需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

从水样和组织中提取硅藻DNA

3.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/65792

⸱

2023年11月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hainan Province Tropical Forensic Engineering Research Center, Department of Forensic Medicine, Hainan Medical University, Hainan Provincial Academician Workstation (tropical forensic medicine), 2Hainan Vocational College of Political Science and Law, 3Department of Forensic Medicine, Hebei Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用改良的通用DNA提取试剂盒提取硅藻DNA的实验方案。

摘要

硅藻检测是法医学实践中判断尸体是否溺水以及推断溺水地点的重要辅助手段，同时也是环境与浮游生物领域的重要研究内容。以硅藻DNA为主要研究对象的硅藻分子生物学检测技术，是一种新型的硅藻检测方法。硅藻DNA提取是开展硅藻分子检测的基础。目前常用的硅藻DNA提取试剂盒价格昂贵，增加了相关研究的开展成本。本实验室对通用的全血基因组DNA快速提取试剂盒进行了改良，获得了满意的硅藻DNA提取效果，从而为相关研究提供了一种基于玻璃珠的经济、可行的DNA提取替代方案。采用本方案提取的硅藻DNA可满足多种下游应用需求，如PCR和测序。

引言

在法医学实践中，确定在水中发现的尸体是生前溺水死亡还是死后被抛入水中，对于案件的正确处理至关重要1。这也是法医学实践中亟需解决的难题之一2。硅藻在自然环境中广泛存在（尤其在水体中）3,4。在溺水过程中，由于缺氧和应激反应，个体会产生强烈的呼吸运动并吸入大量溺液。因此，水中的硅藻随溺液进入肺部，部分硅藻可穿过肺泡-毛细血管屏障进入血液循环，并随血流扩散至肝脏、骨髓等内脏器官5,6。在肺、肝、骨髓等内部组织和器官中检出硅藻，是生前溺水的重要证据7,8。目前，法医硅藻检测主要依赖形态学检测方法。通过对组织进行一系列预消化处理后，在显微镜下对未被消化的硅藻进行形态学上的定性与定量分析。该过程需使用硝酸等具有危险性且对环境不友好的试剂，耗时较长，且要求研究人员具备扎实的分类学专业知识和丰富的实践经验。这些因素均给法医工作人员带来一定挑战9。硅藻DNA检测技术是近年来发展起来的一种新型硅藻检测技术10,11,12。该技术通过分析硅藻特有的DNA序列组成，实现硅藻的物种鉴定13,14。常用的检测手段包括PCR技术和测序技术，但其前提是能够成功提取硅藻的DNA。然而，硅藻具有与其他生物不同的特殊结构，导致其DNA提取技术也有所不同。

硅藻的细胞壁具有高度的硅化，其主要成分为二氧化硅15,16,17。硅质细胞壁非常坚硬，在提取DNA之前必须将其破坏。普通的DNA提取试剂盒通常难以直接用于硅藻DNA的提取，因为它们无法破坏硅藻的硅质外壳18。因此，破坏硅藻的硅质外壳是提取硅藻DNA过程中需要解决的关键技术难题之一。

同时，由于法医学研究样本（无论是水样还是溺亡尸体的器官和组织）中所含的硅藻数量通常有限，因此有必要对硅藻进行富集。富集的本质是物质的分离，即在尽可能集中硅藻的同时，最大限度地减少其他物质成分（干扰成分）的含量。在法医工作中，实验室常采用离心或膜过滤的方法来富集分离硅藻细胞19。然而，由于真空抽滤设备尚未广泛普及，膜富集法在一般基层法医实验室中较少使用。因此，离心法仍是目前法医实验室中常用的硅藻富集方法20。

目前，硅藻DNA提取主要应用于法医学实践，但其应用存在显著局限性。当前市场上用于法医学的硅藻DNA提取试剂盒较少，且通常价格昂贵21。本文提供了一种改进的硅藻DNA提取方法，使硅藻DNA提取过程更简便、快捷且经济高效。该方法有助于拓展硅藻后续分子生物学检测的应用，能够通过硅藻检测更有效地解决法医学中与溺水相关的问题。本方法通过添加玻璃珠并设置适当的涡旋时间，破碎硅藻的硅质细胞壁；从而使蛋白酶K和结合液迅速裂解细胞，并灭活细胞内的各种酶。基因组DNA被吸附柱中的基质膜吸附，最终通过洗脱缓冲液洗脱获得。这种改进的全血基因组DNA提取试剂盒显著提升了常规血液试剂盒对法医检材中硅藻DNA的提取效果，降低了法医实践中硅藻DNA提取的成本，更有利于在基层法医研究中推广应用。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究经海南医科大学伦理委员会批准。本研究中使用的组织样本不被视为涉及人类受试者的研究。这些标本系为法医病理学诊断目的而获取，剩余部分用于本实验中的硅藻DNA提取。研究人员无法轻易识别个体，因而无法从相关利益方获得知情同意。

