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人类房水和玻璃体液活检样本的生物样本库建立用于分子分析

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DOI：

10.3791/65804

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2023年9月11日

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1Molecular Surgery Laboratory, Stanford University, 2Department of Ophthalmology, Byers Eye Institute, Stanford University, 3Department of Ophthalmology and Visual Neurosciences, University of Minnesota, 4Retina Consultants of Minnesota, 5Department of Pediatrics, University of Iowa, 6Department of Neurology, University of Iowa, 7The Iowa Neuroscience Institute (INI), University of Iowa, 8Department of Physiology and Pharmacology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 9Department of Biochemistry and Molecular Biology, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 10Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

本文内容

摘要

本方案介绍了一种集成化的生物样本库平台，用于标准化采集、注释和保藏高质量的人类房水和玻璃体液活检样本，以用于后续分子分析，包括蛋白质组学、代谢组学和糖组学。

摘要

转化医学研究中的一个关键挑战是在手术室（OR）的患者护理与科研实验室之间建立一个可行且高效的接口。本文中，我们开发了一种从接受眼科手术的患者房水和玻璃体中获取高质量液体活检样本用于分子分析的实验方案。该工作流程使用一种配备有计算机、条形码扫描仪和实验室仪器（包括内置冷藏设备）的移动手术室实验室接口（MORLI）推车，用于获取并存档人类生物样本。一个基于网络、符合数据隐私规范的数据库可对每个样本在其整个生命周期中进行注释，而笛卡尔坐标系统则可追踪存储过程中每个带条形码的样本，从而实现下游分析所需样本的快速且准确的检索。对人体组织样本的分子表征不仅可作为诊断工具（例如，用于区分感染性眼内炎与其他非感染性眼内炎症），而且也是转化医学研究的重要组成部分，有助于发现新的药物靶点、开发新的诊断工具以及实现个体化治疗。

引言

对人眼液体活检样本进行分子谱分析，可获取富含局部特异性分子的体液，这些分子包括来自高度特化眼组织的 DNA、RNA、蛋白质、聚糖和代谢物。从人眼后房玻璃体获取液体活检样本已被证实为一种总体安全的 procedure1。该方法能够在活体人类中实现眼部疾病的分子表征，并有望发现新的诊断和治疗策略2,3,4。眼眼前房的房水具有更高的手术可及性，可在大量临床操作中获取，例如在白内障手术期间——这是目前开展最频繁的手术之一。然而，截至目前，尚无针对人眼房水和玻璃体液体活检样本的标准化采集、注释及生物样本库保存方案，以支持包括蛋白质组学、代谢组学和聚糖组学在内的下游分子分析。

本文中，我们建立了一种用于采集和生物保存高质量液体活检样本的方案，这些样本来自接受眼科手术的患者，可用于后续分子分析。移动手术室实验室接口（Mobile Operating Room Lab Interface, MORLI）使研究人员能够在手术室内立即将采集的样本加入条形码冷冻管中，并在干冰上快速冷冻至 -80 ˚C。该流程可确保样本在后续分子分析中保持高且稳定的质量。除样本质量优良外，生物样本库中样本的准确注释也至关重要。我们采用基于网络、符合美国健康保险可携性与责任法案（HIPAA）要求的研究电子数据采集系统（REDCap）数据库5，可在工作流程中为每份样本存储详细的元数据，包括年龄、性别、疾病类型、疾病分期、样本类型以及手术的独特特征。这将支持未来对特定疾病或特定患者群体样本的精确检索。此外，我们使用笛卡尔坐标网格系统归档每份样本在冰箱中的精确位置，从而实现下游实验时样本的高效提取。本文展示了DNA、蛋白质、糖链及代谢物分析的应用实例。

我们的工作流程代表了手术室与研究实验室之间一种切实有效的衔接，并为转化研究提供了宝贵的基石。

方案

该方案遵循美国斯坦福大学机构审查委员会（IRB）关于人体受试者研究的指南。

警告：本方案仅作为有资质的眼科外科医生的操作指南。在眼内恶性肿瘤的情况下，房水或玻璃体液体活检可能导致眼外肿瘤种植，此风险不能完全排除。然而，经玻璃体脉络膜肿瘤活检若以增强安全的方式进行，并谨慎考虑穿刺部位，则发生眼外扩散和眼眶受累的风险极低6。本方案不适用于视网膜母细胞瘤或具有高转移风险的肿瘤，且在这些情况下可能属禁忌。

