针灸治疗慢性缺氧诱导认知功能障碍小鼠模型

摘要

本文介绍了一种在慢性缺氧小鼠模型上实施轻度麻醉和针灸治疗，并通过行为学测试评估治疗后认知功能改变的实验方案。

摘要

中枢神经系统疾病的治疗在医学领域始终面临重大挑战。针灸是一种源于中医的非药物疗法，通过将细针插入身体特定穴位来实施，常用于多种疾病的治疗。近年来，针灸已成为治疗包括焦虑和呼吸系统疾病在内的多种神经系统疾病的一种有前景的干预手段。然而，针灸在改善慢性缺氧所致认知功能障碍方面的潜力尚未得到探索。本文介绍了一项建立慢性缺氧诱导认知障碍小鼠模型的全面实验方案，包括实施轻度麻醉、进行针灸治疗，并通过旷场实验和水迷宫评估行为变化与记忆能力。该分步操作方案详细说明了为改善认知功能而准确定位穴位和针刺操作的具体方法。通过采用本方案，研究人员可系统开展研究，全面评估针灸对认知功能障碍的治疗潜力。

引言

全球人口目前正面临严峻的老龄化问题，导致认知障碍的患病率迅速上升。全球认知功能障碍的发病率约为每千人年53.97例¹。由血管功能障碍或循环/呼吸系统疾病引起的慢性脑缺氧仍是与年龄相关的痴呆症主要危险因素之一²。先前的研究表明，脑缺氧可通过调节BACE1的表达增加β-淀粉样蛋白的沉积³。此外，缺氧还与胶质细胞功能失调及神经炎症相关^4,5。尽管该问题日益严重，目前仍缺乏有效的西药用于预防慢性缺氧所致的认知能力下降。非药物性的传统中医药，尤其是针灸，已用于治疗认知障碍数千年，并在缓解神经退行性疾病方面显示出良好疗效^6,7。百会、神庭和足三里是治疗认知功能障碍的有效穴位^8,9。临床研究显示，电针治疗可显著改善血管性认知障碍患者的蒙特利尔认知评估（MoCA）和简易精神状态检查（MMSE）评分，有效缓解认知功能障碍⁸。尽管已有研究表明，针灸可显著增强动脉结扎所致急性脑缺氧模型大鼠的记忆能力¹⁰，但目前尚无关于针灸对任何慢性缺氧诱导认知障碍啮齿类动物模型作用的报道。相关机制研究的缺乏在很大程度上阻碍了其临床应用。

既往研究表明，将大鼠置于低氧环境中8周可显著升高脑内氧化应激和炎症水平，导致记忆功能下降¹¹。本研究旨在探讨针灸对啮齿类动物模型的影响，以进一步加深对该领域的理解。然而需要注意的是，由于反复刺激可能引起动物躁动，啮齿类动物在接受针灸治疗时通常需要麻醉。长时间麻醉会显著影响小鼠的认知功能，因为大多数麻醉药物可抑制神经元活动并阻碍信息处理，从而导致行为缺陷¹²。多项研究显示，给予2.5%七氟烷持续6小时可明显损害小鼠的空间记忆、学习能力及注意力¹³。此外，有证据表明高剂量麻醉可能导致小鼠神经元死亡或神经损伤¹⁴。因此，必须寻找一种合适的方法以尽量减少麻醉总用量。本研究介绍了一种用于治疗认知障碍小鼠的有效针灸方法，并结合行为学测试评估其记忆能力。尤为重要的是，我们提出了一种改良的预处理麻醉技术，可有效减少实验过程中麻醉药物的总给药剂量。

方案

动物实验经河北以岭医药研究院动物研究与伦理委员会批准（批准编号：N2022148）。雄性C57BL/6J小鼠，体重18-22 g（见材料表），饲养于河北以岭医药研究院新药评价中心。小鼠自由摄取正常食物和清洁饮水，每日接受12小时人工光照。饲养环境温度控制在20-26 °C，相对湿度维持在40%-70%。

