的左膝关节发现，造模组肌肉更僵硬，活动受限，关节活动...

讨论

实验方案的设计对于研究推拿治疗膝骨关节炎（KOA）的机制尤为重要。通过在兔的外膝眼处注射木瓜蛋白酶建立KOA模型。外膝眼位于髌韧带外侧隐窝，位置易于定位，且在膝关节屈曲时此处股骨与胫骨之间的关节间隙较大，便于将药物注入膝关节腔，同时可避免损伤周围组织，因此易于成功建立KOA模型³⁴。在对KOA模型兔进行推拿干预时，需将模型兔适当固定以利于推拿操作。将兔置于固定箱中，使其健侧卧位，头部固定，并安抚其情绪，使其全身放松，避免挣扎。为标准化推拿的力度与频率，提高推拿干预的一致性，推拿操作由经过严格推拿手法训练的操作者完成，并借助推拿手法参数测定仪对操作过程进行控制。

本方案的关键步骤是采用推拿结合膝关节旋转矫正法治疗膝骨关节炎（KOA）。操作前，从兔患侧下肢的髋部至踝部进行触诊，重点检查膝关节周围区域，探查肌腱结节和肌肉僵硬情况，然后屈伸膝关节，观察内膝眼和外膝眼的高度，以实现精准的推拿操作。旋转揉压法可缓解肌肉紧张与痉挛，改善膝关节局部血液循环，促进炎性物质代谢，减轻肿胀和疼痛^35...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液	Sichuan Keren Pharmaceutical Co.	Z22121903
-20°C 冰箱	Haier	BD-328WL
4% 固定液	Solarbio	P1110
4°C 冰箱	Haier	SC-315DS
无水乙醇	Sinopharm
自动组织脱水机	Dakowei (Shenzhen) Medical Equipment Co.	HP30
鼓风干燥箱	上海一恒科学仪器有限公司	DHG-9070A
盖玻片	碧云天	FCGF50
电热恒温水浴锅	上海一恒科学仪器有限公司	HWS-26
包埋冷冻台	常州派士杰医疗设备有限公司	BM450
包埋机	常州派士杰医疗设备有限公司	BM450A
乙二胺四乙酸脱钙液	Servicebio	G1105-500ML
荧光倒置显微镜	Leica	Leica DM IL LED
苏木精-伊红染色试剂盒	Cisco Jet	EE0012
盐酸	莱阳经济技术开发区精细化工厂
医用关节角度计	KOSLO
中性树胶	Cisco Jet	EE0013
普通级雄性新西兰兔	济南西岭角养殖繁育中心	SCXK (鲁) 2020 0004
木瓜蛋白酶（3000 U/mg）	Bioss	D10366
病理组织漂白干燥仪	常州派士杰医疗设备有限公司	PH60
宠物电动剪毛器	Codos	CP-3180
兔固定箱	任意品牌
轮转切片机	Leica	531CM-Y43
推拿手法参数测定仪	上海杜康仪器设备有限公司	ZTC-
呼吸机	TALY ELECTRIC	C32
二甲苯	富宇试剂