介绍了一种高通量药物筛选方案，通过监测老年果蝇的睡眠行为来促进睡眠 果蝇 模型
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摘要
摘要
睡眠是健康和整体福祉的重要组成部分，但老年人常常面临睡眠障碍的挑战，表现为睡眠时间缩短和睡眠模式碎片化。这些睡眠紊乱还与老年人多种疾病风险增加相关，包括糖尿病、心血管疾病和心理障碍。遗憾的是，目前治疗睡眠障碍的药物常伴随显著的副作用，如认知功能损害和成瘾性。因此，迫切需要开发更安全、更有效的新型睡眠障碍治疗药物。然而，现有药物筛选方法成本高昂且实验周期漫长，仍是制约因素。
本方案描述了一种经济高效且适用于高通量筛选的方法，该方法利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为研究老年个体睡眠障碍的理想模型，因其睡眠调控机制与哺乳动物高度保守。通过向老年果蝇施用多种小分子化合物，可评估其对睡眠障碍的影响。果蝇的睡眠行为由红外监测装置记录，并使用开源数据分析包“2020版睡眠与昼夜节律分析MATLAB程序”（SCAMP2020）进行分析。本方案提供了一种低成本、可重复且高效的睡眠调控筛选方法。果蝇因其生命周期短、饲养成本低且易于操作，是该方法的理想实验对象。例如，所测试药物之一利血平（Reserpine）在老年果蝇中表现出延长睡眠时长的能力，凸显了本方案的有效性。
引言
睡眠是人类生存所必需的重要行为之一，其主要分为两种状态：快速眼动（REM）睡眠和非快速眼动（NREM）睡眠1。NREM睡眠包含三个阶段：N1期（清醒与睡眠之间的过渡阶段）、N2期（浅睡眠）和N3期（深睡眠，即慢波睡眠），代表了从清醒状态逐步进入深睡眠的过程1。睡眠在维持身体和心理健康方面发挥着关键作用2。然而，随着年龄增长，成年人的总睡眠时间、睡眠效率、慢波睡眠比例以及REM睡眠比例均会减少3。老年人相较于慢波睡眠，更多地处于浅睡眠状态，因此更容易在夜间觉醒。随着觉醒次数的增加，平均睡眠时间减少，导致老年人出现睡眠片段化现象，这可能与小鼠中Hcrt神经元过度兴奋有关4。此外，与年龄相关的昼夜节律机制衰退也会导致睡眠时间提前5,6。结合躯体疾病、心理压力、环境因素及药物使用等多种因素，这些变化使老年人更易罹患失眠、快速眼动睡眠行为障碍、发作性睡病、周期性肢体运动、不宁腿综合征以及睡眠呼吸障碍等睡眠障碍7,8。
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方案
本方案使用30天龄的 w1118 来自布卢明顿的果蝇 果蝇 保种中心 (BDSC_3605，参见 材料表).
1. 老年果蝇的制备
- 食物制备
- 通过混合50 g/L玉米片、110 g/L蔗糖、5 g/L琼脂和25 g/L酵母制备标准玉米淀粉培养基。将玉米片和酵母加水加热至糊化，然后充分溶解所有成分。
- 当培养基冷却至50–60 °C时，加入6 mL/L丙酸，并立即分装至培养瓶中。
- 果蝇饲养及老龄果蝇的制备
- 将果蝇品系w1118饲养于含标准玉米淀粉培养基的培养瓶中，并将培养瓶置于25 °C、相对湿度68%、光照强度500–1000 lux、光周期12 h光照:12 h黑暗的恒温培养箱中。
- 根据果蝇生长周期，每7天将果蝇转移至新培养瓶一次，确保同一瓶内个体的年龄保持一致。
- 在转移果蝇3天后，收集从原始培养瓶中新羽化的果蝇，并将其放入新的培养瓶中。按照每7天换瓶一次的原则，持续培养至果蝇约30日龄。
2. 药用食物和用于监测的玻璃管....