1. 样本采集前

  1. 机构审查委员会批准
    1. 在实验开始前获得当地机构审查委员会（IRB）的批准，并据此进行样本采集。
  2. 研究人群
    1. 纳入标准：纳入所有在本机构接受眼内手术的患者（年龄0 - 99岁），其手术过程中可获取足量的房水或玻璃体液，超出为评估患者病情所需进行的常规诊断检测的用量，且患者自愿参与研究。
    2. 排除标准：排除拒绝参与研究的患者以及孕妇。

  1. 知情同意
    1. 根据经机构审查委员会（IRB）批准的方案，从每位患者处获取书面知情同意书。
    2. 将签署的同意书存档至受保护的安全数据库中。
    3. 对相关人员（外科医生、实验室技术人员、手术室（OR）工作人员、科研人员）进行培训，培训内容如本方案所述。
    4. 建立样本管理数据库。使用REDCap作为符合HIPAA标准的基于网络的样本数据库，用于支持科研项目的数据采集5。
      注：本文描述了如何使用REDCap提供的网络界面来设计表单、定义字段、设置分支逻辑以及应用数据验证规则，而无需具备 extensive programming knowledge。此外，其他软件（如标准电子表格应用程序）也可能适用。
    5. 确保准备冷藏箱、干冰、用于样本采集的注射器以及冻存管（见材料表）。使用条形码永久蚀刻在管壁上的冻存管，以避免在冻存管上额外标注患者标识，防止在低温条件下标签脱落或丢失。
    6. 至少在预定手术时间前24小时，通知负责该病例的外科医生以及将在手术室协助样本采集的实验室技术人员。

2. 手术室中手术标本的获取

  1. 移动手术室实验室接口（MORLI）
    1. 在手术室内建立一个MORLI。MORLI包括一个平整的实验台面、一台带有条形码扫描仪并可访问REDCap数据库的计算机/平板设备，以及一个装有干冰的冷藏箱（参见材料表）。
      警告：干冰温度极低。操作干冰时务必佩戴手套，避免直接接触。
  2. 手术室样本采集的准备工作
    1. 登录MORLI上的计算机/平板设备，并打开REDCap数据库。
    2. 确认患者已签署知情同意书，并与外科医生核实。提醒其需要采集未稀释的样本。
    3. 佩戴手套。取用适当数量的带条形码冻存管（房水样本使用0.5 mL，玻璃体样本使用1.9 mL），并将其放置在便于取用的位置。
  3. 房水液体活检的采集
    警告：应将人体组织样本视为生物危害材料，需采取适当的防护措施（如穿戴实验服和手套），以确保相关人员的安全。
    注意：以下步骤仅可由经过培训的眼科外科医生执行。房水液体活检可在例如白内障手术开始时采集，白内障手术是全球最常见的手术之一。
    注意：手术室中应按照标准护理规程维持无菌区域。与患者麻醉相关的术前操作应遵循前房和玻璃体视网膜手术的标准护理步骤。
    1. 为手术准备并覆盖眼部，放置无菌眼睑撑开器，以获得最佳的无菌视野。
    2. 使用手术显微镜，将连接1 mL注射器的30–32 G针头垂直于角膜缘进行前房穿刺。在此过程中使用棉签或小型镊子稳定眼球。
      注意：确保针头与注射器已锁定，且注射器内无压力（通过移动活塞确认）。确保针尖保持在前房中部的周边虹膜上方，以避免损伤眼内结构。在白内障手术中，采集液体活检的针头也可通过为白内障手术所建立的其中一个副切口进入前房。
    3. 在显微镜直视下，使用1 mL注射器手动抽吸约100 µL未稀释的房水。使用术者非优势手或经培训的助手移动注射器活塞，过程中不得移动针头。
      注意：若前房可能发生塌陷，则应采集少于100 µL的房水。
    4. 小心地将针头从前房中取出。
      注意：在有晶状体眼中，应使针头保持在虹膜上方，避免接触晶状体。眼球正压可能增加反流，针头拔出前先松开棉签有助于减少反流。
    5. 回拉活塞，观察空气和采集液体的流动情况。
    6. 将注射器插入冻存管中，多余的空气可清除注射器的死腔。
    7. 使用冻存管上的条形码，在手术室内的计算机上扫描样本至REDCap表单（详见步骤3.1至3.9）。
    8. 立即将冻存管转移至冷藏箱中的干冰上。
    9. 继续为患者进行原定的手术（例如如前所述的白内障手术7）。
  4. 玻璃体液体活检的采集
    注意：以下步骤仅可由经过培训的玻璃体视网膜外科医生执行。玻璃体液体活检可在玻璃体切除术开始时采集8。由于目标是采集未稀释的玻璃体样本，因此玻璃体切割头不会预先注入液体1。
    注意：手术室中应按照标准护理规程维持无菌区域。与患者麻醉相关的术前操作应遵循前房和玻璃体视网膜手术的标准护理步骤。
    1. 为手术准备并覆盖眼部，放置无菌眼睑撑开器，以获得最佳的无菌视野。
    2. 按照标准护理程序，使用23、25或27 G套管针创建巩膜切口。插入灌注套管，并目视确认其在玻璃体腔内的正确位置。
    3. 在玻璃体腔内，激活玻璃体切割头但不进行灌注，以采集未稀释的玻璃体样本。使用连接至玻璃体排出套管的注射器手动抽吸0.5至1.0 mL玻璃体1。
    4. 将玻璃体切割头从眼内取出，并开启液体灌注。
    5. 将管路内剩余液体抽吸至注射器中。
    6. 断开注射器连接。
    7. 按照第2.3节（步骤2.3.5至步骤2.3.9）中所述方法处理样本，如同房水标本。

