自然条件下科罗拉多马铃薯甲虫越冬的实验研究

摘要

本文介绍了一种在温带自然条件下研究科罗拉多马铃薯甲虫越冬行为的方法，以及在冬季收集甲虫的技术。该方法可在越冬的任何阶段获取所需数量的越冬个体，用于各种分析。

摘要

马铃薯的主要害虫之一 Solanum tuberosum 温带地区的重要昆虫是科罗拉多马铃薯甲虫（Colorado potato beetle, CPB）。目前关于CPB免疫与疾病的研究大多集中在活跃取食阶段。然而，尽管该甲虫在其生命周期中大部分时间处于冬季滞育（冬眠）状态，针对其休眠阶段的研究却相对较少。本研究建立并验证了一种在自然条件下研究CPB冬眠的方法，为在冬季采集足够数量的个体提供了可能。本文评估了CPB在冬眠期间的存活情况，并鉴定了不同滞育阶段的病原微生物。CPB的死亡率在冬眠期间逐渐上升，至4月至5月达到峰值。昆虫病原真菌（球孢白僵菌, Isaria，以及 Lecanicillium）和细菌 芽孢杆菌属，鞘氨醇杆菌属，副芽孢杆菌属，假单胞菌属，以及 粘质沙雷氏菌 被分离 从死亡的昆虫中获取。整个冬眠期间，甲虫的存活率为61%。未发现任何冻结或干化的甲虫，表明本方法取得了成功。

引言

科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Say（CPB）是茄科植物的重要害虫，主要危害马铃薯Solanum tuberosum L.。该物种的地理分布范围超过1600万km²，且持续扩张¹。CPB具有兼性冬季滞育特性，在温带地区冬眠是其必经阶段。滞育由短日照光周期诱导，并受温度调节¹。这些甲虫以成虫形态钻入土壤中越冬。随着纬度升高，冬眠期持续时间延长。在温带地区，尤其是其分布范围的北部区域，越冬期可长达9个月：从8月至9月持续到次年5月至6月（Noskov等，个人观察）。在此期间，CPB与温带地区其他昆虫一样，会暴露于不利的冬季环境条件，必须提高其耐寒能力。同时，甲虫与土壤的接触也增加了被各种机会性及致病性微生物感染的风险²。因此，这些甲虫在冬眠期间需要维持一定程度的免疫系统活性，而这同样需要消耗大量能量。然而，即使昆虫能够存活于感染，疾病也可能降低其抗寒性³。需要注意的是，低温并非导致CPB冬季死亡的唯一原因。缺氧也起着重要作用，在某些条件下，甚至可能是冬季死亡的主要因素^4,5。

已知马铃薯甲虫（CPB）在自然条件下的冬季死亡率可能非常高，在黏壤土中可达100%⁶。因此，越冬是CPB生命周期中最关键的阶段之一。然而，关于CPB在自然条件下冬眠期间的生理状态、免疫系统活性、存活率及其他参数的数据仍然有限。已有研究探讨了CPB成虫在滞育期间以及对低温冲击响应时的差异基因表达和多种生理参数^{7,8,9,10,11,12}；但这些分析主要是在实验室条件下通过人工诱导滞育或冷胁迫进行的，缺乏自然环境中温度、湿度及本地病原体负荷的动态变化。因此，从自然土壤中挖掘采集CPB个体，研究其生理特征具有重要意义。20世纪70至80年代，研究人员曾积极开展了多项关于CPB在自然条件下越冬特性的研究^{13,14,15,16,17,18}。然而，这些研究并未涉及冬季从土壤中挖掘CPB个体的操作。此外，目前尚无详细描述用于CPB受控冬眠的实验装置及其笼具结构的技术方案。因此，亟需开展针对CPB在自然环境中越冬生理机制的深入研究¹⁹。

本研究旨在开发并测试一种在自然条件下对马铃薯甲虫成虫进行可控休眠的方法。该方法可在大陆性气候的野外条件下，获得特定数量的马铃薯甲虫个体，用于休眠期间的微生物学、免疫学及其他检测。该方法可被调整并应用于其他在积雪覆盖的土壤中越冬的昆虫物种。

