本方案概述了使用油酸和痤疮杆菌（Cutibacterium acnes）在大鼠皮肤上诱导痤疮炎症的操作步骤。
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摘要
摘要
寻常痤疮是一种常见的慢性皮肤疾病，其特征是在面部、颈部和胸部出现粉刺、丘疹和脓疱。为了模拟寻常痤疮的炎症过程，本实验方案详细描述了一种建立复合型痤疮啮齿类动物模型的方法，即通过在大鼠耳部使用油酸和Cutibacterium acnes（C. acnes）诱导痤疮样炎症。 将大鼠随机分为四组：正常对照组（NC）、仅油酸处理耳部组（OA）、仅C. acnes处理耳部组（C. acnes）、油酸联合C. acnes处理耳部组（OA + C. acnes）。为模拟皮脂过度分泌，于OA组和OA + C. acnes组大鼠耳部涂抹油酸，持续25天。
从第21天到第25天，将C. acnes悬液皮内注射至C. acnes组和OA + C. acnes组大鼠的耳部，以加重痤疮炎症。每周测量耳厚度以评估炎症严重程度。通过大体观察、苏木精-伊红染色及免疫组织化学（IHC）检测发现，OA组和OA + C. acnes组大鼠耳部增厚、硬化，并伴有红斑及粉刺形成。此外，在C. acnes组和OA + C. acnes组中还观察到丘疹。组织病理学结果显示，OA组和OA + C. acnes组的毛囊出现角化过度及漏斗部扩张。C. acnes组和OA + C. acnes组的真皮层可见炎性细胞浸润及脓肿形成。免疫组织化学结果证实，C. acnes组和OA + C. acnes组真皮层中肿瘤坏死因子（TNF）-α水平升高。上述所有结果共同表明，复合型痤疮啮齿类动物模型成功建立。
引言
寻常痤疮是一种常见的慢性皮肤病，其特征是在面部、颈部和胸部出现粉刺、丘疹和脓疱，在严重情况下可能发展为结节、囊肿以及永久性瘢痕1。流行病学研究显示，痤疮影响全球9.4%的人口，其引起的症状带来严重的生理和心理社会挑战2,3。
痤疮的发病机制是多因素的，包括四个关键过程：皮脂分泌过多、粉刺形成、皮肤微生物群在毛囊内的定植，以及毛囊皮脂腺单位周围炎性介质的释放4,5。皮脂分泌增加导致不饱和游离脂肪酸（UFFAs）过量积聚，这会促进皮肤微生物群的异常增殖，其中一种微生物为Cutibacterium acnes，基因组研究已证实这一点6。同时，皮肤微生物群分解皮脂，进一步提高UFFAs的浓度，从而形成恶性循环7。此外，过量的UFFAs会引起毛囊角化过度，进而诱发痤疮8。皮肤微生物群和增多的皮脂均可激活Toll样受体（TLRs），产生多种促炎性细胞因子，如白细胞介素（IL）-1和TNF-α9,10。这一系列炎症反应，结合皮脂增多和微生物过度生长，最终导致毛囊显著的角化过度及痤疮的发生11。
痤疮研究领域及相关临床需求的快速发展推动了在大鼠耳部、大鼠或小鼠背部以及兔耳上建立一系列痤疮炎症动物模型的研究12,13,14,15。这些方法包括皮内注射C. acnes 、在皮肤上涂抹油脂以模拟皮脂腺异常分泌及角化过度，或联合使用上述两种方法以加速皮肤炎症从而形成痤疮16,17,18,19。然而，既往研究中化学试剂与生物制剂的使用方式和剂量各不相同，可能使拟建立合适痤疮模型的研究人员产生困惑。本研究旨在建立一种操作简便且有效的复合型痤疮啮齿类动物模型，为研究寻常性痤疮的研究人员提供模型参考。
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方案
本方案已获得北京中医药大学伦理批准（编号：2023033103-1183）。本研究共使用12只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重：208 g ± 5 g），并将其分为四组：NC组（n = 3）、OA组（n = 3）、C. acnes组（n = 3）和OA + C. acnes组（n = 3）。
1. 建立痤疮模型
- 建模前使用电子数显卡尺（参见材料表）测量并记录大鼠耳部厚度。
- 将电子数显卡尺的外测量爪置于耳廓外缘中点，并伸入耳道内，沿直线记录2/3处和1/2处两点的厚度。每点测量3次，计算两点厚度的平均值，作为耳部厚度。
- 将大鼠头部向一侧倾斜，使耳部朝上，每日均匀涂抹50 µL油酸（参见材料表）于耳部腹侧和背侧，连续处理25天。
- 从第21天至第25天，在每日涂抹油酸前，先使用4%异氟烷麻醉大鼠，随后用配备34 G或36 G针头（参见材料表）的1 mL注射器，将50 µL浓度为1 × 107 CFU的C. acnes菌悬液（参见材料表）皮内注射至耳部腹侧。
注意：皮内注射时应避免刺入耳部血管。需使用带有34 G或36 G针头的微量注射器（参见材料表）。为确保正确进行皮内注射，针头应以10至15度角刺入，深度约为1 mm。 - 第25天时，按照步骤1.1所述方法再次测量并记录耳部厚度。
注意：OA组仅按步骤1.2所述涂抹油酸，并于第21至25天每日注射生理盐水；C. acnes组仅按步骤1.3所述皮内注射C. acnes菌悬液；OA + C. acnes组则同时接受油酸涂抹和C. acnes菌悬液注射，处理方式如步骤1.2和1.3所述。
2. 组织采集与分析
- 在第26天，使用机构批准的方法人道处死大鼠后，用8 mm环钻在双侧耳部钻取固定大小的组织。
- 将耳部组织浸入4%多聚甲醛中固定24小时，随后进行石蜡包埋并切成5 µm厚的切片，用于苏木精-伊红（HE）染色20。在光学显微镜下观察切片，记录病理变化，供病理学家后续评估。根据表1（另见图1）对病理变化进行评分。
