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方法文章

优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序

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DOI：

10.3791/65831

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2023年10月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Stanford University

本文内容

摘要

本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x Genomics平台的多组学测序，内容包括组织解离条件、单细胞悬液的冷冻保存以及分离细胞核质量评估的建议。

摘要

多组学测序技术可提供同一细胞或配对单细胞的RNA测序与转座酶可及染色质测序（ATAC-测序）数据，使我们对肿瘤细胞异质性的解析能力取得重大突破，而肿瘤细胞异质性正是当前转化癌症研究的主要焦点。然而，采用这一先进方法所获得测序数据的质量在很大程度上取决于输入样本的质量。

需要优化消化条件，以在不牺牲细胞质量的前提下最大化细胞得率。对于具有致密的纤维化基质的实体瘤而言，这一过程尤为具有挑战性，因为必须温和地降解这些基质以释放细胞。从实体瘤组织中新分离的细胞比从细胞系中分离的细胞更为脆弱。此外，由于所分离的细胞类型具有异质性，因此应选择能够支持整个细胞群体的实验条件。

最后，必须根据这些特性优化细胞核分离条件，包括裂解时间以及试剂类型和比例。本文中，我们介绍了从实体瘤样本中进行细胞核分离以用于10x Genomics多组学测序平台的经验。我们提供了组织消化、单细胞悬液储存（如需要）以及细胞核分离与评估的建议。

引言

随着我们对肿瘤生物学的认识不断深入，分析肿瘤微环境中异质性细胞的重要性也日益增加1,2。能够在同一细胞中以配对细胞的方式（multiome测序）同时获取单细胞RNA以及转座酶可及染色质测序（ATAC-sequencing）数据，是实现这一目标的重要进展3,4。然而，这些实验成本高昂且耗时，所获得数据的质量和影响力在很大程度上依赖于实验条件和材料的质量。已有标准化的细胞核分离方案发表5,6。由于从实体瘤样本中新分离的细胞比细胞系中分离的细胞更为脆弱，因此新鲜且具有异质性的组织需要对方案进行优化。

另一个需要考虑的因素是，对于实体瘤而言，手术标本通常要到当天较晚时候才能从手术室送达。因此，一般无法在获取样本后直接进入细胞核捕获步骤，而必须经过冷冻保存环节。根据我们的经验，将单细胞悬液进行冷冻可获得质量最高的细胞核（相比直接速冻完整组织或其他保存方式）。这一优势在富含RNase的酶解组织类型（如胰腺）中尤为明显。

组织消化条件的设计还需在不牺牲细胞质量的前提下，最大限度地提高细胞得率7。对于具有致密间质纤维化基质的实体瘤类型8，必须温和地降解细胞外基质以释放细胞。此外，由于所分离的细胞类型具有异质性，因此应调整条件以支持整体细胞群体的存活。本方案中使用人胰腺癌（胰腺导管腺癌）样本。胰腺癌是一种高度纤维化的肿瘤类型，其组织和细胞通常具有较强的黏附性。而且，由于可用于研究的胰腺肿瘤标本通常体积较小，因此需尽可能提高所获取细胞的数量。

细胞核的分离在细胞裂解条件和时间，以及试剂种类和比例方面需要进行最大程度的优化。在整个分离过程中对细胞核的操作也需格外小心。本文中，我们介绍了从实体瘤组织中优化细胞核分离以用于10x Genomics多组学测序平台的经验（图1）。我们提供了组织消化、单细胞悬液的冷冻保存（如需要）以及细胞核分离的建议。

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方案

人胰腺癌（胰腺导管腺癌）样本根据本实验室经机构审查委员会（IRB）批准的方案获取，并已从患者处获得组织采集的知情同意。组织样本从手术室运送至实验室后，按如下步骤进行处理。

1. 组织解离（消化）

  1. 准备消化缓冲液（参见 材料表）。
  2. 肿瘤切除后尽快获取目标组织，并将样本置于淬灭缓冲液（含约 5% 胎牛血清的 DMEM F-12）或 1× PBS 中，冰上运输。
  3. 在 90 mm 培养皿中加入 3–5 mL 消化缓冲液，使用洁净的镊子和剪刀将组织剪碎（图 2A）。
  4. 将剪碎的组织转移至 50 mL 圆锥形离心管中，加入约 10 mL 消化缓冲液，在 37 °C 条件下振荡消化 30 分钟（可使用带振荡功能的水浴或干式振荡器）。
  5. 从振荡器中取出后，加入约 20 mL 淬灭培养基终止反应，然后将悬液通过 100 µm 细胞滤网过滤至洁净的圆锥形离心管中。
  6. 收集滤网上残留的固体组织（如有需要可再次剪碎），放入约 10 mL 新鲜消化缓冲液中，在 37 °C 振荡条件下继续消化 30 分钟。重复此步骤，直至所有肿瘤组织完全解离。
  7. 合并细胞悬液，先经 70 µm 滤网、再经 40 µm 滤网依次过滤，收集至冰上预冷的洁净圆锥形离心管中。
  8. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟沉淀细胞，随后弃去上清液。

