本文介绍了一种利用改良的通用DNA提取试剂盒提取硅藻DNA的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
硅藻检测是法医学实践中判断尸体是否溺水以及推断溺水地点的重要辅助手段，同时也是环境与浮游生物领域的重要研究内容。以硅藻DNA为主要研究对象的硅藻分子生物学检测技术，是一种新型的硅藻检测方法。硅藻DNA提取是开展硅藻分子检测的基础。目前常用的硅藻DNA提取试剂盒价格昂贵，增加了相关研究的开展成本。本实验室对通用的全血基因组DNA快速提取试剂盒进行了改良，获得了满意的硅藻DNA提取效果，从而为相关研究提供了一种基于玻璃珠的经济、可行的DNA提取替代方案。采用本方案提取的硅藻DNA可满足多种下游应用需求，如PCR和测序。
引言
在法医学实践中，确定在水中发现的尸体是生前溺水死亡还是死后被抛入水中，对于案件的正确处理至关重要1。这也是法医学实践中亟需解决的难题之一2。硅藻在自然环境中广泛存在（尤其在水体中）3,4。在溺水过程中，由于缺氧和应激反应，个体会产生强烈的呼吸运动并吸入大量溺液。因此，水中的硅藻随溺液进入肺部，部分硅藻可穿过肺泡-毛细血管屏障进入血液循环，并随血流扩散至肝脏、骨髓等内脏器官5,6。在肺、肝、骨髓等内部组织和器官中检出硅藻，是生前溺水的重要证据7,8。目前，法医硅藻检测主要依赖形态学检测方法。通过对组织进行一系列预消化处理后，在显微镜下对未被消化的硅藻进行形态学上的定性与定量分析。该过程需使用硝酸等具有危险性且对环境不友好的试剂，耗时较长，且要求研究人员具备扎实的分类学专业知识和丰富的实践经验。这些因素均给法医工作人员带来一定挑战9。硅藻DNA检测技术是近年来发展起来的一种新型硅藻检测技术10
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方案
本研究经海南医科大学伦理委员会批准。本研究中使用的组织样本不被视为涉及人类受试者的研究。这些标本系为法医病理学诊断目的而获取，剩余部分用于本实验中的硅藻DNA提取。研究人员无法轻易识别个体，因而无法从相关利益方获得知情同意。
注意：为确保本实验所报告的研究方法具有普遍适用性，本实验基本遵循所用试剂盒的操作说明书，仅对部分步骤进行了修改。本实验所用的水样随机采集自实验室附近的池塘（补充图1A）。本实验以溺亡尸体的肺组织作为研究组织，用于展示提取流程（补充图1B）。在法医学实践中，有时还需利用溺亡尸体的其他器官和组织（如肝脏、脾脏、肾脏、骨髓等）提取硅藻DNA，这需要对该实验方法进行相应的微小改进，相关内容将在实验的相应部分予以说明。本实验所用肺组织样本来自法医案例中明确溺亡的尸体。已通过形态学检测证实肺组织中含有硅藻（补充 图2）。
1. 样品预处理
- 水样的预处理
- 取10 mL水样加入离心管中，在13,400 × g 条件下离心5 min。用移液枪小心弃去上清液9.8 mL，将底部剩余约200 µL的富集硅藻水样转移至2 mL离心管中。
注意：可先进行预实验，若10 mL水样富集后不足，可适当增加初....
- 取10 mL水样加入离心管中，在13,400 × g 条件下离心5 min。用移液枪小心弃去上清液9.8 mL，将底部剩余约200 µL的富集硅藻水样转移至2 mL离心管中。
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结果
由于目前使用的DNA提取方法所获得的DNA溶液含有样本中不同来源的全部DNA成分，本方案所获得的DNA也不例外。因此，该DNA溶液并非仅含有硅藻基因组DNA。通过查阅文献，筛选出能够特异性扩增硅藻18S rDNA片段的引物22,23,24。利用NCBI-Blast Primer对引物进行验证，结果显示18S rDNA的正向引物D512和反向引物D978为藻类特异性引物，可覆盖多种硅藻物种，且扩增结果未显示任何人类基因。因此，这些引物可作为硅藻检测的可靠DNA生物标志物，被用于本实验结果的验证。以所提取的DNA为模板进行硅藻特异性PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示水样和组织样本中均出现硅藻DNA条带，电泳条带位于250–500 bp之间（更接近500 bp），符合引物预期扩增产物长度范围（390–410 bp）。这表明本提取方案成功提取到了硅藻DNA（图1A、B.......
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讨论
硅藻细胞由坚硬的硅质细胞壁保护17，因此必须破坏该结构才能提取硅藻DNA。普通的试剂盒难以有效破坏硅藻的硅质外壳，因此成功提取硅藻DNA较为困难21。本实验室对最常用的血液DNA提取试剂盒进行了改进，在硅藻DNA提取过程中加入了不同直径和不同质量比的玻璃珠，并同时进行涡旋振荡，从而充分破碎硅藻外壳，提高硅藻DNA的提取效果。如先前报道所述21，玻璃珠的直径、振荡强度和时间会直接影响DNA提取的质量。涡旋振荡时间不宜过长（不超过10分钟），若时间过长，DNA会因过度振动而断裂；同时，时间也不宜过短，若时间过短（不少于2分钟），硅藻外壳无法完全破碎，将导致DNA提取效率低下。在选择玻璃珠时，应选用具有不同周长直径的玻璃珠，其中较大的玻璃珠可保证碰撞强度，较小的玻璃珠则确保在碰撞破碎过程中玻璃珠之间无碰撞死角，从而提高破壳效率。
为了从样品中提取硅藻DNA，通常需要对硅藻进行富集。该过程对硅藻DNA的提取具有重要影响。富集的目的是提高样品中硅藻的.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由国家自然科学基金（82060341，81560304）和海南省院士创新平台科研项目（YSPTZX202134）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 结合缓冲液 | BioTeke | B010006022 | 快速裂解细胞 |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 DNA Ladder | Real-Times(北京)生物科技 | RTM415 | 测定电泳条带位置 |
| D512 | 泰和生物技术 | TW21109196 | 正向引物 |
| D978 | 泰和生物技术 | TW21109197 | 反向引物 |
| 洗脱缓冲液 | BioTeke | B010006022 | 低盐洗脱缓冲液用于洗脱DNA |
| 玻璃珠 | 英旭化工机械(上海) | 70181000 | 用于分散和研磨的专用玻璃珠 |
| 吸附柱 | BioTeke | B2008006022 | 含硅胶膜基质的吸附柱 |
| 抑制物去除缓冲液 | BioTeke | B010006022 | DNA提取过程中去除抑制物 |
| 异丙醇 | BioTeke | B010006022 | 沉淀或分离DNA |
| MIX-30S Mini Mixer | Miulab | MUC881206 | 振荡作用 |
| 蛋白酶K | BioTeke | B010006022 | 灭活细胞内核酸酶及其他蛋白质 |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | 实时荧光定量PCR |
| 高速微量离心机 | Scilogex | 9013001121 | 离心 |
| Tanon 3500R 凝胶成像系统 | Tanon | 16T5553R-455 | 凝胶成像 |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| 热循环仪 | 珠海黑马 | VRB020A | 普通PCR |
| 洗涤缓冲液 | BioTeke | B010006022 | 去除细胞代谢物等杂质 |
参考文献
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin....
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