3. 手术室中样本的处理及样本添加至数据库

  1. 请实验室技术人员取准备好的冻存管（前房水样本使用0.5 mL，玻璃体样本使用1.9 mL），在不接触任何无菌手术室设备的情况下，将冻存管递给手术医生。
  2. 请实验室技术人员打开冻存管。
  3. 将注射器内容物直接卸入冻存管中。
  4. 请实验室技术人员立即盖紧冻存管盖。
  5. 请实验室技术人员返回MORLI处，并立即将样本转移至冷却箱中的干冰上（-80 ˚C），并盖上箱盖。
  6. 打开一份新的样本采集表，在相应字段中输入以下信息：主刀医生、采集地点和日期、患者标识号，以及其他基本信息，如年龄、性别、左眼或右眼、诊断结果、术前病史（自由文本）、手术相关信息（例如手术类型），以及样本信息，如采集的样本数量、样本类型（前房水、玻璃体）和其他细节（如体积）。使用条形码扫描仪添加试管条形码。
  7. 点击 提交/下一步。
  8. 若采集了其他样本，请重复步骤3.1至3.7。
  9. 当所有样本均妥善保存后，在REDCap样本采集表上点击 保存并提交，然后退出数据库及计算机/平板设备。

4. 将冻存管转移至储存位置

  1. 将样本置于装有干冰的冷藏箱中，从手术室运送至实验室，并将其放置在实验台上的实验电脑旁。
  2. 使用您的登录账号和密码，登录实验电脑上的 REDCap 系统。
  3. 佩戴手套，取出一个已采集的样本，将冻存管上的条形码扫描录入数据库（详见第5节）。随后立即将样本放回干冰上。
  4. 准备另一个装有干冰的容器。
  5. 从 -80 °C 冰箱中取出一个冻存管架，放入装有干冰的第二个容器中。
    注意：0.5 mL 房水样本管需使用 96 孔格式管架，1.9 mL 玻璃体样本管需使用 48 孔格式管架。
  6. 将管架的条形码扫描录入数据库（详见第5节）。
  7. 将样本转移至管架中。
  8. 将冻存管在管架中的位置信息录入数据库（详见第5节）。
  9. 点击 保存并提交。
  10. 将装有冻存管的管架置于干冰上，运送至 -80 °C 冰箱进行储存。根据坐标系统将管架放置于冰箱内的指定位置，以便后续分析时能够快速找回样本。

5. 样品储存表格

  1. 在录入表阶段，为采集的每份样本填写一份储存表。点击 空心圆 或 "+" 在……下方 样品储存 创建并打开一个新的存储表单。
  2. 填写本表格的日期 记录归档日期.
  3. 扫描或输入试管条形码 样本管条形码立即将样品放回干冰上。
  4. 选择样本是转出还是进入内部生物样本库储存。
  5. 确认已获取患者的书面知情同意，并勾选下方的复选框 验证知情同意合规性 并在下方输入您的姓名 知情同意由.
  6. 选择一个空置且合适的位置放置冻存管。将冻存管转移至架中的该位置（例如 A1 位），并将架子置于干冰上。
  7. 在 位置 相，输入以下信息：冰箱的位置位于 冷冻机样本将被存放的货架编号 架子，盒子下方的条形码 盒条形码，试管在盒子中的位置按行（管位置（行））和列（管位置（列）).
    注意：可选择在下方输入箱体标签 盒标签，这有助于在冰箱中找到该盒子。
  8. 在……之下 使用方法 切片，输入以下信息：样本所用项目的名称（项目名称），样本量属于以下类别之一：满管、部分、近空或空管（样本体积），以及适用情况下的储存说明 储存说明.
    注意：为确保可按需审查和审计，表单最后一次访问的日期、时间和用户将自动填充，以建立可追溯的责任链。
  9. 通过点击确认表格已填写完成 完成 在……下方 完成？.
  10. 点击 保存 & 退出表单这将使您返回患者概览界面。
  11. 为采集的每支试管，通过点击生成另一份样本采集表 "+" 在……下方 样品储存然后重复步骤 5.1 至 5.10。
  12. 点击 保存并退出 填写表格并退出数据库及计算机/平板设备。
  13. 将样本架（置于干冰上）转移至冰箱中预先指定的位置。

