本文介绍了一种两步细胞消化方案，用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬液。
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本文内容
摘要
摘要
颈动脉是颈部的主要血管，负责向大脑供应血液和氧气，但当颈动脉被斑块堵塞时，就会发生颈动脉狭窄。在单细胞水平上揭示颈动脉的细胞组成，对于治疗颈动脉粥样硬化至关重要。然而，目前尚无现成可用的从颈动脉制备单细胞悬液的实验方案。为了获得一种对细胞损伤较小且适用于正常颈动脉单细胞解离的合适方案，我们设计了一种两步消化法，结合了胶原酶/DN酶和胰蛋白酶的消化过程。采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双荧光计数法检测细胞活力和浓度，结果显示所获得的单细胞悬液满足单细胞测序的要求，细胞活力超过85%，且细胞浓度较高。经过单细胞数据处理后，每个颈动脉细胞平均检测到约2500个转录本。值得注意的是，正常颈动脉中的多种细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）以及巨噬细胞和树突状细胞（Mφ/DCs），均可同时被检测到。该方案经过适当修改后，可能适用于制备来自其他组织的血管单细胞悬液。
引言
动脉粥样硬化是一种与高血压、高脂血症和血流动力学等因素相关的慢性炎症性疾病1。颈动脉分叉处易受血流动力学变化的影响，从而导致颈动脉斑块的形成。颈动脉粥样硬化的临床表现可为急性，如脑卒中和短暂性脑缺血发作，也可为慢性，如反复发作的短暂性脑缺血和血管性痴呆2。从机制上讲，颈动脉斑块是在病理条件下不同血管壁细胞与多种血细胞相互作用的结果。因此，揭示颈动脉在生理和病理状态下的单细胞图谱，对于预防和治疗颈动脉斑块的发展具有重要意义。
单细胞RNA测序技术因其超高的分辨率以及能够检测同一生物体相同细胞类型中的细胞异质性，已成为生物学研究中最强大的技术之一3,4。研究人员已将单细胞RNA测序应用于多个领域的研究，如心血管疾病5和癌症6。然而，如何快速且准确地将组织解离为单个细胞，仍然是当前面临的主要挑战之一。酶解法是一种常用的方法，主要包括胶原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase和透明质酸酶。其中，胶原酶是单细胞消化过程中的主要酶类，主要作用是水解结缔组织中的胶原成分。不同类型的胶原酶适用于不同组织的解离，例如乳腺7、肾小球
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方案
下述所有动物实验程序均经苏州大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准。
1. 试剂与材料准备
- 使用不含钙和镁的1×PBS以及2.5 U/mL肝素钠盐配制灌注液。4 °C保存，使用前置于冰上预冷。
- 用HBSS稀释1250 CDU/mL胶原酶II和3000 U/mL DNase I，配制含125 CDU/mL胶原酶II和60 U/mL DNase I的解离试剂A。4 °C保存至使用前。
- 将1 mL 0.25%不含EDTA的胰蛋白酶（不含酚红）加入1 mL 1×PBS中，稀释得到终浓度为0.12%的胰蛋白酶溶液，即为解离试剂B。4 °C保存至使用前。
- 配制10 mL含1.5% FBS的1×PBS和10 mL含5% FBS的1×PBS。使用含1.5% FBS的PBS收集颈动脉，并在使用前置于冰上。使用含5% FBS的PBS终止消化反应，室温（RT）保存。
- 准备实验材料，包括1 mL注射器、带26 G针头的20 mL注射器、六孔细胞培养板、1.5 mL离心管、40 µm无菌细胞筛网以及盛冰容器。
2. 仪器设备准备
- 对所有手术器械进行灭菌，包括体视显微镜、解剖剪、显微....
