本方案描述了一种利用压力-容积导纳技术测量左心室压力和容积的方法。该方法可实现对药物对心脏作用的连续实时监测。
本文内容
摘要
摘要
心脏功能下降可能对其他器官产生不利影响。左心室压力-容积关系被认为是评估心脏功能的有效方法。实时监测心脏功能对于药物评价具有重要意义。在闭胸条件下，压力-容积导管的重要组成部分——微型传感器，经由大鼠的右颈动脉进入左心室。该设备以压力-容积环的形式直观显示实验过程中心脏功能的变化。通过向大鼠左颈静脉注射50 µL 20%的氯化钠溶液，改变血液导电性，从而计算心室的实际容积。利用压力-容积导纳导管测量已知体积下血液的导电性，可计算出大鼠心室腔的实际容积。本方案可连续观察药物对心脏的影响，有助于推动特色民族药物在心血管疾病中的合理应用。
引言
心血管疾病是全球死亡率最高的疾病1。其病因包括冠状动脉狭窄（心肌缺血）、冠状动脉阻塞（心肌梗死）以及缺血-再灌注损伤2。由于心脏持续进行收缩与舒张循环，是体内能量需求最高的器官之一。因此，当冠状动脉难以维持足够的能量和氧气供应时，心脏功能不可避免地会下降，进而对其他器官产生负面影响3,4。心脏是循环系统的动力核心，必须对心脏功能进行科学合理的评估。
通过心室压力与容积关系评估心脏功能被认为是一种全面的方法5。在整个心动周期中，心室压力和容积的实时变化构成了压力-容积环。心室压力-容积环可对心脏功能及储备能力进行定量分析，涵盖心室的不同工作阶段和能量状态。正常心室具有较小的收缩末期容积，并表现出良好的每搏做功和效率5,6,7。
压力-容积导纳导管技术是一种用于检测左心室状态的侵入性方法，可连续实时获取压力-容积环8。 压力容积导纳导管是功能强大的工具，为获得可重复且可靠的结果，规范的操作流程至关重要，包括在盐水校准过程中进行in vivo心肌并联导纳分析，以及在比色杯校准中进行in vitro血液导纳测定3。
阿魏酸（FA）是一种酚酸，广泛分布于植物界，如 Avena sativa 和 Ligusticum chuanxiong hort9，10。阿魏酸具有降低血压和抗心律失常的药理作用，是一种具有多种功能的生物活性天然产物。阿魏酸能够抵抗氧化损伤、减轻炎症反应、抑制血小板聚集，并预防冠心病和动脉粥样硬化11。然而，目前关于阿魏酸的大多数研究主要集中在心脏的某一方面，极少评估其在循环系统中的整体作用12，13，14，15。本文描述了一种闭胸法，结合使用异氟烷麻醉与氯胺酮（50 mg/kg），重点观察在颈静脉注射过程中阿魏酸溶液对心脏反应的影响。
我们将描述在闭胸条件下使用该工具的完整操作流程，包括溶液配制、换能器准备、实验前大鼠准备、导管插入右颈动脉以及数据分析。实验持续时间通常少于4小时，具体时长取决于不同的实验方案。在一次实验中，我们可获得诸如左心室压力、容积和心率等详细的心脏功能信息。
方案
动物实验方案经成都中医药大学实验动物福利伦理委员会审查并批准（记录编号：2023-04）。本研究采用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重280 ± 20 g，8–10周龄）。大鼠饲养于动物饲养室，可自由饮水和进食。
1. 溶液配制
- 制备0.9% NaCl溶液，用于保持工作区域充分湿润。
- 配制20%高渗NaCl溶液：将2 g NaCl溶解于10 mL双蒸水（ddH2O）中。为测定心肌的平行电导率，需改变心室内液体的电导率。
- 配制1%酶活性粉状洗涤剂溶液。实验结束时使用该溶液，将压力-容积电生理导管浸入其中1–2小时。
- 通过将10 mg阿魏酸溶解于20 mL双蒸水（ddH2O）中配制FA溶液。用0.22 µm滤膜过滤该溶液。按1 mL/kg剂量向大鼠注射阿魏酸溶液。
2. 传感器的制备
- 实验开始前约30-60分钟，将压力-容积传感器浸入37 °C的0.9% NaCl溶液中，以确保实验数据的稳定性。
- 连接实验装置。压力-容积环测量系统由压力-容积导管、两个控制单元、一个记录单元和运行软件的计算机组成。软件中的压力-容积环模块将提供参考实验流程。
- 按下开始按钮，软件将自动记录来自压力-容积传感器的监测数据。
- 使用Miro-Tip压力-容积（MPVS）软件校准压力和导电性。
3. 实验前大鼠准备
- 通过肌肉注射给予大鼠氯胺酮（50 mg/kg）和芬太尼（0.25 mg/kg）5。
- 轻捏大鼠脚趾，通过检查反射是否消失来确认麻醉深度。情绪会影响大鼠的生理状态，而疼痛会引起心脏功能的改变16。使用小型动物剃毛器和脱毛膏去除手术部位的毛发，再用碘伏和75%酒精擦拭皮肤以维持无菌状态。
- 将完全麻醉的大鼠固定在等温加热板上，使其背部与加热板接触。
- 将涂有凡士林的温度探头插入大鼠直肠，通过调节加热板将大鼠体温维持在37 °C ± 0.5。
注意：实验过程中必须保持呼吸道通畅。
4. 将导管插入右侧颈总动脉
