将胰腺导管腺癌重编程为多能性

摘要

本方案描述了将胰腺导管腺癌（PDAC）细胞和正常胰腺导管上皮细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）的方法。我们提供了一套优化且详细的逐步操作流程，从慢病毒的制备到建立稳定的iPSC细胞系。

摘要

利用转录因子诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）已几乎可从任何分化的细胞类型中实现，并在科研和临床应用中展现出极高的价值。有趣的是，对胰腺导管腺癌（PDAC）等癌细胞进行iPSC重编程已被证明能够逆转其侵袭性PDAC表型，并克服癌症表观遗传组的异常。由PDAC细胞衍生的iPSCs在分化过程中可重现PDAC从早期胰腺上皮内瘤变（PanIN）前体开始的疾病进展过程，揭示PDAC进展早期发生的分子与细胞变化。因此，PDAC来源的iPSCs可用于模拟PDAC的最早期阶段，从而发现可用于早期检测的诊断标志物。这一点对于PDAC患者尤为重要，因为目前缺乏可靠的PanIN早期阶段生物标志物，导致大多数患者通常在晚期转移阶段才得以确诊。然而，将包括PDAC在内的癌细胞系重编程为多能状态仍面临挑战，过程繁琐且不同细胞系之间的效率差异显著。本文中，我们描述了一种使用双顺反子慢病毒载体从多种人源PDAC细胞系生成iPSCs的更为稳定一致的实验方案。所获得的iPSC细胞系具有良好的稳定性，无需依赖外源性重编程因子表达或诱导药物的持续存在。总体而言，该方案有助于高效生成多种PDAC来源的iPSCs，这对于发现更具特异性和代表性的PDAC早期生物标志物至关重要。

引言

胰腺导管腺癌（PDAC）是最致命的恶性肿瘤之一，由于该疾病早期无明显症状，早期诊断仍然具有挑战性。大多数PDAC患者在确诊时已处于晚期转移阶段，此时可用的治疗选择极为有限^1,2。这主要是因为缺乏可用于早期阶段的可靠生物标志物，例如那些可被方便检测到的、释放到血液中的蛋白质类标志物。

胰腺导管腺癌（PDAC）在其进展过程中可很早发生播散，当PDAC局限于胰腺时进行早期癌症检测与较好的预后相关³。然而，仅有不到十分之一的PDAC患者被诊断时处于有利预后阶段，从而能够接受手术切除。即便如此，这些少数可切除肿瘤的患者中，也有很大比例在12个月内出现肿瘤复发⁴。

在过去五十年中，外科手术技术、患者护理和治疗方式已取得显著进步^5,6。然而，接受手术切除的胰腺导管腺癌（PDAC）患者的5年生存率仅略微提高至17%。尽管如此，这一数据仍优于未接受切除手术的患者，后者生存率几乎未变（0.9%）^4,7

方案

所有实验方案均经俄勒冈健康与科学大学（OHSU）机构审查委员会批准。所有方法均按照相关指南和法规进行。涉及PDX肿瘤的动物实验均在获得OHSU机构动物使用与护理委员会（IACUC）批准后开展。本方案已在以下细胞中进行测试：来自患者来源的异种移植（PDX）模型的原代PDAC细胞、具有上皮形态的BxPc3细胞系（该细胞系分离自一名61岁女性腺癌患者的胰腺组织）、源自正常人胰腺导管上皮的H6C7永生化上皮细胞系，以及来自健康个体皮肤活检的原代人成纤维细胞。人PDAC样本取自俄勒冈胰腺组织登记研究（IRB00003609）。所有受试者均签署了知情同意书。原代人成纤维细胞由英国爱丁堡RBiomedical公司提供，其皮肤样本来自在英国爱丁堡皇家医院Little France院区接受常规手术的匿名供体，采集过程已获得供体同意并经伦理批准（编号09/MRE00/91）。所有慢病毒相关工作均在二级生物安全研究活动（GM207/16.6）条件下进行，并已获得爱丁堡大学健康与安全部门批准，同时已向苏格兰政府HSE主管机构报备。所有使用人胰腺细胞的重编程实验均在爱丁堡大学生物科学学院伦理委员会批准下进行（参考编号# asoufi-0002）。

1. 慢病毒的制备

1. 用于慢病毒制备时，准备高质量的包装质粒和表达质粒（无内毒素），浓度为1–2 µg/µL，包括psPAX2、pMDG³⁴，以及两种含有RES的双顺反子载体：pSIN4-....