方案

1. 冬眠笼具的描述

注意：根据实验目的的不同，笼子的数量也会有所变化。每个采样日期至少使用三个笼子。为了估算将要羽化的甲虫数量，需额外准备至少三个笼子，这些笼子将一直保留在土壤中直至春季。

1. 使用由刚性木框制成的笼子，尺寸为 25 × 25 × 40 cm（长 × 宽 × 高）。
2. 制作笼子框架时，使用厚度至少为 2 cm、宽度为 4 cm 的木条。
3. 用孔径不超过 5 mm × 3 mm 的不锈钢网覆盖笼子内部，并使用木工订书机固定钢网。
4. 用订书机将不锈钢网固定在笼子底部的外侧。
5. 在笼子内部衬上密度为 60 g/m² 的黑色合成土工布。
   注意：土工布可作为额外屏障，防止甲虫逃逸。在涉及主动移动的昆虫病原体和寄生性天敌的相关实验中，请勿使用。
6. 在笼子顶部紧密安装一段约 60 cm 高的合成半透明透气织物管。
7. 在笼子底部交叉固定两条结实的绳索，以便在需要时将笼子从土壤中拉出。

2. 笼具的安装

1. 在土壤中挖一个深40 cm的洞，并将笼子放入其中。
2. 将干草或稻草铺在洞内。
3. 将笼子放入，使干草或稻草位于笼壁与土壤之间。
4. 用采集昆虫的同一块马铃薯田中的土壤填满笼子。
5. 在指定深度将防水的温度和湿度数据记录仪安装到笼子中。
   注意：可使用任何制造商的数据记录仪，但必须能够在低温下运行。
6. 在引入甲虫前3-4周，于每个笼子内种植马铃薯幼苗，并适量浇水。
7. 将一根合成织物管垂直固定在安装于笼子外侧的任意材质的杆子上。

3. 越冬前昆虫的饲养

1. 在马铃薯生长末期，于无农药的马铃薯田中人工采集成虫。
   注意：成虫与幼虫形态差异显著，成虫具有条纹状鞘翅，而幼虫呈红色。
2. 将采集的成虫置于15–20 L的塑料桶中（每桶最多200头），桶内放入马铃薯植株顶部供其取食，之后再转移至饲养笼中。
3. 用透气织物覆盖塑料桶。
   注意：昆虫在桶中存放时间不得超过12小时。使用足够大的马铃薯植株顶部，以防止成虫在桶底聚集。
4. 在覆盖合成织物网的马铃薯植株上放置的科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）个体不超过200头。
5. 当马铃薯植株顶部被取食完毕后，更换盛有水的塑料瓶中插入的新鲜植株，并自此每日更换。
   注意：为固定茎秆，可使用脱脂棉和封口膜。移除旧茎秆时应仔细检查是否有甲虫残留。
6. 当所有甲虫均已钻入土壤进入越冬状态后，解开固定在木棍上的合成织物管，将织物平铺于地面。

4. 冬季昆虫采集

1. 清除笼子表面以上的积雪。
2. 用结实的铲子将笼子两侧的土壤松动。
3. 利用绳索将笼子从土壤中拉出。
4. 将笼子带回实验室。
   注意：根据实验目的，冬眠的甲虫在分析前可能需要保持不活跃状态。在此情况下，从土壤中分离甲虫时，实验室温度应保持在约 2–5 °C。
5. 将箱内土壤分小部分取出，小心捣碎较大的土块，并用镊子分离甲虫。
6. 将活甲虫与尸体分离开。健康的活甲虫会在周围形成致密的土团，构成一个空气腔（即所谓的“摇篮”），因此易于与土壤分离。被真菌杀死的甲虫会呈现木乃伊化，或体表可见菌丝。受细菌分解的昆虫体色变深。
7. 将土壤过筛，以确保所有甲虫均已被分离且未受损伤。
8. 将表现出真菌感染或细菌分解症状的尸体放入单独的无菌 15 mL 离心管中，以备后续鉴定。
9. 将活甲虫置于含湿润棉球的密闭通风容器中，于 0–2 °C 冰箱中保存，直至进行分析。

