优化从新鲜及冷冻实体瘤标本中分离细胞核以进行多组学测序

摘要

本方案提供了一种可靠且经过优化的方法，用于从实体瘤样本中分离细胞核，以进行基于10x Genomics平台的多组学测序，内容包括组织解离条件、单细胞悬液的冷冻保存以及分离细胞核质量评估的建议。

摘要

多组学测序技术可提供同一细胞或配对单细胞的RNA测序与转座酶可及染色质测序（ATAC-测序）数据，使我们对肿瘤细胞异质性的解析能力取得重大突破，而肿瘤细胞异质性正是当前转化癌症研究的主要焦点。然而，采用这一先进方法所获得测序数据的质量在很大程度上取决于输入样本的质量。

需要优化消化条件，以在不牺牲细胞质量的前提下最大化细胞得率。对于具有致密的纤维化基质的实体瘤而言，这一过程尤为具有挑战性，因为必须温和地降解这些基质以释放细胞。从实体瘤组织中新分离的细胞比从细胞系中分离的细胞更为脆弱。此外，由于所分离的细胞类型具有异质性，因此应选择能够支持整个细胞群体的实验条件。

最后，必须根据这些特性优化细胞核分离条件，包括裂解时间以及试剂类型和比例。本文中，我们介绍了从实体瘤样本中进行细胞核分离以用于10x Genomics多组学测序平台的经验。我们提供了组织消化、单细胞悬液储存（如需要）以及细胞核分离与评估的建议。

引言

随着我们对肿瘤生物学的认识不断深入，分析肿瘤微环境中异质性细胞的重要性也日益增加^1,2。能够在同一细胞中以配对细胞的方式（multiome测序）同时获取单细胞RNA以及转座酶可及染色质测序（ATAC-sequencing）数据，是实现这一目标的重要进展^3,4。然而，这些实验成本高昂且耗时，所获得数据的质量和影响力在很大程度上依赖于实验条件和材料的质量。已有标准化的细胞核分离方案发表^5,6。由于从实体瘤样本中新分离的细胞比细胞系中分离的细胞更为脆弱，因此新鲜且具有异质性的组织需要对方案进行优化。

另一个需要考虑的因素是，对于实体瘤而言，手术标本通常要到当天较晚时候才能从手术室送达。因此，一般无法在获取样本后直接进入细胞核捕获步骤，而必须经过冷冻保存环节。根据我们的经验，将单细胞悬液进行冷冻可获得质量最高的细胞核（相比直接速冻完整组织或其他保存方式）。这一优势在富含RNase的酶解组织类型（如胰腺）中尤为明显。

组织消化条件的设计还需在不牺牲细胞质量的前提下，最大限度地提高细胞....

方案

人胰腺癌（胰腺导管腺癌）样本根据本实验室经机构审查委员会（IRB）批准的方案获取，并已从患者处获得组织采集的知情同意。组织样本从手术室运送至实验室后，按如下步骤进行处理。

1. 组织解离（消化）

1. 准备消化缓冲液（参见 材料表）。
2. 肿瘤切除后尽快获取目标组织，并将样本置于淬灭缓冲液（含约 5% 胎牛血清的 DMEM F-12）或 1× PBS 中，冰上运输。
3. 在 90 mm 培养皿中加入 3–5 mL 消化缓冲液，使用洁净的镊子和剪刀将组织剪碎（图 2A）。
4. 将剪碎的组织转移至 50 mL 圆锥形离心管中，加入约 10 mL 消化缓冲液，在 37 °C 条件下振荡消化 30 分钟（可使用带振荡功能的水浴或干式振荡器）。
5. 从振荡器中取出后，加入约 20 mL 淬灭培养基终止反应，然后将悬液通过 100 µm 细胞滤网过滤至洁净的圆锥形离心管中。
6. 收集滤网上残留的固体组织（如有需要可再次剪碎），放入约 10 mL 新鲜消化缓冲液中，在 37 °C 振荡条件下继续消化 30 分钟。重复此步骤，直至所有肿瘤组织完全解离。
7. 合并细胞悬液，先经 70 µm 滤网、再经 40 µm 滤网依次过滤，收集至冰上预冷的洁净圆锥形离....

结果

为进行多组学测序，从患者实体瘤标本中分离高质量细胞核（图1），首先对肿瘤组织进行解离，并将获得的单细胞悬液冷冻保存（图2A-D）。在计划进行多组学捕获时，将单细胞悬液解冻。采用优化的裂解缓冲液试剂及裂解时间进行细胞核捕获，以最大程度提高细胞核的质量与得率（图3A-D）。代表性细胞核图像显示其大小和形态正常（图4A-C）。浅灰色圆圈标记的细胞核显示核膜有轻度颗粒样改变。

讨论

解析肿瘤微环境中存在的异质性细胞群体是癌症生物学研究的热点领域。类似地，复杂的组织也存在于良性病变中，例如伤口愈合和纤维化过程。多组学测序技术的出现使得在同一细胞中同时获取单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（ATAC-seq）数据成为可能，成为一项强大的研究工具。本实验方案描述了细胞核的分离流程，该流程在处理新鲜、脆弱且体积较小的肿瘤样本时需要进行优化。本文提供了一种从富含间质的实体瘤组织样本中分离细胞核的实验方案。我们发现，即使在细胞悬液于细胞核分离与捕获前已被冷冻的情况下，该方法仍能获得可靠且高质量的数据。

在整个实验过程中提高白蛋白浓度有助于限制细胞和后续细胞核的聚集，这在处理肿瘤样本时可能是一个问题。关于组织消化，如果需要，也可使用消化试剂盒中的试剂（参见材料表）。如果使用此类试剂，我们仍建议每30分钟进行一次消化/终止反应及缓冲液更换，以最大化获得有活力的细胞数量。在组织解离后，可按照制造商的方案进行红细胞裂解。研究者也可根据需要选择性地进行梯度细胞分离（参见材料表）。我们通常不常.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100、70 和 40 μm Falcon 细胞滤网	ThermoFisher
10x Genomics 细胞核缓冲液（20x）	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker	和光，Fisher Scientific	NC9582255
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
氯化钙	Sigma Aldrich	499609
胶原酶（胶原酶 IV 型）	赛默飞世尔科技	17104019
Digitonin	赛默飞世尔科技	BN2006
DNase I	沃辛顿	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基 F-12	赛默飞世尔科技	11320082
胎牛血清	赛默飞世尔科技	10438026
Flowmi 40 μm  移液管尖端细胞过滤器	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 梯度细胞分离液	Sigma Aldrich	11191
199培养基	Sigma Aldrich	M2520
MgCl₂2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACS™ 消化试剂盒
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene 冻存管 "弗罗斯特先生" 冻存容器	赛默飞世尔科技	5100-0001
非离子型P40替代剂	Sigma Aldrich	74385
泊洛沙姆 188	Sigma	P5556
RNase 抑制剂	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	赛默飞世尔科技	85113