1. 慢性低氧小鼠模型的建立（图1）

1. 实验开始前，准备常压环境下的动物笼具和持续低氧环境的笼具。通过使用自动气体控制系统，向密闭舱内通入纯氧与氮气的混合气体，建立持续低氧环境。
   注意：该系统通过程序控制电磁阀开关，从而精确调控气体输送的时间与浓度。
2. 将小鼠随机分为三组：对照组（Con）、模型组（CH）和电针组（EA + CH）。将对照组小鼠与模型组/电针组小鼠分别放置于两个不同的笼具中，每笼10只小鼠。维持12小时光照/12小时黑暗的光照周期。
   注意：对照组（Con）不进行任何处理，也不诱导缺氧。模型组（CH）为慢性缺氧小鼠模型。电针组（EA + CH）为经电针治疗的缺氧小鼠。
3. 为建立慢性缺氧模型，使用数字氧气测定仪调节气体流速，设定低氧舱的参数，维持氧浓度为10%。每日上午9:00将动物放入低氧舱，下午5:00取出，每天连续暴露于低氧环境8小时，持续3个月。
   注意：在通入氮气以降低氧浓度时，建议缓慢进行，避免一次性通入过多氮气，否则可能导致动物死亡。
4. 通过组织学检查以及行为学测试（旷场实验¹⁵和水迷宫实验¹⁶）评估慢性缺氧诱导的认知功能障碍模型。

2. 麻醉（图2）

1. 准备小动物麻醉机（参见材料表）和恒温加热垫。
   注意：麻醉期间，动物易发生低体温，因此必须使用恒温加热垫进行保温。
2. 将小鼠放入麻醉诱导箱中，用氧气混合2%-2.5%异氟烷（参见材料表）进行快速诱导，约1分钟。
   注意：此短期预处理是确保小鼠能够在低浓度麻醉剂下长时间维持生命活动的关键步骤。
3. 当小鼠兴奋性降低后，轻捏其足趾以检查反射反应。随后将小鼠转移至恒温加热垫（37 °C）上。
4. 调节麻醉气体流速至约0.5%浓度。将麻醉机连接至小鼠的口鼻部。在维持麻醉的同时进行电针治疗。
   注意：当小鼠停止眨眼时，表明麻醉起效。麻醉效果可持续至少30分钟。

3. 电针治疗

1. 为有效改善认知功能障碍，根据中医理论和临床经验，选择特定穴位，如百会（GV20）、神庭（GV24）和双侧足三里（ST36）图3）。在造模过程完成前2周开始电针治疗。
   1. 在前额中线上，找到连接双耳耳尖连线的中点处的百会穴（GV20）⁷针刺深度必须为2 mm。
   2. 在小鼠两眼正中上方1.3 mm处的额部中线上定位GV24穴位¹⁷针刺深度必须为2 mm。
   3. 在膝关节外侧，腓骨头下方约2 mm处定位ST36穴位^18,19针刺深度必须为3-4 mm。
2. 准备一次性使用的针灸针（参见 材料表）以及电针仪（参见 材料表) 用于该操作步骤（图4).
3. 将小鼠置于俯卧位，在0.5%异氟烷轻度麻醉下固定其头部和四肢。用右手拇指、食指和中指持握一根不锈钢针（直径：0.18 mm；长度：7 mm）。
4. 用左手提起小鼠头部皮肤，于督脉20（GV20）和督脉24（GV24）穴位处沿横向进针2 mm深度。用左手拇指按压小鼠膝关节外侧腓骨头处皮肤，于足三里（ST36）穴位处垂直进针3–4 mm深度。
   注意：对于位于头部的穴位，建议按照从 GV24 到 GV20 的顺序进针，此顺序有助于操作便利。穴位是离散的解剖位置，而非固定的点位。因此，进针角度的轻微偏差不会影响治疗效果，这一点在临床接受电针治疗的患者中同样可见。
5. 将电子针灸仪连接至针具，其中督脉百会穴（GV20）与左侧足三里穴（ST36）连接一组电极，督脉神庭穴（GV24）与右侧足三里穴（ST36）连接另一组电极（图4）。选择连续波模式，电流强度为2 mA，频率为2 Hz^20,21通过观察针灸穴位处出现的局部轻微震颤及小鼠安静耐受的情况，确认理想的处理效果。
   1. 连接电针仪时，应连接针具的近端。这有助于尽量减少连接线重量造成的影响，从而有效防止针具脱落。如有需要，可使用胶带固定水平插入的针具及连接线。
6. 每天给药一次，每次持续30分钟，连续给药6天，每个治疗周期之间休息1天。