- 沿大鼠颈部中线右侧纵向切开皮肤，做一条4厘米长的切口，用镊子分离肌肉和结缔组织。可见位于气管右侧的颈动脉。大鼠右侧颈动脉呈深红色，搏动明显，并有一条白色迷走神经与其平行。
- 用镊子将颈动脉与其他组织和神经分离。在洁净的颈动脉下方放置三条5-0外科缝线。向手术区域滴加无菌0.9%氯化钠溶液，以保持颈动脉湿润。
- 切割 左锁骨上方的皮肤切开，剥离颈静脉周围的组织。然后，在左颈静脉下方放置一根5-0外科缝线。
- 使用动脉夹在近端阻断血流，用显微剪刀在血流停止的血管部位剪开一段。切口横截面出现少量血液属正常现象。若血液正快速且间歇性地从血管流出，应抬起近端手术线，重新放置动脉夹。
- 从颈动脉横断面将导管插入并深入至左心室。确保导管进入左心室后，最低的收缩压值接近 0 mmHg。
- 为获得合理的压力-容积关系，可轻微调整心室腔内压力-容积导管的位置。为防止大量失血及导管因心跳而移位，需结扎手术线的近端。
注意：在此过程中，应保持大鼠的体温、麻醉水平、压力信号和导纳信号稳定，并保持其呼吸道通畅。
5. 药物注射与电导率校准
- 保持压力容积导管在心室腔内的位置，待数据稳定后，结扎颈静脉结扎处远端的手术线，并缓慢注射最多1 mL/kg的阿魏酸溶液。观察5-10分钟。
- 从左侧颈静脉注入50 µL的20% NaCl溶液，以消除心肌产生的并联导电性。并联导电性的容积范围约为130–280 µL5重复此步骤3次，每次间隔2 min。
- 在大鼠心室压力和容积检测完成后，使用采血针从大鼠腹主动脉采集血液。将采集的血液置于含钠肝素的采血管中，并上下颠倒混匀2次，以防止血液凝固。通过以下方式处死实验大鼠： 通过左侧颈静脉注射120 mg/kg的戊巴比妥钠。
- 使用大鼠容积校准管将测得的电导值转换为实际血容量。依次将混有肝素钠的血液注入校准管的不同孔口，导管检测各孔口内血液的电导值，并将数据记录在压力-容积监测模块中。
6. 数据分析
- 通过将已知体积血液的测量电导率值输入指定位置，软件会自动绘制曲线并外推血液的电导率。使用至少三组血液电导率值，推算待测大鼠的血液电导率。血液电导率具有个体差异性，对每只待测大鼠均需单独执行此步骤。
- 高渗校准：将三次注射高渗盐水所获得的数据输入指定位置后，软件将计算并联电导平均值，并自动校准实验数据。
- 选择血压和电导值稳定的区域，用于分析大鼠左心室功能。
- 点击 分析，软件将根据所选区域自动计算多种参数，包括 EF（左心室射血分数）、SW（每搏功）和 CO（心输出量）等。
结果
每次测试（n = 3）均基于压力-容积导电导管进入左心室的过程。当导管从颈动脉进入左心室时，会出现显著的信号变化，例如压力范围明显增大（图1）。通过将容积（µL）绘制在Y轴、压力（mmHg）绘制在X轴，完成压力-容积关系的图形分析。大鼠左心室压力范围为10–105 mmHg，容积的导纳值范围为65–115 µL。
完整的心动周期由逆时针方向的压力-容积环构成（图2）。给予大鼠阿魏酸后，其心脏功能出现显著变化（图3）。大鼠左心室压力范围为0–85 mmHg，容积的导纳值范围为30–100 µL。
如图4所示，当将高渗盐水注入大鼠颈静脉时，左心室压力-容积环会发生变化。由于在心室腔内对压力和导电性信号进行了直接测量，通过左颈静脉注射高渗盐水可导致导电性数值升高。通过多次测量导电性数值的变化，可消除心肌组织的干扰。
采用压力容积电导法进行比色皿校准（图5），以将测得的电导值转换为容积电导值。
图1：通过压力-容积导纳导管在颈动脉和心室中生成的不同压力-容积环。（A）动脉与心室之间的压力和导纳存在显著差异。（B）将微型传感器插入心室可形成压力-容积环。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：压力-容积环。压力-容积环包含四个时相：舒张期、等容收缩期、收缩期和等容舒张期。压力-容积环的面积代表一次心脏收缩所产生的功。用舒张末期容积（EDV）减去收缩末期容积（ESV）可得到心室每搏输出量。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：注射阿魏酸溶液后大鼠左心室功能受到影响。（A）左心室压力-容积环发生变化。（B）射血分数（EF）表示每搏输出量占心室舒张末期容积的百分比：左心室射血分数随心跳次数的变化情况。（C）左心室收缩末期容积随心跳次数增加而变化。（D）左心室舒张末期压力-容积关系的时间常数随心率增加而变化。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：静脉注射20% NaCl溶液后大鼠左心室压力与电导率的变化。（A）电导率发生改变的分析数据。（B）由于电导率增加，压力-容积环向右移动。请点击此处查看该图的放大版本。
图 5：采用压力-容积电导导管测量已知体积比色皿中大鼠血液的电导率。（A）不同体积下的电导率。（B）压力-容积电导导管测得的电导率具有良好相关性。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