5. 器官和组织样本的制备

1. 采集血淋巴时，使用胰岛素针头在鞘翅下方的腹部侧面进行穿刺。
   注意：在越冬期间，血淋巴的量显著减少，这使得采集该液体变得困难。
2. 为分离肠道，剪除头壳，将所有内容物挤入含有磷酸盐缓冲液的培养皿中，分离肠道，并清除其上的脂肪组织和马氏管。
3. 分离所需的肠道部位，例如前肠、中肠或后肠。
4. 为分离脂肪体，在肠道分离完成后，将其从其他组织中分离出来。
   ​注意：分离得到的组织可用于测定抗氧化酶和解毒酶活性（示例： 补充图1）、免疫信号通路相关基因表达调控分析（示例： 补充图2），或昆虫肠道内容物的代谢条形码分析等。

6. 从尸体中分离微生物

1. 为从虫尸中分离虫生真菌，将僵化的昆虫放入无菌保湿培养皿中。
2. 若存在，取甲虫内部组织中的气生分生孢子或菌核，接种于含0.4%乳酸的沙氏葡萄糖琼脂培养基上。
   注意：对于已长出菌丝和分生孢子的甲虫，应立即取样接种（无需放入保湿培养皿）。
3. 从呈现细菌性腐烂症状的虫尸中分离细菌。
4. 切下甲虫头部，挤出内部组织内容物，并收集至离心管中，随后接种于细菌培养基（LB琼脂、伊红美蓝琼脂和胆汁七叶苷琼脂）上。
   注意：使用显微镜检查和分子生物学方法鉴定病原菌的属和种。如有必要，可进一步检测是否存在其他寄生生物。

结果

以下关于马铃薯甲虫越冬的结果展示了土壤温度、存活率及感染情况。

土壤温度动态。
在笼内30 cm深度处，从11月底至次年4月初记录到低于零度的温度（图1）。此期间的平均温度为-3.3 ± 0.1 °C（均值 ± 标准误）。最低记录温度出现在2月中旬，为-7.9 °C。

越冬马铃薯甲虫的存活情况。
在休眠期间观察到昆虫死亡率，并在春季羽化前达到最高。初始甲虫数量为2000只，到五月底存活个体为1470只。甲虫在休眠期间的存活率为61%（图2）。

越冬期玉米根叶甲的感染情况。
对530只死亡甲虫的分析显示，在冬眠期间，53%的个体表现出细菌性分解症状，25%表现出真菌感染症状（图3

讨论

本研究表明，所提出的研究马铃薯甲虫越冬的方法能够使我们在冬眠的不同阶段获得足够数量的昆虫。该技术的成功取决于多个独立因素，其中最重要的是天气条件。在寒冷且无雪的冬季，土壤可能冻结至整个笼子的深度，这种情况下，所有甲虫死亡的风险将显著增加¹⁸。甲虫的存活依赖于多种因素的综合作用，而这些因素在不同年份之间可能存在显著差异⁶。

实验期间，冬季笼内土壤温度未低于-7.9 °C。在深度超过25 cm处未观察到冰层，即使在最寒冷时期（1月至2月），土壤仍保持疏松状态。大多数甲虫聚集在每个笼子的下部，深度为30–40 cm。若笼子更深，甲虫可能钻得更深。然而，增加笼子深度会导致重量增加，使其更难从土壤中取出，尤其是在冬季。此外，根据我们在研究区域马铃薯田间的观察，科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）越冬时钻入土壤的深度不超过35 cm。这一现象可归因于30–35 cm深度处存在黏土层，甲虫无法穿透该土层。在本实验中，使用的是上层30 cm土层的砂质壤土。这可能是甲虫在实验条件下比自然条件下钻得更深的原因。通常...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂-琼脂，细菌学纯化	diaGene	1806.5000
胆汁七叶苷琼脂	HiMedia	M972
Endo 琼脂	HiMedia	M029
葡萄糖一水合物-D	PanReac Applichem	143140.1000Φ
乳酸	PanReac Applichem	141034.1211
LB液体培养基	HiMedia	G009
15 ml 锥形离心管	Axygen	SCT-15ML-25-S
蛋白胨	FBIS SRCAMB	M<图片替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/65862/65862eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>030/O61
磷酸盐缓冲液	Medigen	PBS500
温度和湿度数据记录仪 Ecklerk-M-11	Relsib		防水数据记录仪