本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）强大的遗传工具，该方案可显著促进针对神经系统中微管网络调控蛋白功能的遗传筛选和微管动力学分析。
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摘要
摘要
微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调控蛋白的突变与神经发育障碍及神经系统疾病相关，例如微管相关蛋白Tau与神经退行性疾病相关，微管剪切蛋白Spastin和Katanin 60分别导致遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。在神经元中检测微管网络有助于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，由于神经元体积较小，且轴突中的微管束排列密集，使得微管网络的可视化具有挑战性。本研究描述了一种分离幼虫神经肌肉接头和肌细胞的方法，并通过α-tubulin和微管相关蛋白Futsch的免疫染色来可视化微管网络 黑腹果蝇神经肌肉接头使我们能够同时观察到突触前和突触后的微管，且由于肌细胞体积较大， 黑腹果蝇 幼虫能够清晰地显示微管网络。此处，通过突变和过表达 Katanin 60 在 黑腹果蝇, 然后检测神经肌肉接头和肌细胞中的微管网络，我们 准确揭示Katanin 60在神经发育中的调控作用。因此，结合强大的遗传学工具 果蝇 黑腹果蝇该方案极大地促进了针对微管网络调控蛋白在神经系统中作用的遗传筛选和微管动态分析。
引言
微管（MTs）作为细胞骨架的结构组分之一，在多种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞分裂、细胞生长与运动、细胞内运输以及细胞形态的维持。微管的动态行为和功能受到多种蛋白质相互作用的调控，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和 Kinesin1,2,3,4,5。
在神经元中，微管对于轴突和树突的发育与维持至关重要。微管的异常会导致神经元功能障碍甚至死亡。例如，在阿尔茨海默病患者的大脑中，Tau蛋白的过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，从而引起神经功能紊乱6。因此，研究微管网络将有助于理解神经发育过程以及神经系统疾病的发病机制。
神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元轴突末梢与肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构与功能的优良且有力的模型系统7Futsch 是一种蛋白质 果蝇 与哺乳动物中发现的微管结合蛋白MAP1B同源8仅在神经元中表达，并在神经肌肉接头突触小结的发育过程中发挥作用8,9在野生型中，通过抗Futsch免疫染色可观察到沿NMJ突起中心分布的丝状束结构。当该束结构到达NMJ末端时，可形成由微管组成的环状结构，或失去其丝状形态，呈现弥散且点状的外观。10微管环与暂停生长的生长锥相关，表明微管阵列处于稳定状态11因此，我们可以通过Futsch染色间接确定NMJ处稳定微管的发育情况。由于肌细胞体积较大， 果蝇 幼虫可清晰显示微管网络。通过分析微管的密度和形态，可发现影响微管网络稳定性的因素。同时，可将肌细胞微管网络状态与神经肌肉接头（NMJ）的结果进行交叉验证，以获得更全面的结论。
已有多种方案被用于研究微管网络及其动态特性。然而，这些研究大多集中于in vitro（体外）研究12,13,14,15,16。另有部分in vivo（体内）实验采用电子显微镜来检测细胞骨架17。本文所述方法基于荧光标记的抗体或化学染料对蛋白质或DNA的特异性结合，可在in vivo条件下于单个神经元水平上检测神经肌肉接头（NMJ）处的微管网络，并通过肌细胞中的观察结果加以验证。该方案结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中强大的遗传工具，操作简便、稳定且可重复，适用于在in vivo条件下对神经系统中调控微管网络的蛋白质进行多种表型分析和遗传筛选。
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方案
1. 幼虫解剖
注意：解剖用溶液类血淋巴盐水（HL3.1）18 和固定用溶液 4% 多聚甲醛（PFA）19,20 均在室温下使用，因为温度过低会导致微管解聚。
- 用长柄钝头镊子挑选一只游走期3rd龄幼虫。用HL3.1溶液清洗后，置于体视显微镜下的解剖皿中。
注：游走期3rd龄幼虫可通过分枝状的前气门识别，在25 °C条件下约96 h时在培养管内爬行21。 - 将幼虫背侧或腹侧朝上放置。通过两条长气管识别背侧，通过腹部的齿带识别腹侧。
- 根据所要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这有助于更精确、详细地观察特定目标区域。若需观察神经肌肉接头（NMJ）和肌细胞，应分别切开幼虫的背侧和腹侧区域。
- 用大头针固定口钩和尾部。调整大头针使幼虫处于充分伸展状态。向幼虫滴加一滴HL3.1溶液，防止其干燥。
注：可使用无Ca2+的HL3.1溶液，以减少解剖过程中肌肉的收缩。 - 使用解剖剪在幼虫后端附近做一小段横向切口，但不要切断后端。然后沿腹中线向前端方向剪开。
- 在幼虫四角插入四枚昆虫针。重新调整昆虫针位置，使幼虫在各个方向上均被最大程度拉伸。
- 用镊子小心去除内脏器官，同时避免损伤肌肉组织。
2. 固定
- 在解剖皿中仍将尸体固定于大头针上的情况下，加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA），浸没尸体 40 分钟。
注意：PFA 具有危害性，需采取有效防护措施，避免皮肤直接接触或吸入。 - 取下大头针，将样品转移至 2 mL 微量离心管中。用含 0.2% Triton X-100 的 1× 磷酸盐缓冲液（0.2% PBST）冲洗 PFA，加至 2 mL 微量离心管中，在脱色摇床（15 rpm）上孵育 10 分钟。重复洗涤 5 次。
3. 免疫细胞化学
- 将尸体浸入封闭剂（含5%羊血清的0.2% PBST）中，室温封闭40分钟。
- 除去封闭剂，加入200 µL一抗（例如，抗α-微管蛋白抗体，1:1000；抗Futsch抗体，1:50），用0.2% PBST稀释，4 °C孵育过夜。通过单克隆抗α-微管蛋白抗体免疫染色显示肌微管结构。抗Futsch抗体可间接反映神经肌肉接头处微管的形态。
- 一抗孵育后，用0.2% PBST清洗幼虫10分钟，重复5次。
- 将幼虫与200 µL二抗孵育例如，用含0.2% PBST的溶液稀释的山羊抗小鼠-488抗体（1:1000），室温避光孵育1.5小时。
- 接下来，在避光条件下对微管进行染色时，向孵育管中加入核染料（如 TO-PRO(R) 3 碘化物（T3605）），稀释比例为 1:1000，孵育 30 分钟。20,22.
