本文介绍了一种用于可视化神经肌肉接头和肌细胞中微管网络的详细方案。结合黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）强大的遗传工具，该方案可显著促进针对神经系统中微管网络调控蛋白功能的遗传筛选和微管动力学分析。
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本文内容
摘要
摘要
微管网络是神经系统的重要组成部分。许多微管调控蛋白的突变与神经发育障碍及神经系统疾病相关，例如微管相关蛋白Tau与神经退行性疾病相关，微管剪切蛋白Spastin和Katanin 60分别导致遗传性痉挛性截瘫和神经发育异常。在神经元中检测微管网络有助于阐明神经系统疾病的发病机制。然而，由于神经元体积较小，且轴突中的微管束排列密集，使得微管网络的可视化具有挑战性。本研究描述了一种分离幼虫神经肌肉接头和肌细胞的方法，并通过α-tubulin和微管相关蛋白Futsch的免疫染色来可视化微管网络 黑腹果蝇神经肌肉接头使我们能够同时观察到突触前和突触后的微管，且由于肌细胞体积较大， 黑腹果蝇 幼虫能够清晰地显示微管网络。此处，通过突变和过表达 Katanin 60 在 黑腹果蝇, 然后检测神经肌肉接头和肌细胞中的微管网络，我们 准确揭示Katanin 60在神经发育中的调控作用。因此，结合强大的遗传学工具 果蝇 黑腹果蝇该方案极大地促进了针对微管网络调控蛋白在神经系统中作用的遗传筛选和微管动态分析。
引言
微管（MTs）作为细胞骨架的结构组分之一，在多种生物学过程中发挥重要作用，包括细胞分裂、细胞生长与运动、细胞内运输以及细胞形态的维持。微管的动态行为和功能受到多种蛋白质相互作用的调控，例如 MAP1、MAP2、Tau、Katanin 和 Kinesin1,2,3,4,5。
在神经元中，微管对于轴突和树突的发育与维持至关重要。微管的异常会导致神经元功能障碍甚至死亡。例如，在阿尔茨海默病患者的大脑中，Tau蛋白的过度磷酸化会降低微管网络的稳定性，从而引起神经功能紊乱6。因此，研究微管网络将有助于理解神经发育过程以及神经系统疾病的发病机制。
神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元轴突末梢与肌纤维之间形成的外周突触，是研究突触结构与功能的优良且有力的模型系统7Futsch 是一种蛋白质 果蝇 与哺乳动物中发现的微管结合蛋白MAP1B同源8仅在神经元中表....
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方案
1. 幼虫解剖
注意：解剖用溶液类血淋巴盐水（HL3.1）18 和固定用溶液 4% 多聚甲醛（PFA）19,20 均在室温下使用，因为温度过低会导致微管解聚。
- 用长柄钝头镊子挑选一只游走期3rd龄幼虫。用HL3.1溶液清洗后，置于体视显微镜下的解剖皿中。
注：游走期3rd龄幼虫可通过分枝状的前气门识别，在25 °C条件下约96 h时在培养管内爬行21。 - 将幼虫背侧或腹侧朝上放置。通过两条长气管识别背侧，通过腹部的齿带识别腹侧。
- 根据所要观察的组织，选择背侧或腹侧解剖。这有助于更精确、详细地观察特定目标区域。若需观察神经肌肉接头（NMJ）和肌细胞，应分别切开幼虫的背侧和腹侧区域。
- 用大头针固定口钩和尾部。调整大头针使幼虫处于充分伸展状态。向幼虫滴加一滴HL3.1溶液，防止其干燥。
注：可使用无Ca2+的HL3.1溶液，以减少解剖过程中肌肉的收缩。 - 使用解剖剪在幼虫后端附近做一小段横向切口，但不要切断后端。然后....
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结果
我们展示了一步一步可视化神经肌肉接头（NMJs）和肌细胞中微管网络的实验流程。根据示意图（图1A-E）进行解剖后，进行免疫染色，并在激光共聚焦显微镜或立体荧光显微镜下观察和采集图像（图1F,G）。
神经肌肉接头（NMJ）的突触前和突触后微管结构均可使用抗α-微管蛋白抗体进行标记，通过调节激光扫描共聚焦显微镜的层厚，可显示不同切片中微管的形态（图2A-C）。Futsch也常用于神经示踪，以揭示神经元轴突中的微管组织。抗-HRP抗体用于标记神经元膜10,23,24。通过抗-Futsch与抗-HRP抗体的共染色，可检测神经元轴.......
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讨论
本文介绍了一种对黑腹果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头和肌细胞进行解剖和免疫染色的实验方案。该操作中有若干关键要点需特别注意。首先，在解剖过程中必须避免对目标肌肉造成损伤。建议在去除内脏器官前先将组织展开并固定，以防止镊子直接接触肌肉。为避免肌肉受损或从幼虫表皮上脱落，在洗涤和孵育过程中应确保摇床转速不超过15 rpm。此外，需精确控制表皮的延展程度，以保证神经肌肉接头形态的成像清晰且完整。建议通过预实验优化抗体浓度、固定条件、封闭时间和孵育时间。固定时间应控制在约40分钟，过短或过长均不利于微管网络的免疫染色效果。
神经元中的微管高度密集，使用传统显微镜难以清晰观察。与神经元相比，果蝇（Drosophila）的肌细胞明显更大，其中A3节段的肌肉2可达40 µm × 150 µm，适合进行高分辨率成像。因此，利用果蝇（Drosophila）肌细胞研究微管网络相关蛋白的调控是一种直观且清晰的方法，在验证神经肌肉接头（NMJ）表型方面具有重要意义20,<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢熊英博士对本文的讨论和意见。本工作得到中国国家自然科学基金（NSFC）对 C. M.（31500839）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor Plus 405 鬼笔环肽 | invitrogen | A30104 | 稀释比例 1:200 |
| 增强型抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW 共聚焦显微镜 | Olympus | ||
| 山羊抗小鼠抗体，Alexa Fluor 488 标记 | Thermo Fisher | A-11001 | 稀释比例 1:1,000 |
| 激光共聚焦显微镜 LSM 710 | Zeiss | ||
| 显微剪刀 | 66vision | 54138B | |
| 小鼠抗 Futsch 抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | 稀释比例 1:50 |
| 小鼠抗α-微管蛋白抗体 | Sigma | T5168 | 稀释比例 1:1,000 |
| 多聚甲醛 | Wako | 168-20955 | 终浓度：4% PB 缓冲液 |
| 不锈钢显微固定针 | Entomoravia | 直径 0.1 mm | |
| 体视显微镜 SMZ161 | Motic | ||
| 立体荧光显微镜 BX41 | Olympus | ||
| Texas Red 标记的山羊抗 HRP 抗体 | Jackson ImmunoResearch | 稀释比例 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 碘化物 | Invitrogen | T3605 | 稀释比例 1:1,000 |
| 转移脱色摇床 TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| 镊子 | dumont | 500342 |
参考文献
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224(2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its ....
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