本文介绍了一种两步细胞消化方案，用于制备小鼠颈动脉的单细胞悬液。
本文内容
摘要
摘要
颈动脉是颈部的主要血管，负责向大脑供应血液和氧气，但当颈动脉被斑块堵塞时，就会发生颈动脉狭窄。在单细胞水平上揭示颈动脉的细胞组成，对于治疗颈动脉粥样硬化至关重要。然而，目前尚无现成可用的从颈动脉制备单细胞悬液的实验方案。为了获得一种对细胞损伤较小且适用于正常颈动脉单细胞解离的合适方案，我们设计了一种两步消化法，结合了胶原酶/DN酶和胰蛋白酶的消化过程。采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双荧光计数法检测细胞活力和浓度，结果显示所获得的单细胞悬液满足单细胞测序的要求，细胞活力超过85%，且细胞浓度较高。经过单细胞数据处理后，每个颈动脉细胞平均检测到约2500个转录本。值得注意的是，正常颈动脉中的多种细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）以及巨噬细胞和树突状细胞（Mφ/DCs），均可同时被检测到。该方案经过适当修改后，可能适用于制备来自其他组织的血管单细胞悬液。
引言
动脉粥样硬化是一种与高血压、高脂血症和血流动力学等因素相关的慢性炎症性疾病1。颈动脉分叉处易受血流动力学变化的影响，从而导致颈动脉斑块的形成。颈动脉粥样硬化的临床表现可为急性，如脑卒中和短暂性脑缺血发作，也可为慢性，如反复发作的短暂性脑缺血和血管性痴呆2。从机制上讲，颈动脉斑块是在病理条件下不同血管壁细胞与多种血细胞相互作用的结果。因此，揭示颈动脉在生理和病理状态下的单细胞图谱，对于预防和治疗颈动脉斑块的发展具有重要意义。
单细胞RNA测序技术因其超高的分辨率以及能够检测同一生物体相同细胞类型中的细胞异质性，已成为生物学研究中最强大的技术之一3,4。研究人员已将单细胞RNA测序应用于多个领域的研究，如心血管疾病5和癌症6。然而，如何快速且准确地将组织解离为单个细胞，仍然是当前面临的主要挑战之一。酶解法是一种常用的方法，主要包括胶原酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase和透明质酸酶。其中，胶原酶是单细胞消化过程中的主要酶类，主要作用是水解结缔组织中的胶原成分。不同类型的胶原酶适用于不同组织的解离，例如乳腺7、肾小球8、虹膜角膜角9、膝关节10、主动脉11和肺组织12。由于不同组织具有独特的生理特性，采用相同方法进行解离可能导致在获取单细胞过程中出现诸多问题，例如细胞活力低、细胞数量少以及细胞碎片较多。因此，针对不同组织开发合适的消化方法，对于制备高质量的单细胞悬液至关重要。
本方案旨在建立一种两步细胞消化法，以制备野生型小鼠颈动脉的单细胞悬液。根据颈动脉的组织特性，我们联合使用胶原酶/DN酶与胰蛋白酶，获得高质量的小鼠颈动脉单细胞悬液，因为胶原酶可水解颈动脉组织中的胶原成分，随后由胰蛋白酶进一步消化为单细胞悬液。采用吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）双荧光染色计数法检测细胞活力与浓度，结果显示所获得的单细胞悬液满足单细胞测序的要求，细胞活力超过85%，且细胞浓度较高。经单细胞数据处理后，在正常小鼠颈动脉消化产物中鉴定出四种细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）以及巨噬细胞和树突状细胞（Mφ/DCs）。本方案的优势在于：1）可识别颈动脉中多种细胞类型；2）细胞活力保持良好；3）无需特殊设备即可重复操作。该方案适用于对小鼠颈动脉单细胞多组学研究感兴趣的科研人员。通过适当调整，本方案也可能适用于其他血管组织的解离处理。
方案
下述所有动物实验程序均经苏州大学 Institutional Animal Care and Use Committee 批准。
1. 试剂与材料准备