4. 开放旷场实验（图5）

注意：开放旷场实验是一种常规方法，用于评估实验动物在新颖且陌生环境中的自主行为、探索行为、认知能力以及焦虑行为²²。该实验由一个开放旷场反应箱和一个记录装置组成。

1. 进行测试时，准备一个白色侧壁的立方体结构，尺寸为 50 cm × 50 cm × 30 cm，底部划分为 25 个相等的 10 cm × 10 cm 正方形区域。
2. 将小鼠放入开放场反应箱中进行适应。在适应期间，让小鼠探索测试房间并熟悉新环境。在小鼠适应实验环境 1 小时后，进行开放场测试。
   注意：这可确保将环境变化引起的小鼠焦虑或应激反应降至最低，从而在后续行为评估中获得更精确的结果。
3. 将小鼠置于箱体中央，在其适应环境 2 分钟后开始监测，持续 10 分钟。
   1. 使用视频追踪系统（见材料表）记录小鼠在测试期间的运动轨迹、总移动距离、在中心区域停留的时间、穿越中心区域的速度以及进入中心区域的次数。
   2. 按照视频追踪系统的产品说明书进行相关操作。每只小鼠仅进行一次测试，且均从箱内相同位置开始探索。
   3. 每次测试结束后，使用 75% 乙醇清洁开放场箱体，以避免因气味残留对后续使用的小鼠造成干扰而产生假阳性结果。

5. 水迷宫（图5）

注意：水迷宫实验常被用作小鼠行为评估工具，以评价其空间学习和记忆能力²³。

1. 准备一个直径为120 cm、深度为30 cm的圆形水箱。将水箱均分为四个象限：I、II、III和IV。若实验中使用黑色小鼠，则采用白色水箱；若使用白色小鼠，则采用黑色水箱。
2. 在圆形水箱周围设置帘子，以防止小鼠在测试过程中看到研究人员。
3. 在水箱顶部表面放置不同的标记物，作为空间定位的视觉线索。确保这些标记在整个实验过程中保持固定不动，以维持一致性。
4. 在水箱的III象限内放置一个直径为10 cm的圆形平台，作为指定的目标区域。确保该平台可轻松移动并固定在任意所需位置。
5. 在整个实验过程中，向水箱中注入水，并维持水温在22–24 °C之间。
   1. 确保水位始终稳定在目标平台上方1 cm处。在水中加入20%浓度的无毒二氧化钛，以在黑色小鼠与白色背景之间形成明显对比。该对比有助于摄像系统记录小鼠的运动轨迹及相关参数。
6. 进行为期5天的连续空间探索测试，依次将每只小鼠放置于I、II、III和IV象限。
   1. 将小鼠面朝水箱壁放置。放置后立即离开迷宫区域，避免小鼠以实验人员的位置作为参考点。记录小鼠找到平台所需的时间。
   2. 若小鼠在90 s内未能找到水下平台，则引导小鼠至平台，并给予30 s的学习时间。同时，将潜伏期记录为90 s。
   3. 若小鼠在90 s内成功找到水下平台，则让其在平台上停留10 s进行学习，随后将其从水箱中取出。
   4. 用毛巾将小鼠擦干，并放回笼中。
   5. 每20分钟轮换一次每只小鼠在各象限的起始位置。使用视频追踪系统（见材料表）记录每只小鼠的游泳距离、速度及找到平台所需时间（潜伏期），并按照产品说明书进行相关操作。
   6. 第1天将平台置于水面以上1 cm处；第2–5天将平台置于水面以下1 cm深处。
7. 第6天，从目标象限中移除平台，进行空间探索测试。
   1. 将小鼠放入I象限，自由探索90 s。计算机记录小鼠的游泳轨迹、在目标象限停留的时间以及穿越平台位置的次数。
      ​注意：为尽量减少人为因素引起的实验误差，在水迷宫实验中应保持参考点位置固定。此外，实验人员在将小鼠放入水中后应立即退离。实验结束后，应使用毛巾将小鼠擦干并放回笼中以保持体温。

