本文介绍了一种在温带自然条件下研究科罗拉多马铃薯甲虫越冬行为的方法，以及在冬季收集甲虫的技术。该方法可在越冬的任何阶段获取所需数量的越冬个体，用于各种分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
马铃薯的主要害虫之一 Solanum tuberosum 温带地区的重要昆虫是科罗拉多马铃薯甲虫（Colorado potato beetle, CPB）。目前关于CPB免疫与疾病的研究大多集中在活跃取食阶段。然而，尽管该甲虫在其生命周期中大部分时间处于冬季滞育（冬眠）状态，针对其休眠阶段的研究却相对较少。本研究建立并验证了一种在自然条件下研究CPB冬眠的方法，为在冬季采集足够数量的个体提供了可能。本文评估了CPB在冬眠期间的存活情况，并鉴定了不同滞育阶段的病原微生物。CPB的死亡率在冬眠期间逐渐上升，至4月至5月达到峰值。昆虫病原真菌（球孢白僵菌, Isaria，以及 Lecanicillium）和细菌 芽孢杆菌属，鞘氨醇杆菌属，副芽孢杆菌属，假单胞菌属，以及 粘质沙雷氏菌 被分离 从死亡的昆虫中获取。整个冬眠期间，甲虫的存活率为61%。未发现任何冻结或干化的甲虫，表明本方法取得了成功。
引言
科罗拉多马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata Say（CPB）是茄科植物的重要害虫，主要危害马铃薯Solanum tuberosum L.。该物种的地理分布范围超过1600万km2，且持续扩张1。CPB具有兼性冬季滞育特性，在温带地区冬眠是其必经阶段。滞育由短日照光周期诱导，并受温度调节1。这些甲虫以成虫形态钻入土壤中越冬。随着纬度升高，冬眠期持续时间延长。在温带地区，尤其是其分布范围的北部区域，越冬期可长达9个月：从8月至9月持续到次年5月至6月（Noskov等，个人观察）。在此期间，CPB与温带地区其他昆虫一样，会暴露于不利的冬季环境条件，必须提高其耐寒能力。同时，甲虫与土壤的接触也增加了被各种机会性及致病性微生物感染的风险2。因此，这些甲虫在冬眠期间需要维持一定程度的免疫系统活性，而这同样需要消耗大量能量。然而，即使昆虫能够存活于感染，疾病也可能降低其抗寒性3。需要注意的是，低温并非导致CPB冬季死亡的唯一原因。缺氧也起着重要作用，在某些条件下，甚至可能是冬季死亡的主要因素4,5。
已....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 冬眠笼具的描述
注意：根据实验目的的不同，笼子的数量也会有所变化。每个采样日期至少使用三个笼子。为了估算将要羽化的甲虫数量，需额外准备至少三个笼子，这些笼子将一直保留在土壤中直至春季。
- 使用由刚性木框制成的笼子，尺寸为 25 × 25 × 40 cm（长 × 宽 × 高）。
- 制作笼子框架时，使用厚度至少为 2 cm、宽度为 4 cm 的木条。
- 用孔径不超过 5 mm × 3 mm 的不锈钢网覆盖笼子内部，并使用木工订书机固定钢网。
- 用订书机将不锈钢网固定在笼子底部的外侧。
- 在笼子内部衬上密度为 60 g/m2 的黑色合成土工布。
注意：土工布可作为额外屏障，防止甲虫逃逸。在涉及主动移动的昆虫病原体和寄生性天敌的相关实验中，请勿使用。 - 在笼子顶部紧密安装一段约 60 cm 高的合成半透明透气织物管。
- 在笼子底部交叉固定两条结实的绳索，以便在需要时将笼子从土壤中拉出。
2. 笼具的安装
- 在土壤中挖一个深40 cm的洞，并将笼子放入其中。
- 将干草或稻草铺在洞内。
- 将笼子放入，使干草或稻草位于笼壁与土壤....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
以下关于马铃薯甲虫越冬的结果展示了土壤温度、存活率及感染情况。
土壤温度动态。
在笼内30 cm深度处，从11月底至次年4月初记录到低于零度的温度（图1）。此期间的平均温度为-3.3 ± 0.1 °C（均值 ± 标准误）。最低记录温度出现在2月中旬，为-7.9 °C。
越冬马铃薯甲虫的存活情况。
在休眠期间观察到昆虫死亡率，并在春季羽化前达到最高。初始甲虫数量为2000只，到五月底存活个体为1470只。甲虫在休眠期间的存活率为61%（图2）。
越冬期玉米根叶甲的感染情况。
对530只死亡甲虫的分析显示，在冬眠期间，53%的个体表现出细菌性分解症状，25%表现出真菌感染症状（图3
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究表明，所提出的研究马铃薯甲虫越冬的方法能够使我们在冬眠的不同阶段获得足够数量的昆虫。该技术的成功取决于多个独立因素，其中最重要的是天气条件。在寒冷且无雪的冬季，土壤可能冻结至整个笼子的深度，这种情况下，所有甲虫死亡的风险将显著增加18。甲虫的存活依赖于多种因素的综合作用，而这些因素在不同年份之间可能存在显著差异6。
实验期间，冬季笼内土壤温度未低于-7.9 °C。在深度超过25 cm处未观察到冰层，即使在最寒冷时期（1月至2月），土壤仍保持疏松状态。大多数甲虫聚集在每个笼子的下部，深度为30–40 cm。若笼子更深，甲虫可能钻得更深。然而，增加笼子深度会导致重量增加，使其更难从土壤中取出，尤其是在冬季。此外，根据我们在研究区域马铃薯田间的观察，科罗拉多马铃薯甲虫（CPB）越冬时钻入土壤的深度不超过35 cm。这一现象可归因于30–35 cm深度处存在黏土层，甲虫无法穿透该土层。在本实验中，使用的是上层30 cm土层的砂质壤土。这可能是甲虫在实验条件下比自然条件下钻得更深的原因。通常.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
感谢我们的同事 Vladimir Shilo、Vera Morozovа、Ulyana Rotskaya、Olga Polenogova 和 Oksana Tomilova 在野外和实验室工作组织与实施过程中提供的帮助。
本研究由俄罗斯科学基金会项目（编号：22-14-00309）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂-琼脂，细菌学纯化 | diaGene | 1806.5000 | |
| 胆汁七叶苷琼脂 | HiMedia | M972 | |
| Endo 琼脂 | HiMedia | M029 | |
| 葡萄糖一水合物-D | PanReac Applichem | 143140.1000Φ | |
| 乳酸 | PanReac Applichem | 141034.1211 | |
| LB液体培养基 | HiMedia | G009 | |
| 15 ml 锥形离心管 | Axygen | SCT-15ML-25-S | |
| 蛋白胨 | FBIS SRCAMB | M<图片替代文本="公式 1" src="/files/ftp_upload/65862/65862eq01v2.jpg" 样式="margin: auto;"/>030/O61 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Medigen | PBS500 | |
| 温度和湿度数据记录仪 Ecklerk-M-11 | Relsib | 防水数据记录仪 |
参考文献
- Alyokhin, A., Benkovskaya, G., Udalov, M. Colorado potato beetle. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 29-43 (2022).
- Alyokhin, A., Kryukov, V. Ecology of a potato field. Insect Pests of Potato. , Academic Press. 451-462 (2022).
- Lee Jr, R. E., Costanzo, J. P., Kaufman, P. E., Lee, M. R., Wyman, J. A.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
