本方案概述了使用油酸和痤疮杆菌（Cutibacterium acnes）在大鼠皮肤上诱导痤疮炎症的操作步骤。
本文内容
摘要
摘要
寻常痤疮是一种常见的慢性皮肤疾病，其特征是在面部、颈部和胸部出现粉刺、丘疹和脓疱。为了模拟寻常痤疮的炎症过程，本实验方案详细描述了一种建立复合型痤疮啮齿类动物模型的方法，即通过在大鼠耳部使用油酸和Cutibacterium acnes（C. acnes）诱导痤疮样炎症。 将大鼠随机分为四组：正常对照组（NC）、仅油酸处理耳部组（OA）、仅C. acnes处理耳部组（C. acnes）、油酸联合C. acnes处理耳部组（OA + C. acnes）。为模拟皮脂过度分泌，于OA组和OA + C. acnes组大鼠耳部涂抹油酸，持续25天。
从第21天到第25天，将C. acnes悬液皮内注射至C. acnes组和OA + C. acnes组大鼠的耳部，以加重痤疮炎症。每周测量耳厚度以评估炎症严重程度。通过大体观察、苏木精-伊红染色及免疫组织化学（IHC）检测发现，OA组和OA + C. acnes组大鼠耳部增厚、硬化，并伴有红斑及粉刺形成。此外，在C. acnes组和OA + C. acnes组中还观察到丘疹。组织病理学结果显示，OA组和OA + C. acnes组的毛囊出现角化过度及漏斗部扩张。C. acnes组和OA + C. acnes组的真皮层可见炎性细胞浸润及脓肿形成。免疫组织化学结果证实，C. acnes组和OA + C. acnes组真皮层中肿瘤坏死因子（TNF）-α水平升高。上述所有结果共同表明，复合型痤疮啮齿类动物模型成功建立。
引言
寻常痤疮是一种常见的慢性皮肤病，其特征是在面部、颈部和胸部出现粉刺、丘疹和脓疱，在严重情况下可能发展为结节、囊肿以及永久性瘢痕1。流行病学研究显示，痤疮影响全球9.4%的人口，其引起的症状带来严重的生理和心理社会挑战2,3。
痤疮的发病机制是多因素的，包括四个关键过程：皮脂分泌过多、粉刺形成、皮肤微生物群在毛囊内的定植，以及毛囊皮脂腺单位周围炎性介质的释放4,5。皮脂分泌增加导致不饱和游离脂肪酸（UFFAs）过量积聚，这会促进皮肤微生物群的异常增殖，其中一种微生物为Cutibacterium acnes，基因组研究已证实这一点6。同时，皮肤微生物群分解皮脂，进一步提高UFFAs的浓度，从而形成恶性循环7。此外，过量的UFFAs会引起毛囊角化过度，进而诱发痤疮8。皮肤微生物群和增多的皮脂均可激活Toll样受体（TLRs），产生多种促炎性细胞因子，如白细胞介素（IL）-1和TNF-α9,10。这一系列炎症反应，结合皮脂增多和微生物过度生长，最终导致毛囊显著的角化过度及痤疮的发生11。
痤疮研究领域及相关临床需求的快速发展推动了在大鼠耳部、大鼠或小鼠背部以及兔耳上建立一系列痤疮炎症动物模型的研究12,13,14,15。这些方法包括皮内注射C. acnes 、在皮肤上涂抹油脂以模拟皮脂腺异常分泌及角化过度，或联合使用上述两种方法以加速皮肤炎症从而形成痤疮16,17,18,19。然而，既往研究中化学试剂与生物制剂的使用方式和剂量各不相同，可能使拟建立合适痤疮模型的研究人员产生困惑。本研究旨在建立一种操作简便且有效的复合型痤疮啮齿类动物模型，为研究寻常性痤疮的研究人员提供模型参考。
方案
本方案已获得北京中医药大学伦理批准（编号：2023033103-1183）。本研究共使用12只雄性Sprague-Dawley大鼠（体重：208 g ± 5 g），并将其分为四组：NC组（n = 3）、OA组（n = 3）、C. acnes组（n = 3）和OA + C. acnes组（n = 3）。