6. 苏木精-伊红（HE）染色 (图6)

注意：海马区的组织学检查有助于评估缺氧模型的建立情况，并确定针灸治疗的效果。

1. 行为实验结束后，通过腹腔注射 20 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉小鼠，并用 10% 多聚甲醛溶液（见材料表）进行灌注，以确保全身充分灌注。取出脑组织，置于室温（RT）下的 10% 多聚甲醛溶液中固定 3 天。
2. 将脑样本放入包埋盒中，随后用流动水冲洗处理后的脑样本 6 小时。
3. 使用自动组织处理机，采用浓度递增的系列酒精溶液对样本进行脱水处理，具体为：60% 乙醇 1 小时，70% 乙醇 1 小时，90% 乙醇 1 小时，95% 乙醇 2 小时，最后用 100% 乙醇处理 2 小时。
4. 将组织样本浸入二甲苯中 2 小时以实现透明化。随后，在完成脱水步骤后，将已通透的样本转移至加热至 60 °C 的石蜡中浸泡 3 小时。最后，在自动处理机中进行包埋。
5. 使用旋转切片机切取 4 µm 厚的切片。随后将切片进行苏木精染色 3–8 分钟，再进行伊红染色 1–3 分钟。
6. 将染色后的切片依次转移至盛有纯酒精和二甲苯的独立容器中。然后用中性树胶封片，以备在光学显微镜下进行病理学检查。
7. 使用切片扫描仪（见材料表）对切片进行扫描。随后利用查看软件获取海马区的苏木精-伊红（HE）染色结果，比较神经元排列情况及神经元核的凝聚程度。

结果

在开放旷场实验中表征小鼠的运动轨迹
轨迹图显示，正常组小鼠在陌生环境中表现出强烈的探索倾向。其活动轨迹主要集中于四周角落，同时覆盖整个开放旷场区域（左图）。相比之下，长期缺氧模型组小鼠对新环境的探索欲望显著降低，主要停留在角落区域，未表现出向旷场中心区域探索的行为（中图）。经针刺治疗后，缺氧诱导小鼠的探索活动有所改善，其向开放旷场中心区域活动的行为得以恢复（右图）（图5A）。

小鼠空间学习与记忆能力的表征
在正常组中，小鼠在目标象限内停留的时间相对较长，穿越平台的次数也更频繁，如轨迹图（左图）所示。长期缺氧模型组小鼠与正常组相比，空间记忆能力减弱，表现为在规定时间内无法准确定位目标象限（中图）。经针刺治疗后，小鼠因缺氧引起的空间记忆能力明显改善，探索行为更加有序，在目标象限内停留的时间显著延长（右图）（图5B）。

讨论

针灸是一种起源于2000多年前中国的非药物医疗实践，其操作方式是将细针插入身体特定部位，这些部位被称为“穴位”。据信，这些穴位通过经络相互连接，体内生命能量（即"气"）在其中流动²⁴。通过刺激这些穴位，针灸旨在恢复身体的平衡与协调。研究表明，针灸可有效治疗多种疾病，包括慢性疼痛、焦虑/抑郁、消化系统问题、痛经以及呼吸系统疾病^{25,26,27,28,29}。近年来，针灸已成为治疗神经性疾病（包括认知功能障碍）的有效干预手段。多项研究已证实，针灸具有调节神经递质、增加脑血流量、减轻氧化应激以及增强神经可塑性的作用^20,30,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10% 多聚甲醛溶液	Bioroyee (北京) 生物技术有限公司	RL3234
ANY-maze	Science	SA201	视频追踪系统
C75BL/6J 小鼠	北京华阜康生物科技股份有限公司	编号：110322220103041767	性别：雄性，  体重：18–22 g
电针仪	长城	KWD-808 I
华佗牌针灸 针	苏州医疗用品厂有限公司	2655519
异氟烷	瑞沃德生命科学有限公司	R510-22
NanoZoomer 数字病理系统	滨松光子学株式会社	C9600-01
小动物麻醉机	RWD	YL-LE-A106