2. 冷冻保存

  1. 用1 mL 1× PBS重悬细胞沉淀，洗涤细胞。
  2. 将细胞悬液（每管约1–1000万细胞为最佳冻存数量）转移至预冷的1.5 mL冻存管中，置于冰上。
  3. 在4 °C条件下，以500 × g 离心5分钟使细胞沉淀，然后弃去上清液。
  4. 用1 mL Bambanker冻存液重悬细胞，转移至1.5 mL或2 mL冻存管（图2B），使用含100%异丙醇的程序降温盒以-1 °C/min的冷却速率在-80 °C条件下冻存；若需长期保存样本，可直接转移至液氮中保存。

3. 细胞核分离

  1. 迅速解冻细胞悬液的冻存管，并将其置于湿冰上。
  2. 将解冻后的细胞悬液转移至一个 2 mL 微量离心管中，再用 1× PBS 补充至 2 mL 以冲洗细胞。
  3. 使用血细胞计数板进行人工细胞计数，以评估细胞的数量和质量（图 2C）。
  4. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞沉淀，然后使用逐渐减小规格的移液器吸头轻轻弃去上清液，保留干燥的细胞沉淀，并将其保持在冰上。
    1. 所有离心步骤均使用摆桶转子。为获得最大细胞得率，将离心管放入离心机时使铰链朝向外侧，弃上清时将移液器吸头朝向管的对侧（图 2D）。
      注意：弃上清时，应使用逐渐减小规格的移液器吸头以尽可能多地去除液体，同时减少对沉淀的扰动。此策略在后续核提取步骤后尤为重要，因为核沉淀通常不可见。
  5. 根据已发表的实验方案配制 1× 细胞裂解缓冲液、细胞裂解稀释缓冲液和洗涤缓冲液（图 3A），并作如下修改（见 表 1， 材料表）：
    注意：使用前将 Digitonin 置于 65 °C 加热块上加热，以溶解沉淀（图 3B），通常需要约 10 分钟。
  6. 通过混合 100 µL 的 1× 细胞裂解缓冲液和 900 µL 的细胞裂解稀释缓冲液配制 0.1× 细胞裂解缓冲液，轻轻吹打混匀后置于冰上。
  7. 用 100 µL 预冷的 0.1× 细胞裂解缓冲液重悬细胞沉淀，轻轻吹打混匀 5 次。
  8. 在冰上孵育 3 分钟（图 3C）。
  9. 加入 1 mL 预冷的洗涤缓冲液，上下吹打 5 次以轻柔混匀。
  10. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟，使细胞核沉淀，轻轻弃去上清液，保留干燥的核沉淀，并将其保持在冰上。
    注意：如果起始细胞数量较低（100,000–200,000 个细胞），建议在 200 µL PCR 管中进行细胞裂解和洗涤步骤，而非 2 mL 微量离心管，以减少管壁表面积并最大限度减少损失。在此情况下，应相应减少洗涤缓冲液的体积以适应较小的管容量。
  11. 重复步骤 3.9–3.10 两次，共完成三次洗涤。
  12. 在显微镜下使用血细胞计数板手动计数细胞核。如需要，可使用台盼蓝染料增强细胞核的对比度，并帮助区分细胞核与未裂解的细胞。
  13. 按照已发表的实验方案配制 1× 核缓冲液：20× 核缓冲液母液、1 mM DTT、1 U/µL RNase 抑制剂溶于无核酸酶水中，并置于冰上保存（见 材料表）。
  14. 根据目标回收的细胞核数量，用 1× 核缓冲液重悬核沉淀。
    注意：若浓度足够高，在确定初始重悬体积时，应以本步骤回收约 10,000 个或略多的细胞核为目标（3,230–8,060 个核/µL），需考虑后续过滤步骤（步骤 3.15）将导致约 25 µL 的体积损失以及浓度下降约 20%。
  15. 将重悬的细胞核溶液轻轻通过 40 µm 移液器吸头式细胞滤筛，并将滤后细胞核置于冰上（图 3D）。
  16. 重新计数细胞核（图 4A–C）。如需要，可用核缓冲液进一步稀释最终溶液。
  17. 将细胞核置于冰上运输，并立即按照已发表的实验方案进行细胞核捕获操作。