针对不同的心功能状态，必须采用合理的给药策略。压力-容积导管技术是研究左心室功能最直观的方法5。该方法能够从整体角度研究药物对心功能的影响。本文详细描述了实验的各个阶段，将为心脏功能研究提供一定便利。
压力-容积导管技术是最全面且严谨的方法。单次实验可获取多达30项指标的信息，包括绝对值（压力和容积）和相对值（射血分数），甚至某些药物代谢相关信息。
在整个实验过程中，大鼠的体温维持在 37 °C ± 0.55。实验期间应尽量减少大鼠的失血量5。实验过程中应记录大鼠的血容量17。
压力-容积导纳导管技术可实现对心室状态的实时检测18。该技术在研究单一药物或药物组合对心脏作用方面具有重要价值。导纳导管可直接测量左心室的压力和导纳值，其结果与实验大鼠的体温及麻醉程度密切相关。本实验中，在注射阿魏酸溶液后，通过压力-容积环可清晰观察到左心室功能的变化，包括收缩末期压力和收缩末期容积的降低（图2A）。大鼠左心室射血分数显著升高，峰值达到89.87%（图2B）。大鼠左心室收缩末期压力显著降低，最低值为55.44 µL。该结果与既往报道的阿魏酸具有降压药理作用相符11。
食物和药用植物中的某些天然化合物有助于维持健康。阿魏酸是一种广泛存在于植物中的酚类化合物，包括川芎（Ligusticum chuanxiong）和当归（Angelica sinensis）19，这些植物是多种中药的重要活性成分。目前研究表明，阿魏酸具有多种生物活性，包括抗炎、抗纤维化和抗凋亡作用11。尽管已有研究指出阿魏酸对心脏形态结构具有积极作用12,20，但仍有必要进一步研究这种来源于食物的易得天然产物对循环系统中心脏功能的影响。
可将压力-容积导管置入实验动物的心室腔内，直接获取心室压力和顺应性。通过盐水校准和校准管校准可获得真实的心室容积。该实验能够连续获取压力-容积环，直观反映心室功能的变化。使用压力-容积导管进入心室腔的方法有两种，包括开胸条件和闭胸条件。在开胸条件下，更容易控制压力-容积导管在心室腔内的位置。而在闭胸条件下测量心室功能无需对动物进行辅助呼吸，对动物的损伤更小，且成功率更高。此外，可在闭胸条件下观察压力-容积环，以判断压力-容积导管是否位于心室腔内。如果该导管被心肌压迫，压力-容积环将出现异常峰。
心脏是一个将血液泵送至全身的重要器官。评估心脏功能需要一种更为合理的方法，包括前负荷和后负荷以及心脏本身的状态21。压力-容积环可用于实时描述整个心动周期中左心室腔内压力和容积的变化。本方案介绍了一种使用微型传感器测量左心室功能的完整方法。在实验方案中更换不同的微传感器型号，可适用于不同动物的心功能测量，例如猪、小鼠等4,8,22。利用压力-容积导纳导管技术，可实时观察药物对左心室压力和容积的影响，以及对实验对象循环系统的整体作用。该技术有助于最大限度地减少药物对心脏可能产生的不良影响。
披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本工作由四川省重大研发项目资助。&D项目（2022YFS043）和成都中医药大学青年基金提升人才专项项目（QJJJ2022029）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | Sartorius AG, Germany | - | |
| 动物体温维持仪 | Rayward Life Technology Co., Ltd | 69020 | |
| 双通道生物放大器 | Millar, Inc., USA | DA-100 | |
| 酶活性粉状洗涤剂 | Alconox Inc., USA | 1104 | |
| 阿魏酸 | Macklin Biochemical Co., Ltd,Shanghai, China | F900027 | |
| Mikro-Tip 导管换能器，SPR-838NR | Millar, Inc., USA | SPR-838NR | |
| Millar Miro-Tip 压力-容积（MPVS）超高效系统 | Millar, Inc., USA | SPR-869 | |
| 宠物电动剃毛器 | Jinyun County New Concept Home Supplies Co., Ltd. | - | |
| Power Lab 8 / 35 | Millar, Inc., USA | PL3508 | |
| 氯化钠，NaCl | Kelong Chemical Reagent, Chengdu, China | KX829463 | |
| 薇婷脱毛膏 | 上海松骐电子商务有限公司 | 3226470 |
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