6. 获取手术标本以进行后续分析

注意：样本通常在分析前会被存档数年。条形码冻存管和可搜索的 REDCap 数据库系统可方便地查找和定位每个样本，以便进行后续分析。

  1. 通过数据库的搜索功能确定实验所需的感兴趣样本。例如，可查找年龄在20至40岁之间、患有糖尿病视网膜病变的所有房水样本。
  2. 获取目标冻存管的位置信息（冰箱、层/架、样本架、架内坐标）。将其记录下来、打印出来，或在移动计算机/平板设备上保存，以便在冰箱中快速定位样本。
  3. 在数据库中标记这些样本为已使用。
  4. 点击 保存并退出 以完成表单填写，并退出REDCap系统及计算机/平板设备。

结果

所收集的液体活检样本可进行多种分子分析，包括对DNA、蛋白质、糖类和代谢物的分析。先前已有研究表明，在-70 °C下长期保存数年并不会显著影响蛋白质组谱的完整性9。REDCap数据库可实现样本的简便快速检索。可通过数据库查找特定患者群体的样本，例如所有患有糖尿病视网膜病变的患者。数据库将提供相应样本管的条形码及其在存储设备中的位置信息。截至目前，我们已收集并归档了超过1,000份液体活检样本。该数据库使我们能够快速找到用于下游分析的样本3,10，并协助完成了以下实验。

一名17岁女性出现视网膜和视神经炎症。该患者存在免疫功能低下，需考虑感染的可能性。采集其右眼房水并送检DNA PCR分析。检测结果提示巨细胞病毒阳性，而单纯疱疹病毒和弓形虫病检测为阴性。这些发现表明，房水液体活检有助于区分感染性与非感染性眼内炎症，这对于选择适当的治疗方案至关重要。

液相色谱-质谱联用技术能够对蛋白质组进行无偏倚且半定量的分析。在对接受玻璃体切除术患者的玻璃体液进行液体活检时，该技术成功鉴定了484种独特蛋白质，包括补体C3（C3）、视蛋白（OPTC）和II型胶原α1链（COL2A1）（图1A）。

采用糖蛋白质组学多重ELISA（见材料表）11对三份玻璃体液活检样本进行了分析。该检测可识别500种人类蛋白质的糖基化谱型，涵盖多种生物学通路，如代谢、免疫应答、细胞黏附和肌动蛋白组织（图1B）。

采用毛细管电泳联用傅里叶变换质谱法进行代谢组学筛查12（见材料表），在三份房水液体活检样本中鉴定出292种不同的代谢物。通路分析（见材料表）13鉴定出多种代谢通路，包括氨基酸代谢、尿素循环和肉碱合成（图1C）。

蛋白质组学、糖蛋白质组学和代谢组学数据分析；图表、网络图、p值。
图1：代表性结果。（A）采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）对人玻璃体液进行蛋白质组学分析，在单次液体活检中鉴定出484种独特蛋白质。图中显示了蛋白质水平，并根据谱图计数进行排序。代表性蛋白质以蓝色标出。（B）利用糖蛋白质组学多重ELISA检测了三个玻璃体液体活检样本中500种独特蛋白质的糖基化水平。STRING蛋白相互作用分析识别出蛋白互作簇（仅显示包含至少10种蛋白质的簇）。每个簇中最显著富集的通路已标出。（C）采用质谱法进行代谢组学分析，在三个房水液体活检样本中鉴定出292种不同的代谢物。每个点代表一个样本。柱高表示代谢物的平均数量，误差线表示标准差。右侧面板显示显著富集的通路，其中分子为检测到的代谢物数量，分母为各通路中代谢物的总数。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