1. 建立痤疮模型
- 建模前使用电子数显卡尺（参见材料表）测量并记录大鼠耳部厚度。
- 将电子数显卡尺的外测量爪置于耳廓外缘中点，并伸入耳道内，沿直线记录2/3处和1/2处两点的厚度。每点测量3次，计算两点厚度的平均值，作为耳部厚度。
- 将大鼠头部向一侧倾斜，使耳部朝上，每日均匀涂抹50 µL油酸（参见材料表）于耳部腹侧和背侧，连续处理25天。
- 从第21天至第25天，在每日涂抹油酸前，先使用4%异氟烷麻醉大鼠，随后用配备34 G或36 G针头（参见材料表）的1 mL注射器，将50 µL浓度为1 × 107 CFU的C. acnes菌悬液（参见材料表）皮内注射至耳部腹侧。
注意：皮内注射时应避免刺入耳部血管。需使用带有34 G或36 G针头的微量注射器（参见材料表）。为确保正确进行皮内注射，针头应以10至15度角刺入，深度约为1 mm。 - 第25天时，按照步骤1.1所述方法再次测量并记录耳部厚度。
注意：OA组仅按步骤1.2所述涂抹油酸，并于第21至25天每日注射生理盐水；C. acnes组仅按步骤1.3所述皮内注射C. acnes菌悬液；OA + C. acnes组则同时接受油酸涂抹和C. acnes菌悬液注射，处理方式如步骤1.2和1.3所述。
2. 组织采集与分析
- 在第26天，使用机构批准的方法人道处死大鼠后，用8 mm环钻在双侧耳部钻取固定大小的组织。
- 将耳部组织浸入4%多聚甲醛中固定24小时，随后进行石蜡包埋并切成5 µm厚的切片，用于苏木精-伊红（HE）染色20。在光学显微镜下观察切片，记录病理变化，供病理学家后续评估。根据表1（另见图1）对病理变化进行评分。
- 脱蜡、水化切片，并进行加热以实现抗原修复。在室温下用含0.3% H2O2的甲醇孵育15分钟，以灭活内源性过氧化物酶。
- 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片，然后在室温下用3% BSA孵育30分钟。
- 在4 °C下，用TNF-α单克隆抗体（稀释比例1:800）（见材料表）孵育切片过夜。
- 再次用PBS洗涤切片，然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（见材料表）孵育50分钟。
- 再次用PBS洗涤后，向切片上滴加3,3'-二氨基联苯胺（DAB）混合液，在显微镜下观察染色过程，当达到理想染色强度时用PBS终止反应。
- 用Meyer氏苏木精复染切片1分钟，流水冲洗，脱水并封片。在显微镜下观察切片，记录病理变化，供病理学家后续评估。
3. 统计分析
- 进行统计分析。
- 数据以均值 ± 标准差表示。使用Shapiro-Wilk检验评估所有数据的正态性。若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估组间差异的显著性；对于非正态分布的数据，则采用Kruskal-Wallis检验，随后进行Dunn's多重比较校正。当p值小于0.05时，认为差异具有统计学意义。
结果
耳部厚度及皮肤外观
从第7天到第21天，OA组和OA + C. acnes组小鼠耳部厚度显著大于NC组和C. acnes组。在第25天，OA组、C. acnes组以及OA + C. acnes组耳部厚度均显著大于NC组（p < 0.05）。实验期间耳部平均厚度见图2和Table 2。
从第7天到第25天，OA组和OA + C. acnes 耳部出现增厚和硬化，伴有红斑、鳞屑和粉刺。观察到大鼠不时抓挠耳朵，导致出血。第25天时，耳部出现丘疹。 C. acnes 组和OA + C. acnes 组（图3).