结果

图1展示了来自PDAC、BxPc3、H6C7和hFib细胞的iPSC集落形态的代表性图像。图1中可见，PDAC-iPSC集落在重编程第25天开始形成，到第40天时出现形态更成熟的、具有典型胚胎干细胞样特征的iPSC集落（图1）。同样，BxPc3-iPSC集落在重编程第23天开始出现，并于第35天趋于成熟。H6C7-iPSC的形成过程与PDAC-iPSC相似，从第45天开始逐渐形成稳定集落。hFib-iPSC集落则在重编程第15天即开始形成。

讨论

为了促进利用iPSC重编程技术研究癌症进展，目前已建立了一种用于重编程胰腺癌细胞的稳健方案。迄今为止，将癌细胞重编程为多能状态已被证明极具挑战性，仅有少数研究成功地从癌细胞中生成了iPSC^{32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇（50 mM）	Thermo Fisher	31350010
Alexa Fluor 488 抗人 TRA-1-60-R	BioLegend	330613
牛垂体提取物（BPE）	Thermo Fisher	13028014
BxPc3	ATCC	CRL-1687
霍乱弧菌来源的霍乱毒素	Merck	C8052-1MG
大鼠尾胶原，I型溶液	Merck	C3867
完全配制的定义型K-SFM培养基	Thermo Fisher	10744-019
Corning Costar 经组织培养处理的多孔板	Merck	CLS3516
Corning 注射器滤器	Merck	CLS431231
Corning 经组织培养处理的培养皿	Merck	CLS430599
Day Impex Virkon 杀病毒消毒片	Thermo Fisher	12328667
Dulbecco′s 磷酸盐缓冲液（PBS）	Merck	D8537
胎牛血清（FCS）	Thermo Fisher	10270-106
Fugene HD 转染试剂	Promega	E2312
明胶溶液，B型，2% 溶于 H2O	Merck	G1393-100ML
格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）	Merck	G5154
人 EGF 重组蛋白	Thermo Fisher	PHG0311
人碱性成纤维细胞生长因子（FGF-2/bFGF）（154个氨基酸）重组蛋白，PeproTech	Thermo Fisher	100-18B
人胰腺导管上皮细胞系（H6c7）	Kerafast	ECA001-FP
iMEF 饲养层细胞	iXcells Biotechnologies	10MU-001-1V
角质形成细胞无血清培养基（KSFM）	Thermo Fisher	17005-042
KnockOut DMEM	Thermo Fisher	10829018
KnockOut 血清替代物	Thermo Fisher	10828028
L-谷氨酰胺（200 mM）	Thermo Fisher	25030-024
MEM 非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	Thermo Fisher	11140050
Millex-HP 0.45 μm 注射器滤器单元（无菌）	Merck	SLHP033RS
Opti-MEM 减血清培养基	Thermo Fisher	31985062
pMDG	AddGene	187440
聚凝胺（Hexadimethrine bromide）	Merck	H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M	AddGene	21164
pSIN4-EF2-O2S	AddGene	21162
psPAX2	AddGene	12260
pWPT-GFP	AddGene	12255
RPMI 1640 培养基（ATCC 改良型）	Thermo Fisher	A1049101
丙酮酸钠	Thermo Fisher	11360-039
一次性无菌注射器（60 mL）	Thermo Fisher	15899152
TrypLE Express 酶（1倍浓度），含酚红	Thermo Fisher	12605036
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Thermo Fisher	15575020
Y-27632（盐酸二氢盐）	STEMCELL Technologies	72304