注意：为确保本实验所报告的研究方法具有普遍适用性，本实验基本遵循所用试剂盒的操作说明书，仅对部分步骤进行了修改。本实验所用的水样随机采集自实验室附近的池塘（补充图1A）。本实验以溺亡尸体的肺组织作为研究组织，用于展示提取流程（补充图1B）。在法医学实践中，有时还需利用溺亡尸体的其他器官和组织（如肝脏、脾脏、肾脏、骨髓等）提取硅藻DNA，这需要对该实验方法进行相应的微小改进，相关内容将在实验的相应部分予以说明。本实验所用肺组织样本来自法医案例中明确溺亡的尸体。已通过形态学检测证实肺组织中含有硅藻（补充 图2）。

1. 样品预处理

  1. 水样的预处理
    1. 取10 mL水样加入离心管中，在13,400 × g 条件下离心5 min。用移液枪小心弃去上清液9.8 mL，将底部剩余约200 µL的富集硅藻水样转移至2 mL离心管中。
      注意：可先进行预实验，若10 mL水样富集后不足，可适当增加初始取样量。
  2. 组织样本的预处理
    1. 取溺死尸体肺边缘组织0.5 g，充分剪碎或研磨肺组织至泥状。防止外源性硅藻污染是本步骤的关键。需反复使用剪刀将组织剪碎。

2. DNA 提取

注意：所有离心步骤均在室温下进行。使用离心力为 14,500 × g 的台式离心机；实验开始前需准备好预热至 70 °C 的水浴锅（或金属浴）。所有步骤必须严格遵循无菌操作原则。

  1. 水样和组织的制备
    注意：水样和组织的硅藻DNA提取方法相同。
    1. 将玻璃珠加入含有预处理水样的2 mL离心管中，颠倒混匀10–15次。所加玻璃珠由大、小两种玻璃珠按质量比1:1混合而成，大玻璃珠直径为1.5–2.0 mm，小玻璃珠直径为0.4–0.6 mm。
    2. 取0.5 g充分剪碎的组织，按上述方法将玻璃珠加入含有组织的2 mL离心管中，颠倒混匀10次。
  2. 向各管中加入40 µL蛋白酶K（20 mg/mL），室温放置15 min，期间每3 min颠倒混匀10次。
    注意：若组织未完全消化，可适当增加蛋白酶K用量，直至溶液变澄清。
  3. 向离心管中加入200 µL结合缓冲液，立即涡旋振荡4 min（振荡频率：3000 rpm）。
    注意：此步骤中应严格控制振荡强度和时间，以确保充分混匀。
  4. 将离心管置于70 °C水浴中10 min，溶液逐渐变澄清。
  5. 向离心管中加入100 µL异丙醇，涡旋振荡15 s，此时可能出现絮状沉淀。
    注意：上述操作步骤中需充分混匀，力度适中，但应避免剧烈震荡，以防DNA剪切。
  6. 将上一步所得溶液连同絮状沉淀一同转移至吸附柱中（吸附柱置于收集管内）。吸附柱长度为3.0 cm，直径为1.0 cm，吸附基质为硅基膜。
  7. 在8,000 × g条件下离心30 s，弃去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  8. 向吸附柱中加入500 µL抑制物去除缓冲液，在13,400 × g条件下离心30 s，弃去收集管中的废液。
  9. 向吸附柱中加入700 µL洗涤缓冲液，在13,400 × g条件下离心30 s，弃去收集管中的废液。
    注意：首次使用前，需向洗涤缓冲液瓶中加入指定体积的无水乙醇。
  10. 向吸附柱中加入500 µL洗涤缓冲液，在13,400 × g条件下离心30 s，弃去收集管中的废液。
  11. 将吸附柱重新放入空的收集管中，在14,500 × g条件下离心2 min，尽可能去除残留的洗涤缓冲液，避免其中残留的乙醇抑制后续反应。
  12. 取出吸附柱，放入洁净的离心管中，向吸附膜中央加入100 µL洗脱缓冲液。
  13. 将吸附柱室温静置3–5 min，然后在13,400 × g条件下离心1 min。
  14. 将上一步所得溶液再次加入离心吸附柱中，室温静置2 min，然后在13,400 × g条件下离心1 min。
    注意：洗脱缓冲液应于70 °C水浴中预热约10 min。洗脱体积不应少于50 µL，否则将降低DNA得率。
  15. 将提取的硅藻DNA于2–8 °C保存以备后续使用。若需长期保存DNA溶液，应置于-20 °C保存。

3. PCR 检测

注意：由于法医样本中硅藻的含量通常较低，溺亡尸体的组织样本提取物中可能含有不同程度的自身DNA组织和器官（如本实验中的肺组织）。因此，直接检测DNA提取物中的总DNA并不能反映硅藻DNA的提取情况。本实验选用硅藻特异性引物，通过PCR产物来评估提取物中硅藻DNA的提取效果。产物可通过琼脂糖凝胶电泳进行观察和分析，也可采用实时荧光定量PCR-熔解曲线法进行分析，后者具有更高的灵敏度。