组织病理学
在OA组和OA + C. acnes组小鼠耳部皮肤中，毛囊可见角化不全和过度角化，颗粒层和棘层增厚，毛囊漏斗部扩张。C. acnes组及OA + C. acnes组的真皮层出现以淋巴细胞和中性粒细胞为主的混合性炎性细胞浸润。此外，C. acnes组和OA + C. acnes组真皮层中还可见明显的红细胞外渗及脓肿形成（图4）。如 图5所示，与NC组相比，C. acnes组和OA组的病理评分升高，而OA + C. acnes组的评分显著高于NC组和OA组（p < 0.05）。
免疫组化（IHC）
如图6所示，TNF-α 在 C. acnes 组和 OA + C. acnes 组的真皮层中高表达。
图1：病理评分示例图像。炎症细胞以红色箭头标示。 评分标准详见表1。(A) 评分为0，漏斗部无角质堆积；(B) 评分为1，上皮增生且毛囊管内有密集、持续的角质堆积，但程度不严重；(C) 评分为1，毛囊周围有少量炎症细胞；(D) 评分为2，真皮层广泛浸润炎症细胞；(E) 评分为3，致密角质大量积聚，扩张漏斗部并延伸至皮脂腺导管，类似于临床病例中的粉刺表现；(F) 漏斗部周围出现脓肿，可能发展为丘疹或脓疱。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：第0天至第25天耳厚度的变化趋势。 NC组以红线表示，OA组以蓝线表示，C. acnes组以绿线表示，OA与C. acnes联合组以黄线表示。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：耳部的大体外观。 粉刺和丘疹由红色箭头标示。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：大鼠耳部组织学。 (▲) 角化过度；(■) 角化不全；(•) 毛囊漏斗部扩张；(♦) 炎性细胞浸润。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：病理评分。 @ 表示NC组与C. acnes组之间具有统计学显著差异；# 表示NC组与OA + C. acnes组之间具有显著差异；* 表示OA + C. acnes组与OA组之间具有显著差异（p < 0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。
图6：大鼠耳部TNF-α表达的免疫组化图像。 （♦）炎性细胞浸润。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 评分 | 特征 | ||
| 0 | 非致粉刺性。（见图1 A） | ||
| 1 | 上皮增生，且毛囊漏斗部开始出现致密、持续的角质堆积，导致毛囊管扩张。（见图1 B） | ||
| 1 | 少量炎性细胞浸润，尤其见于毛囊或皮脂腺导管周围。（见图1 C） | ||
| 2 | 大量炎性细胞广泛浸润。（见图1 D） | ||
| 3 | 致密角质大量堆积，扩张毛囊漏斗部并延伸至皮脂腺导管，同时伴有明显的毛囊上皮增生。（见图1 E） | ||
| 3 | 存在脓肿。（见图1 F） | ||
表1：病理评分标准。 样本图像见图1。
| 时间 | NC组（mm） | OA组（mm） | C. acnes组（mm） | OA + C. acnes组（mm） |
| 第0天 | 0.4000±0.0250 | 0.4167±0.0144 | 0.4500±0.0000 | 0.4667±0.0382 |
| 第7天 | 0.5250±0.0661 | 0.7667±0.0878*▲ | 0.4500±0.0000 | 0.7917±0.0764*▲ |
| 第14天 | 0.5083±0.0289 | 0.8167±0.1233*▲ | 0.6083±0.0382 | 0.9333±0.0804*▲ |
| 第21天 | 0.5250±0.0433 | 1.0667±0.2241*▲ | 0.5583±0.0144 | 0.9417±0.0722*▲ |
| 第25天 | 0.5750±0.0500 | 0.8250±0.1392* | 0.9500±0.1639* | 1.0583±0.0804* |
表2：耳朵厚度。 数据以均值±标准差表示。符号“*”表示与NC组相比具有统计学显著性差异；符号“▲”表示与C. acnes组相比具有统计学显著性差异（p < 0.05）。
讨论
由于痤疮模型的方法学和评价标准尚不明确，本实验方案旨在为研究痤疮的科研人员提供参考。由于小鼠耳朵尺寸较小，且背部毛发生长会带来干扰，需使用脱毛膏和剃须刀处理，因此大鼠耳朵可能是建立啮齿类动物痤疮模型的更佳替代部位。我们曾尝试在大鼠背部皮肤建立痤疮模型，但效果不如在大鼠耳朵上观察到的结果理想。
一些研究人员仅采用单一方法来诱导痤疮炎症，例如涂抹油脂或注射微生物14,16。然而，研究表明，皮脂分泌增加会促进毛囊堵塞部位痤疮丙酸杆菌（C. acnes）的过度增殖，而C. acnes反过来又会刺激皮脂腺异常分泌；二者相互作用可能加剧痤疮炎症。因此，通过油脂与C. acnes共同诱导的复合模型可能更贴近临床上的痤疮病变10,21,22。为了客观评估不同实验组之间的病理变化，我们设计了一种受先前研究启发的评分系统，该系统包括角蛋白积聚及其导致的毛囊管腔扩大和上皮增生、真皮层炎性细胞浸润，甚至脓肿的进一步发展（表 1 和 图 1）16,23。利用该评分方法，结合组织病理学和免疫组织化学（IHC）分析，我们发现将C. acnes与油酸应用于耳部可导致更显著的真皮紊乱和炎症反应。这些结果与人类中度痤疮患者所观察到的症状相似，凸显了该复合模型在模拟痤疮发展过程中的重要价值（图 4 和 图 5）24。