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结果

为进行多组学测序，从患者实体瘤标本中分离高质量细胞核（图1），首先对肿瘤组织进行解离，并将获得的单细胞悬液冷冻保存（图2A-D）。在计划进行多组学捕获时，将单细胞悬液解冻。采用优化的裂解缓冲液试剂及裂解时间进行细胞核捕获，以最大程度提高细胞核的质量与得率（图3A-D）。代表性细胞核图像显示其大小和形态正常（图4A-C）。浅灰色圆圈标记的细胞核显示核膜有轻度颗粒样改变。

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讨论

解析肿瘤微环境中存在的异质性细胞群体是癌症生物学研究的热点领域。类似地，复杂的组织也存在于良性病变中，例如伤口愈合和纤维化过程。多组学测序技术的出现使得在同一细胞中同时获取单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（ATAC-seq）数据成为可能，成为一项强大的研究工具。本实验方案描述了细胞核的分离流程，该流程在处理新鲜、脆弱且体积较小的肿瘤样本时需要进行优化。本文提供了一种从富含间质的实体瘤组织样本中分离细胞核的实验方案。我们发现，即使在细胞悬液于细胞核分离与捕获前已被冷冻的情况下，该方法仍能获得可靠且高质量的数据。

在整个实验过程中提高白蛋白浓度有助于限制细胞和后续细胞核的聚集，这在处理肿瘤样本时可能是一个问题。关于组织消化，如果需要，也可使用消化试剂盒中的试剂（参见材料表）。如果使用此类试剂，我们仍建议每30分钟进行一次消化/终止反应及缓冲液更换，以最大化获得有活力的细胞数量。在组织解离后，可按照制造商的方案进行红细胞裂解。研究者也可根据需要选择性地进行梯度细胞分离（参见材料表）。我们通常不常...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢斯坦福功能基因组学中心（SFGF），特别是Dhananjay Wagh和John Coller，以及10x Genomics在优化实验方案方面提供的帮助。我们还要感谢George Poultsides博士、Monica Dua博士、Brendan Visser博士和Byrne Lee博士在获取患者样本方面给予的支持。我们谨向Art和Elaine Taylor、Rantz基金会以及Warren和Judy Kaplan对本研究工作的慷慨资助表示感谢。本研究的资助来源包括美国国立卫生研究院（NIH）基金项目1F32CA23931201A1（D.S.F.）、1R01GM116892（M.T.L.）、1R01GM136659（M.T.L.）、高盛基金会（J.A.N.、D.S.F.、M.T.L.）、Damon Runyon癌症研究基金会（D.D.、M.T.L.）、Gunn/Olivier基金、加州再生医学研究所、Stinehart/Reed基金会以及Hagey儿科再生医学实验室。测序工作所使用的仪器由NIH资助经费购置（S10OD025212、S10OD018220和1S10OD01058001A1）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100、70 和 40 μm Falcon 细胞滤网  ThermoFisher
10x Genomics 细胞核缓冲液（20x）10x Genomics2000153/2000207
Bambanker 和光，Fisher ScientificNC9582255 
BSAMiltenyi Biotec130-091-376
氯化钙Sigma Aldrich499609
胶原酶（胶原酶 IV 型）赛默飞世尔科技17104019
Digitonin赛默飞世尔科技BN2006
DNase I沃辛顿LS006330
DTTSigma Aldrich646563
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基 F-12赛默飞世尔科技11320082
胎牛血清赛默飞世尔科技10438026
Flowmi 40 μm  移液管尖端细胞过滤器 Sigma AldrichBAH136800040
HEPESSigma AldrichH3375
Histopaque-1119 梯度细胞分离液Sigma Aldrich11191
199培养基Sigma AldrichM2520
MgCl₂2Sigma AldrichM1028
Miltenyi GentleMACS™ 消化试剂盒 
NaClSigma Aldrich59222C
Nalgene 冻存管 "弗罗斯特先生" 冻存容器 赛默飞世尔科技5100-0001
非离子型P40替代剂Sigma Aldrich74385
泊洛沙姆 188SigmaP5556
RNase 抑制剂 Sigma Aldrich3335399001
Tris-HClSigma AldrichT2194
Tween-20赛默飞世尔科技85113

参考文献

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  6. Nuclei isolation from embryonic mouse brain tissue for single cell multiome ATAC + gene expression sequencing. , 10x Genomics. https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression/documentation/steps/sample-prep/nuclei-isolation-from-embryonic-mouse-brain-tissue-for-single-cell-multiome-atac-plus-gene-expression-sequencing (2022).
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