  1. 取水样和组织中提取的 DNA 各 2 µL 作为模板。选择以下两种方法之一进行检测。
  2. 常规 PCR 检测
    1. 使用可特异性扩增硅藻 18S rDNA 片段的引物22。具体信息见表 1。
    2. 根据引物特性建立 PCR 反应体系及扩增条件。具体信息见表 2。
    3. 将 PCR 扩增产物在 2% 琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察并分析成像结果。
  3. 荧光定量 PCR 检测
    1. 使用上述可特异性扩增硅藻 18S rDNA 片段的引物，构建实时荧光定量 PCR 反应体系。具体信息见表 3。
    2. 进行 PCR 扩增，并分析获得的扩增曲线和 Ct 值。同时设置程序，利用荧光定量 PCR 熔解曲线技术，将扩增产物的双链逐步熔解为单链，分析所得的熔解曲线。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

由于目前使用的DNA提取方法所获得的DNA溶液含有样本中不同来源的全部DNA成分，本方案所获得的DNA也不例外。因此，该DNA溶液并非仅含有硅藻基因组DNA。通过查阅文献，筛选出能够特异性扩增硅藻18S rDNA片段的引物22,23,24。利用NCBI-Blast Primer对引物进行验证，结果显示18S rDNA的正向引物D512和反向引物D978为藻类特异性引物，可覆盖多种硅藻物种，且扩增结果未显示任何人类基因。因此，这些引物可作为硅藻检测的可靠DNA生物标志物，被用于本实验结果的验证。以所提取的DNA为模板进行硅藻特异性PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示水样和组织样本中均出现硅藻DNA条带，电泳条带位于250–500 bp之间（更接近500 bp），符合引物预期扩增产物长度范围（390–410 bp）。这表明本提取方案成功提取到了硅藻DNA（图1A、B...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

硅藻细胞由坚硬的硅质细胞壁保护17，因此必须破坏该结构才能提取硅藻DNA。普通的试剂盒难以有效破坏硅藻的硅质外壳，因此成功提取硅藻DNA较为困难21。本实验室对最常用的血液DNA提取试剂盒进行了改进，在硅藻DNA提取过程中加入了不同直径和不同质量比的玻璃珠，并同时进行涡旋振荡，从而充分破碎硅藻外壳，提高硅藻DNA的提取效果。如先前报道所述21，玻璃珠的直径、振荡强度和时间会直接影响DNA提取的质量。涡旋振荡时间不宜过长（不超过10分钟），若时间过长，DNA会因过度振动而断裂；同时，时间也不宜过短，若时间过短（不少于2分钟），硅藻外壳无法完全破碎，将导致DNA提取效率低下。在选择玻璃珠时，应选用具有不同周长直径的玻璃珠，其中较大的玻璃珠可保证碰撞强度，较小的玻璃珠则确保在碰撞破碎过程中玻璃珠之间无碰撞死角，从而提高破壳效率。

为了从样品中提取硅藻DNA，通常需要对硅藻进行富集。该过程对硅藻DNA的提取具有重要影响。富集的目的是提高样品中硅藻的...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由国家自然科学基金（82060341，81560304）和海南省院士创新平台科研项目（YSPTZX202134）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
结合缓冲液BioTekeB010006022快速裂解细胞
ChemoHS qPCR MixMonad00007547-120506qPCR Mix
D2000 DNA LadderReal-Times(北京)生物科技RTM415测定电泳条带位置
D512泰和生物技术TW21109196正向引物
D978泰和生物技术TW21109197反向引物
洗脱缓冲液BioTekeB010006022低盐洗脱缓冲液用于洗脱DNA
玻璃珠英旭化工机械(上海) 70181000用于分散和研磨的专用玻璃珠
吸附柱BioTekeB2008006022含硅胶膜基质的吸附柱
抑制物去除缓冲液BioTekeB010006022DNA提取过程中去除抑制物
异丙醇BioTekeB010006022沉淀或分离DNA
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206振荡作用
蛋白酶KBioTekeB010006022灭活细胞内核酸酶及其他蛋白质
Rotor-Gene Q 5plex HRMQiagenR1116175实时荧光定量PCR
高速微量离心机Scilogex9013001121离心
Tanon 3500R 凝胶成像系统Tanon16T5553R-455凝胶成像
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
热循环仪珠海黑马VRB020A普通PCR
洗涤缓冲液BioTekeB010006022去除细胞代谢物等杂质

参考文献

  1. Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
  2. Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).
  3. Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
  4. Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241(2017).
  5. Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059(2022).
  6. Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
  7. Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).
  8. Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
  9. Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
  10. Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
  11. Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
  12. Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
  13. Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
  14. Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008(2021).
  15. Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
  16. Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
  17. Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
  18. Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).
  19. Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
  20. Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
  21. Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
  22. Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
  23. Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
  24. Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
  25. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  26. Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
  27. Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097(2019).
  28. Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
  29. Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398(2017).
  30. Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
  31. Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145(2020).
  32. Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
  33. Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793(2014).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

DNA K PCR
从水样和组织中提取硅藻DNA
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。