为了更好地评估模型，有必要在涂抹油剂和接种C. acnes之前记录耳朵的厚度。考虑到耳部内外侧厚度存在差异，我们记录了两个特定位置，以确保测量结果能更准确地反映耳朵的整体厚度，且测量时由两名操作人员协作完成。涂抹油酸时需注意，由于油酸具有流动性，容易流入耳道并刺激大鼠，因此涂抹时应将大鼠头部适当倾斜，以避免油酸进入耳道。
第7天观察到粉刺形成，且病变持续加重直至实验结束。C. acnes的刺激是影响痤疮发展的另一个重要因素。C. acnes不仅促进皮脂腺中的脂质合成，还会与真皮层中毛囊及皮脂腺周围的炎性细胞反应，诱导炎性因子释放，从而进一步加剧炎症反应6,25。因此，我们采用皮内注射C. acnes以加速炎症进程。考虑到大鼠耳部组织极薄，需使用微针以避免穿透耳部。为确保正确的皮内注射，针头应以10至15度的角度刺入，深度约为1 mm。此外，当一名操作者进行皮内注射时，另一名操作者必须固定大鼠头部，以防耳部被刺穿。为防止出血，注射部位应避开大鼠耳部的浅表血管。注射C. acnes后，耳部明显变得粗糙、发红、肿胀，并出现丘疹（图3）。
皮脂/皮脂组分和C. acnes在不同实验中的应用方式各异。一些研究人员采用单次注射C. acnes后连续七天涂抹皮脂的方法，在大鼠背部诱导出脓肿、红斑和硬结19。另一些研究人员则在大鼠耳部连续注射C. acnes四天，并涂抹皮脂三十天18。由于痤疮炎症的发生与皮脂/皮脂组分的应用方式、C. acnes的活性和浓度以及造模组织部位相关，目前尚无统一标准。本实验中，考虑到油酸不仅能诱导毛囊角化、刺激表皮炎症，还可促进C. acnes的生长6,7,8，因此选用油酸替代人工皮脂以模拟皮脂作用。实验结果显示，涂抹油酸7天后，大鼠耳部出现红肿；第7至14天，耳部开始出现鳞屑和粉刺；第15至21天，粉刺数量增加，但未见其他进一步的痤疮症状。在第21天，我们开始在皮内注射1 × 107 CFU C. acnes，该方法在既往研究中已有广泛报道19。
起初，效果并不明显，但随后我们发现注射了C. acnes的大鼠耳朵出现了丘疹。鉴于各组间耳部厚度随时间变化无显著差异，我们决定在第25天终止实验（图2和表2）。该方案仍存在一些局限性。耳部区域较小可能会影响后续的药物治疗。C. acnes并非参与痤疮病理过程的唯一微生物群，因此使用多种细菌诱导痤疮以模拟临床情况可能更为理想26。
披露
所有作者声明均无利益冲突。
致谢
本研究由国家自然科学基金（编号81974572和编号82274523）以及北京中医药大学（编号202310026002）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 厌氧指示剂 | Mitsubishi, Japan | C-22 | |
| 厌氧袋 | Mitsubishi, Japan | C-11, C-41 | |
| 哥伦比亚血琼脂平板 | BeNa Cuture Collection, 中国 | BNCC330605 | |
| 恒温培养箱 | SHANGCHENG, 中国 | 303-0 | |
| 棉签 | HYNAUT, 中国 | _ | |
| Cutibacterium acnes | BeNa Cuture Collection, 中国 | BNCC330605 | |
| Dako REAL EnVision 检测系统，过氧化物酶/DAB+，兔/小鼠 | DAKO, Denmark | K5007 | |
| 一次性无菌注射针头 | 浙江欧健医用器材有限公司, 中国 | _ | |
| 电子天平 | 金轩, 中国 | A017 | |
| 电子游标卡尺 | 得力, 中国 | DL90150 | |
| 油酸（分析纯试剂，AR） | 方正, 中国 | _ | |
| 氯化钠注射液 | 双鹤药业, 中国 | Y2212241 | |
| SPSS Statistics | IBM, USA | 26.0 | |
| 无菌皮下注射器 | 山东威高集团医用高分子制品股份有限公司, 中国 | _ | |
| TNF Alpha 单克隆抗体 | Proteintech Group,int, USA | 60291-1-lg |
参考文献
- Cooper, A. J., Harris, V. R. Modern management of acne. The Medical Journal of Australia. 206 (1), 41-45 (2017).
- Vos, T., et al. Years lived with disability (YLDs) for 1160 sequelae of 289 diseases and injuries 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), London, England. 2163-2196 (2012).
- Layton, A. M., Thiboutot, D., Tan, J. Reviewing the global burden of acne: how could we improve care to reduce the burden. The British Journal of Dermatology. 184 (2), 219-225 (2021).