患者的手术标本可实现对活体人类疾病进行直接的分子表征2,3,4,14，有助于克服细胞和动物疾病模型无法完全模拟人类疾病局限性15,16。对人体组织进行分子分析可能有助于筛选新的药物靶点，并提高临床试验成功率及药物获批的可能性17。此外，该方法具有实现个体化医学的潜力，因为所获取的组织保留了每个个体独特的基因组、表观基因组、代谢组、糖组和蛋白质组特征指纹2,18,19。

高且稳定的样本质量是所有分子分析应用的基础。先前的研究表明，样本采集后立即冷冻以及避免反复冻融循环，对保证高质量样本至关重要9,20。在 -70 °C 下长期保存数年，并未显著影响蛋白质组谱的完整性9。当采样过程涉及多名人员（如外科医生、技术人员等）或不同机构时，标准化操作流程是减少偏差、提高科研数据可比性的重要基础。除样本质量外，样本注释是另一个需要标准化的重要因素，以实现分子研究结果与临床数据之间的关联分析。本方案基于三个核心原则来实现上述目标：1）由眼科医生采用标准化流程采集房水和玻璃体液活检样本；2）实验室人员在手术室立即处理样本并进行速冻；3）将每份样本的元数据注释录入基于网络的数据库，以便研究人员能够快速查找适用于后续实验的样本。

除了玻璃体标本20外，该实验流程还建立了用于分子分析的房水液体活检样本的标准化采集方法。房水是位于眼球前房的一种易于获取且成分复杂的液体，不仅可反映眼前段的眼部疾病，也能反映眼后段（包括视网膜疾病）的病变情况18,21。此外，由于房水样本可在白内障手术等常规手术中大量采集（白内障手术是全球最常见的外科手术之一），这些特点使其成为获取人眼液体活检样本的极具潜力的来源。本实验流程中建立的每个样本的标准化元数据注释，还可实现蛋白质组数据与前瞻性临床随访数据之间的关联分析，从而为发现新的预后生物标志物提供令人期待的机会，有助于评估未来患者的疾病预后。

然而，对人体手术标本进行分子分析也存在重要局限性。例如，复杂的实验操作通常只能在动物模型或细胞模型中实现。一种解决方案是将动物或细胞模型的分子特征与人类疾病的分子特征进行比较。该策略可识别出在动物或细胞模型中重叠的蛋白质生物标志物和治疗靶点，并对其进行验证，以筛选出与人类疾病相关且最有可能在临床试验中取得成功的候选分子4,16。

综上所述，我们的工作流程在手术室与研究实验室之间建立了一个实用的接口，能够标准化且高通量地收集、注释和储存高质量的手术标本，用于后续分子分析，为未来的转化研究提供了宝贵的基础。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

VBM 得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金（R01EY031952、R01EY031360、R01EY030151 和 P30EY026877）、斯坦福视盘玻璃膜疣研究中心以及美国防盲研究组织（Research to Prevent Blindness, New York, USA）的支持。JW 和 DR 得到了美国玻璃体视网膜手术基金会（VitreoRetinal Surgery Foundation, USA）的支持。DR 还得到了由伦德贝克基金会（Lundbeck Foundation）资助的 DARE 奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.5 ml 三色编码管，96孔格式，外螺纹Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA68-0703-12用于房水样本
1 mL 注射器外科级，医院现有可用型号-用于房水活检
1.9 ml 三色编码管，48孔格式，外螺纹Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA65-7643用于玻璃体样本
3 mL 注射器外科级，医院现有可用型号-用于玻璃体活检
30–32 号针头外科级，医院现有可用型号-用于房水活检
毛细管电泳联用傅里叶变换质谱仪（CE-FTMS）Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan--
Constellation 玻璃体切除系统，配备 23、25 或 27 号套管穿刺系统Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA-用于玻璃体活检
冷藏箱标准泡沫聚苯乙烯箱，实验室现有可用型号--
干冰实验室现有可用型号--
Handsfree 标准范围扫描仪套件，带屏蔽 USB 电缆Zebra Symbol DS9208-SR4NNU21Z条形码扫描仪
人糖基化抗体芯片 L3 RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USAGAH-GCM-L3-
Mac miniApple Inc., Cupertino, CA 95014, USA--
MetaboAnalyst 软件Pang et al., 2021, PMID: 34019663--
0.5 ml 管架，96孔格式Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA66-51026用于房水样本
1.9 ml 管架，48孔格式Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA65-9451用于玻璃体样本
基于浏览器的 REDCap 样本数据库REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org--

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