- 使用不含钙和镁的1×PBS以及2.5 U/mL肝素钠盐配制灌注液。4 °C保存，使用前置于冰上预冷。
- 用HBSS稀释1250 CDU/mL胶原酶II和3000 U/mL DNase I，配制含125 CDU/mL胶原酶II和60 U/mL DNase I的解离试剂A。4 °C保存至使用前。
- 将1 mL 0.25%不含EDTA的胰蛋白酶（不含酚红）加入1 mL 1×PBS中，稀释得到终浓度为0.12%的胰蛋白酶溶液，即为解离试剂B。4 °C保存至使用前。
- 配制10 mL含1.5% FBS的1×PBS和10 mL含5% FBS的1×PBS。使用含1.5% FBS的PBS收集颈动脉，并在使用前置于冰上。使用含5% FBS的PBS终止消化反应，室温（RT）保存。
- 准备实验材料，包括1 mL注射器、带26 G针头的20 mL注射器、六孔细胞培养板、1.5 mL离心管、40 µm无菌细胞筛网以及盛冰容器。
2. 仪器设备准备
- 对所有手术器械进行灭菌，包括体视显微镜、解剖剪、显微解剖剪和细尖镊子。
- 开启自动细胞计数仪，并在室温下维持运行。
- 提前将水浴锅预热至 37 °C。
- 使用前将微量离心机预冷至 4 °C。
3. 小鼠颈动脉的分离
- 通过腹腔注射1.25%三溴乙醇（每10 g体重注射0.24 mL）麻醉小鼠，并在3分钟后翻转小鼠检查是否仍有翻正反射。随后通过颈椎脱位法处死小鼠，并将其仰卧放置。用75%酒精喷洒小鼠皮肤。
- 使用灭菌的解剖剪剪开皮肤，暴露胸腔，并剪开膈肌。
- 继续向上剪至下颌部位，小心去除多余的结缔组织和脂肪，暴露颈总动脉。
- 剪断小鼠的下腔静脉，使血液从闭合循环系统中流出。
- 用注射器将20 mL预冷的灌注液缓慢且持续地注入左心室。
注意：若灌注成功，富含血液的器官（如肝脏、脾脏和肾脏）将变为灰白色。 - 在体视显微镜下，使用显微解剖剪小心剥离颈总动脉周围的全部脂肪和结缔组织。
注意：此步骤应缓慢且谨慎进行，以防止损伤颈总动脉。 - 将颈总动脉从小鼠体内分离出来，用1×PBS冲洗以再次清除血液，然后转移至置于冰上的六孔板中，六孔板内含有1.5% FBS。
4. 将颈动脉消化成单细胞悬液
- 使用显微解剖剪纵向解剖颈动脉，并将其平铺于另一六孔细胞培养板中，该培养板内含1 mL 1.5% FBS，并置于冰上。
- 用1.5% FBS小心冲洗内膜，以去除残留血液。
注意：冲洗应轻柔缓慢，避免损伤内皮细胞。 - 在1.5% FBS中，使用显微解剖剪将每根颈动脉切成约2 mm2的组织小块。
- 使用1 mL宽口吸头将这些组织块转移至1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，使组织沉降至管底。
- 弃去上清液，将组织沉淀重悬于500 µL解离试剂A中。
- 将离心管置于37 °C水浴中孵育1小时，每隔10分钟用1 mL移液器轻轻吹打一次。
- 向管中加入500 µL 5% FBS，用1 mL移液器充分混匀。
- 将细胞悬液通过40 µm无菌细胞滤网过滤至新的1.5 mL离心管中，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
- 小心移除上清液，将细胞沉淀重悬于200 µL解离试剂B中。
- 置于37 °C水浴中继续消化5分钟。消化期间每隔2分钟轻轻吹打一次，以充分解离成单细胞悬液。
- 加入200 µL 5% FBS终止消化反应，在4 °C条件下以400 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀在冰上用100 µL 1× PBS重悬。
5. 细胞悬液检查与单细胞RNA测序
- 向10 µL单细胞悬液中加入10 µL AO/PI溶液，用20 µL移液器轻轻混匀。
- 将20 µL混合液加入计数板腔室中，静置1分钟。