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结果
本方案描述了一种用于制备小鼠颈动脉单细胞悬液的两步细胞消化法（图1）。该两步细胞消化法结合使用胶原酶/DN酶与胰蛋白酶，可有效解离小鼠颈动脉血管壁，获得适用于单细胞测序的高质量单细胞悬液。消化完成后，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和细胞活力。明场图像显示了消化后颈动脉血管细胞的形态，AOPI双荧光染色则同时检测了细胞活力（图2A、B）。值得注意的是，与单独使用解离试剂A相比，联合使用解离试剂B可更彻底地解离颈动脉组织。我们进一步统计了九条动脉的活细胞数量，结果显示经两步消化后，平均细胞直径满足单细胞测序的要求（图2C）。同时，从九条左侧颈动脉中共收集到176,000个单细胞，大多数血管组织被解离为单个细胞，且细胞活力较高（图2C）。
在完成比对、过滤、条形码计数和UMI计数后，使用R软件包Seurat对单细胞测序.......
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讨论
本文提供了一种从野生型小鼠颈动脉制备高质量单细胞悬液的详细方案，该方案建立了整合胶原酶/DNase与胰蛋白酶消化步骤的两步消化法。在对单细胞悬液进行质量检测后发现，细胞活力超过85%，细胞浓度高，满足单细胞测序的要求。此外，经过单细胞数据处理后，成功检测到颈动脉中的多种细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）以及巨噬细胞/树突状细胞（Mφ/DCs）。
目前制备颈动脉单细胞悬液的方法仍然较少。Depuydt 等人通过在 37 °C 下联合使用胶原酶、DNase、人血清白蛋白 V 级、Flavopiridol 处理 30 分钟，从人颈动脉斑块中获得了单细胞悬液15。经过荧光激活细胞分选后，他们鉴定出 14 种不同的细胞群，包括内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、B 细胞、髓系细胞和 T 细胞15。此外，研究人员使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 0.1% 胶原酶在 37 °C 下消化大鼠颈总动脉，并成功进行了单细胞 RNA 测序
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82070450，资助对象：C.T.；项目编号：82170466，资助对象：L.Z.）以及中国博士后科学基金博士后资助项目（项目编号：7121102223，资助对象：F.L.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 无EDTA胰蛋白酶 | Beyotime | C0205 | 将1 mL 0.25% 无EDTA胰蛋白酶用1 mL 1× PBS稀释。 |
| 0.9% NaCl生理盐水溶液 | Beyotime | ST341 | 将肝素钠溶液稀释至终浓度为10 mg/mL |
| 1 mL注射器 | SKJYLEAN | sk-r009 | 用于心脏灌注 |
| 1.5 mL离心管 | KIRGEN | KG2211W | 用于离心组织块和细胞悬液 |
| 20 mL注射器 | SKJYLEAN | sk-r013 | 用于心脏灌注 |
| 40 µm细胞筛 | JETBIOFIL | css010040 | 用于过滤未消化的组织碎片 |
| AO/PI试剂盒 | 恒瑞生物 | RE010212 | 用于鉴定细胞是否存活 |
| 自动细胞计数仪 | Countstar | Mira FL | 用于分析消化后的颈动脉血管细胞的形态及细胞活力 |
| Cell Ranger软件 | 10× Genomics | 3.0.2 | 用于处理Chromium单细胞RNA测序数据，并进行聚类和基因表达分析 |
| Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10× Genomics | 1000075 | 用于制备单细胞悬液的单细胞RNA测序文库 |
| 胶原酶II | Sigma-Aldrich | C6885 | 用HBSS稀释至终浓度为125 CDU/mL |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS002140 | 用HBSS稀释至终浓度为60 U/mL |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30088.03 | 用于终止消化反应 |
| Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14175095 | 室温保存 |
| 肝素钠盐 | Solarbio Life Science | H8060 | 用0.9% NaCl稀释至终浓度为10 mg/mL |
| 微量离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | 用于沉淀组织和细胞 |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | 测序仪 |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio Life Science | P1000 | 用于心脏灌注和细胞重悬 |
| Seurat软件包-R | Satija实验室 | 3.1.2 | 用于进行单细胞RNA测序数据的降维、可视化及分析 |
| 六孔细胞培养板 | NEST | 703002 | 用于放置血管组织 |
| 水浴锅 | 精宏 | DK-S22 | 维持消化温度在37 °C |
参考文献
- Lee, D. -Y., Chiu, J. -J. Atherosclerosis and flow: roles of epigenetic modulation in vascular endothelium. Journal of Biomedical Science. 26 (1), 56(2019).
- Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 56(2019). ....
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重印与许可