- 用 0.2% PBST 洗涤 10 分钟，去除二抗和核染料。在避光条件下重复洗涤 5 次。
4. 封片
- 将幼虫尸体置于载玻片上的0.2% PBST中，并在体视显微镜下进行调整。确保幼虫尸体的内表面朝上，并将所有幼虫尸体按所需位置排列整齐。
- 用擦拭纸吸去多余的PBST溶液，然后轻轻滴加一滴抗荧光淬灭封片剂。
- 将盖玻片缓慢而轻柔地覆盖在载玻片上，以完全覆盖解剖后的幼虫，避免产生气泡。
- 在盖玻片周围涂抹指甲油。将载玻片置于避光环境中，以减少荧光衰减。
5. 图像采集
- 获取图像时，使用激光扫描共聚焦显微镜，选择60倍油镜物镜（数值孔径1.42）或类似规格，并根据实验需求调整激光功率和波长。
- 为识别神经肌肉接头（NMJ），在A3节段的肌肉4中采集图像（位置如图1F所示）。选择488 nm激光激发α-微管蛋白或Futsch，543 nm激光激发HRP成像通道。将成像参数调整为帧尺寸800像素 × 800像素、数字放大倍数2.0、NMJ处的成像间隔为0.8 µm（图2）。
- 为识别肌肉中的微管结构，在A3-A5节段的肌肉2中采集图像（位置如图1G所示），该区域气管分支较少。选择488 nm激光激发α-微管蛋白，635 nm激光激发T3605成像通道。将成像参数调整为帧尺寸1024像素 × 1024像素、数字放大倍数3.0、肌肉细胞中的成像间隔为0.4 µm（图3）。
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结果
我们展示了一步一步可视化神经肌肉接头（NMJs）和肌细胞中微管网络的实验流程。根据示意图（图1A-E）进行解剖后，进行免疫染色，并在激光共聚焦显微镜或立体荧光显微镜下观察和采集图像（图1F,G）。
神经肌肉接头（NMJ）的突触前和突触后微管结构均可使用抗α-微管蛋白抗体进行标记，通过调节激光扫描共聚焦显微镜的层厚，可显示不同切片中微管的形态（图2A-C）。Futsch也常用于神经示踪，以揭示神经元轴突中的微管组织。抗-HRP抗体用于标记神经元膜10,23,24。通过抗-Futsch与抗-HRP抗体的共染色，可检测神经元轴...
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讨论
本文介绍了一种对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头和肌细胞进行解剖和免疫染色的实验方案。该操作中有若干关键要点需特别注意。首先，在解剖过程中必须避免对目标肌肉造成损伤。建议在去除内脏器官前先将组织展开并固定，以防止镊子直接接触肌肉。为避免肌肉受损或从幼虫表皮上脱落，在洗涤和孵育过程中应确保摇床转速不超过15 rpm。此外，需精确控制表皮的延展程度，以保证神经肌肉接头形态的成像清晰且完整。建议通过预实验优化抗体浓度、固定条件、封闭时间和孵育时间。固定时间应控制在约40分钟，过短或过长均不利于微管网络的免疫染色效果。
神经元中的微管高度密集，使用传统显微镜难以清晰观察。与神经元相比，果蝇（Drosophila）的肌细胞明显更大，其中A3节段的肌肉2可达40 µm × 150 µm，适合进行高分辨率成像。因此，利用果蝇（Drosophila）肌细胞研究微管网络相关蛋白的调控是一种直观且清晰的方法，在验证神经肌肉接头（NMJ）表型方面具有重要意义20,<...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢熊英博士对本文的讨论和意见。本工作得到中国国家自然科学基金（NSFC）对 C. M.（31500839）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor Plus 405 鬼笔环肽 | invitrogen | A30104 | 稀释比例 1:200 |
| 增强型抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW 共聚焦显微镜 | Olympus | ||
| 山羊抗小鼠抗体，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher | A-11001 | 稀释比例 1:1,000 |
| 激光共聚焦显微镜 LSM 710 | Zeiss | ||
| 显微剪刀 | 66vision | 54138B | |
| 小鼠抗 Futsch 抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | 稀释比例 1:50 |
| 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 | 稀释比例 1:1,000 |
| 多聚甲醛 | Wako | 168-20955 | 终浓度：4% PB 缓冲液 |
| 不锈钢显微固定针 | Entomoravia | 直径 0.1 mm | |
| 体视显微镜 SMZ161 | Motic | ||
| 立体荧光显微镜 BX41 | Olympus | ||
| Texas Red 标记的山羊抗 HRP 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 稀释比例 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 碘化物 | Invitrogen | T3605 | 稀释比例 1:1,000 |
| 转移脱色摇床 TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| 镊子 | dumont | 500342 |
参考文献
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