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结果
利血平是一种小分子囊泡单胺转运蛋白（VMAT）抑制剂，可抑制单胺类神经递质重摄取至突触前囊泡中，从而增加睡眠33。在30日龄果蝇中检测了利血平的促睡眠作用，对照组仅饲喂溶剂二甲基亚砜（DMSO）。在利血平处理组中，老年果蝇在白天和夜间睡眠时间均显著长于DMSO组。图5A、E展示了利血平处理组与DMSO组果蝇连续三天的睡眠模式，而图5B-D和图5F-H显示了睡眠数据差异性检验的结果。为排除药物仅对单一性别起效的可能性，实验在雄性果蝇中重复进行。分别给予20 µM和50 µM不同浓度的利血平处理，结果显示利血平浓度与促睡眠效应呈正相关。
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讨论
所述方法适用于快速筛选中小型睡眠药物。目前，大多数主流高通量药物筛选方法均基于生化和细胞水平。例如，通过研究受体的结构与特性，寻找能够与其结合的特异性配体22。另一种方法是利用核磁共振（NMR）结合质谱技术，分析选定药物分子片段的结合模式与结合强度35。然而，这些方法通常具有相对较高的筛选误差率，通过此类方法筛选出的药物在动物实验或临床试验中往往无效。药物在体内的疗效受到多种因素影响，如药物的吸收、分布、代谢和排泄，从而导致假阳性筛选结果比例较高。相比之下，尽管本文提出的方法在筛选规模上小于高通量方法，但其通过直接观察药物对表型的影响，提供了一种更为直接且成本较低的筛选途径。这体现了利用黑腹果蝇（Drosophila）模型进行有效药物筛选及药物靶点鉴定的潜力。
Drosophila 具有保守的睡眠调控机制，并表现出与衰老相关的睡眠障碍。我们观察到，30日龄雌性果蝇的睡眠时长显著短于7日龄果蝇，而30日龄雄性果蝇的睡眠时长与7日龄果蝇相比无显著差异（
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢韩俊海教授实验室成员的讨论与建议。本工作得到国家自然科学基金 32170970 对 Y.T. 的资助以及 "花青蓝项目" 江苏省资助项目，资助编号：Z.C.Z.
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Ager | BIOFROXX | 8211KG001 | |
| 人工气候箱 | PRANDT | PRX-1000A | 官方网站：https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/ |
| DAM2 果蝇活动监测仪 | TriKineics | DAM2 | 官方网站：https://www.trikinetics.com/ |
| DAM2系统 | TriKineics | 版本：v3.03 | 官方网站：https://www.trikinetics.com/ |
| DAMFileScan | TriKineics | 版本：1.0.7.0 | 官方网站：https://www.trikinetics.com/ |
| 二甲基亚砜 | SIGMA | 276855 | |
| 果蝇活动监测培养箱 | Tritech Research | DT2-CIRC-TK | 官方网站：https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html |
| 果蝇培养瓶 | Biologix | 51-17720 | 官方网站：http://biologixgroup.com/goods.php?id=48 |
| 果蝇：w1118 | Bloomington果蝇品系中心 | BDSC_3605 | |
| Excel | Microsoft | 版本：Excel 2016 | 官方网站：https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel |
| 玻璃管 | TriKinetics | PPT5x65 | 官方网站：https://www.trikinetics.com/ |
| MATLAB R2022b | MathWorks | 版本：9.13.0.2049777 | 官方网站：https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html |
| Prism | GraphPad | 版本：Prism 8.0.1 | 官方网站：https://www.graphpad.com/features |
| 利血平 | MACKLIN | R817202-1g | |
| 蔗糖 | SIGMA | 1245GR500 | |
| SCAMP | Vecsey 实验室 | N/A | 官方网站：https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/ |
参考文献
- Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
- Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Re....
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