- 脱蜡、水化切片，并进行加热以实现抗原修复。在室温下用含0.3% H2O2的甲醇孵育15分钟，以灭活内源性过氧化物酶。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片，然后在室温下用3% BSA孵育30分钟。
- 在4 °C下，用TNF-α单克隆抗体（稀释比例1:800）（见材料表）孵育切片过夜。
- 再次用PBS洗涤切片，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（见材料表）孵育50分钟。
- 再次用PBS洗涤后，向切片上滴加3,3'-二氨基联苯胺（DAB）混合液，在显微镜下观察染色过程，当达到理想染色强度时用PBS终止反应。
- 用Meyer氏苏木精复染切片1分钟，流水冲洗，脱水并封片。在显微镜下观察切片，记录病理变化，供病理学家后续评估。
3. 统计分析
- 进行统计分析。
- 数据以均值 ± 标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验评估所有数据的正态性。若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估组间差异的显著性；对于非正态分布的数据，则采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn's多重比较校正。当p值小于0.05时，认为差异具有统计学意义。
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结果
耳部厚度及皮肤外观
从第7天到第21天，OA组和OA + C. acnes组小鼠耳部厚度显著大于NC组和C. acnes组。在第25天，OA组、C. acnes组以及OA + C. acnes组耳部厚度均显著大于NC组（p < 0.05）。实验期间耳部平均厚度见图2和Table 2。
从第7天到第25天，OA组和OA + C. acnes 耳部出现增厚和硬化，伴有红斑、鳞屑和粉刺。观察到大鼠不时抓挠耳朵，导致出血。第25天时，耳部出现丘疹。 C. acnes 组和OA + C. acnes 组（图3).
组织病理学
在OA组和OA + C...
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讨论
由于痤疮模型的方法学和评价标准尚不明确，本实验方案旨在为研究痤疮的科研人员提供参考。由于小鼠耳朵尺寸较小，且背部毛发生长会带来干扰，需使用脱毛膏和剃须刀处理，因此大鼠耳朵可能是建立啮齿类动物痤疮模型的更佳替代部位。我们曾尝试在大鼠背部皮肤建立痤疮模型，但效果不如在大鼠耳朵上观察到的结果理想。
一些研究人员仅采用单一方法来诱导痤疮炎症，例如涂抹油脂或注射微生物14,16。然而，研究表明，皮脂分泌增加会促进毛囊堵塞部位痤疮丙酸杆菌（C. acnes）的过度增殖，而C. acnes反过来又会刺激皮脂腺异常分泌；二者相互作用可能加剧痤疮炎症。因此，通过油脂与C. acnes共同诱导的复合模型可能更贴近临床上的痤疮病变10,21,22。为...
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披露
所有作者声明均无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号81974572和编号82274523）以及北京中医药大学（编号202310026002）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 厌氧指示剂 | Mitsubishi, Japan | C-22 | |
| 厌氧袋 | Mitsubishi, Japan | C-11, C-41 | |
| 哥伦比亚血琼脂平板 | BeNa Cuture Collection, 中国 | BNCC330605 | |
| 恒温培养箱 | SHANGCHENG, 中国 | 303-0 | |
| 棉签 | HYNAUT, 中国 | _ | |
| Cutibacterium acnes | BeNa Cuture Collection, 中国 | BNCC330605 | |
| Dako REAL EnVision 检测系统，过氧化物酶/DAB+，兔/小鼠 | DAKO, Denmark | K5007 | |
| 一次性无菌注射针头 | 浙江欧健医用器材有限公司, 中国 | _ | |
| 电子天平 | 金轩, 中国 | A017 | |
| 电子游标卡尺 | 得力, 中国 | DL90150 | |
| 油酸（分析纯试剂，AR） | 方正, 中国 | _ | |
| 氯化钠注射液 | 双鹤药业, 中国 | Y2212241 | |
| SPSS Statistics | IBM, USA | 26.0 | |
| 无菌皮下注射器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司, 中国 | _ | |
| TNF Alpha 单克隆抗体 | Proteintech Group,int, USA | 60291-1-lg |
参考文献
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