- Hazarika, N. Acne vulgaris: new evidence in pathogenesis and future modalities of treatment. Journal of Dermatological Treatment. 32 (3), 277-285 (2021).
- Das, S., Reynolds, R. V. Recent advances in acne pathogenesis: implications for therapy. American Journal of Clinical Dermatology. 15 (6), 479-488 (2014).
- Dréno, B., et al. Cutibacterium acnes (Propionibacterium acnes) and acne vulgaris: a brief look at the latest updates. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology: JEADV. 32, Suppl 2 5-14 (2018).
- Marples, R. R., Downing, D. T., Kligman, A. M. Control of free fatty acids in human surface lipids by Corynebacterium acnes. The Journal of Investigative Dermatology. 56 (2), 127-131 (1971).
- Katsuta, Y., Iida, T., Hasegawa, K., Inomata, S., Denda, M. Function of oleic acid on epidermal barrier and calcium influx into keratinocytes is associated with N-methyl D-aspartate-type glutamate receptors. The British Journal of Dermatology. 160 (1), 69-74 (2009).
- Kurokawa, I., et al. New developments in our understanding of acne pathogenesis and treatment. Experimental Dermatology. 18 (10), 821-832 (2009).
- Clayton, R. W., et al. Homeostasis of the sebaceous gland and mechanisms of acne pathogenesis. The British Journal of Dermatology. 181 (4), 677-690 (2019).
- Cong, T. X., et al. From pathogenesis of acne vulgaris to anti-acne agents. Archives of dermatological research. 311 (5), 337-349 (2019).
- Ji, J., et al. Analgesic and anti-inflammatory effects and mechanism of action of borneol on photodynamic therapy of acne. Environmental Toxicology and Pharmacology. 75, 103329(2020).
- Ou-Yang, X. L., et al. Nontargeted metabolomics to characterize the effects of isotretinoin on skin metabolism in rabbit with acne. Frontiers in Pharmacology. 13, 963472(2022).
- Zhu, Z., et al. Skin microbiome reconstruction and lipid metabolism profile alteration reveal the treatment mechanism of Cryptotanshinone in the acne rat. Phytomedicine. 101, 154101(2022).
- Jang, Y. H., et al. HR-1 mice: A new inflammatory acne mouse model. Annals of Dermatology. 27 (3), 257-264 (2015).
- De Young, L. M., Young, J. M., Ballaron, S. J., Spires, D. A., Puhvel, S. M. Intradermal injection of Propionibacterium acnes: a model of inflammation relevant to acne. The Journal of Investigative Dermatology. 83 (5), 394-398 (1984).
- Chen, T., et al. A skin lipidomics study reveals the therapeutic effects of Tanshinones in a rat model of acne. Frontiers in Pharmacology. 12, 675659(2021).
- Cao, J., Xu, M., Zhu, L., Xiao, S. Viaminate ameliorates Propionibacterium acnes-induced acne via inhibition of the TLR2/NF-κB and MAPK pathways in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 396 (7), 1487-1500 (2023).
- Kolar, S. L., et al. Propionibacterium acnes-induced immunopathology correlates with health and disease association. JCI insight. 4 (5), e124687(2019).
- Zhong, C., et al. Inhibition of protein glycosylation is a novel pro-angiogenic strategy that acts via activation of stress pathways. Nature Communications. 11 (1), 6330(2020).
- O'Neill, A. M., Gallo, R. L. Host-microbiome interactions and recent progress into understanding the biology of acne vulgaris. Microbiome. 6 (1), 177(2018).
- Moradi Tuchayi, S., et al. Acne vulgaris. Nature Reviews. Disease Primers. 1, 15029(2015).
- American Academy of Dermatology. American Academy of Dermatology invitational symposium on comedogenicity. Journal of the American Academy of Dermatology. 20 (2), Pt 1 272-277 (1989).
- Katsambas, A. D., Cunliffe, W. J., Zoubolis, C. C. Clinical aspects of acne vulgaris. Pathogenesis and treatment of acne and rosacea. Zouboulis, C. C., Katsambas, A. D., Kligman, A. M. , Springer. Berlin, Heidelberg. 213-221 (2014).
- Williams, H. C., Dellavalle, R. P., Garner, S. Acne vulgaris. Lancet. 379 (9813), London, England. 361-372 (2012).
- Rocha, M. A., Bagatin, E. Skin barrier and microbiome in acne. Archives of Dermatological Research. 310 (3), 181-185 (2018).
重印与许可
标签