- 将计数板载入自动细胞计数仪中。
- 选择AO/PI细胞活性检测程序，然后等待质量报告。
- 使用单细胞3ʹ试剂盒，在单细胞控制器上生成单细胞乳化凝胶微珠，并按照制造商说明书在PCR仪中扩增带条形码的cDNA。
注意：本实验使用的是Chromium单细胞3ʹ试剂盒v3版本。 - 在测序仪上采用双端150 bp（PE150）读长策略进行测序。使用软件应用（Cell Ranger）通过mkfastq流程将原始碱基识别文件转换为fastq文件。然后，使用Cell Ranger的Count Pipeline流程进行序列比对、过滤、条形码计数以及唯一分子标识符（UMI）计数，以生成特征-条形码矩阵13。
- 使用R软件包Seurat进行数据降维与可视化14。
- 首先，Seurat的Read10X()函数读取Cell Ranger流程的输出结果，并利用计数矩阵创建Seurat对象。然后，通过Seurat的subset()函数筛选出表达基因数少于<200或大于>4000，或线粒体基因比例超过10%的细胞予以剔除。
- 使用NormalizeData()和FindVariableFeatures()函数分别对数据进行标准化处理，并识别2000个高度可变的特征基因。
- 对标准化后的数据进行主成分分析（PCA），设置维度dims = 30、聚类分辨率resolution = 0.5进行细胞聚类。最后，使用RunUMAP()函数对单细胞数据集进行可视化，并使用FindAllMarkers()函数识别各细胞簇的生物标志物。
结果
本方案描述了一种用于制备小鼠颈动脉单细胞悬液的两步细胞消化法（图1）。该两步细胞消化法结合使用胶原酶/DN酶与胰蛋白酶，可有效解离小鼠颈动脉血管壁，获得适用于单细胞测序的高质量单细胞悬液。消化完成后，使用自动细胞计数仪测定细胞浓度和细胞活力。明场图像显示了消化后颈动脉血管细胞的形态，AOPI双荧光染色则同时检测了细胞活力（图2A、B）。值得注意的是，与单独使用解离试剂A相比，联合使用解离试剂B可更彻底地解离颈动脉组织。我们进一步统计了九条动脉的活细胞数量，结果显示经两步消化后，平均细胞直径满足单细胞测序的要求（图2C）。同时，从九条左侧颈动脉中共收集到176,000个单细胞，大多数血管组织被解离为单个细胞，且细胞活力较高（图2C）。
在完成比对、过滤、条形码计数和UMI计数后，使用R软件包Seurat对单细胞测序的原始数据进行分析。每个细胞中的基因分布、每个细胞中的UMI分布以及每个细胞中的线粒体读段分布以小提琴图展示（图3A-C）。值得注意的是，在每根颈动脉细胞中，每个细胞平均检测到约2500个转录本。在去除低质量细胞后，共检测到14,580个细胞，并用于后续的单细胞RNA测序分析。基于2000个表达模式相似的可变基因，采用无监督的Seurat聚类方法，在正常小鼠颈动脉消化后鉴定出四种主要细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs，74.0%）、成纤维细胞（16.5%）、内皮细胞（ECs，6.5%）以及巨噬细胞/树突状细胞（Mφ/DCs，3.0%）（图3D-F）。
图1：小鼠颈动脉消化的示意图。 在分离并剪切小鼠颈动脉后，加入500 µL解离试剂A以解离小鼠颈动脉组织。当细胞悬液经过过滤和离心后，加入200 µL解离试剂B进行进一步解离，以获得单细胞悬液。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：从小鼠颈动脉制备单细胞悬液。（A）使用解离试剂A消化1小时后，颈动脉细胞的细胞形态和细胞活性在明场图像和AOPI染色中显示。被绿色荧光染色的有核细胞为活细胞，而被红色荧光染色的为死细胞。比例尺 = 100 µm。（B）经两步消化法处理后，颈动脉细胞的细胞形态和细胞活性在明场图像和AOPI染色中显示。被绿色荧光染色的有核细胞为活细胞，而被红色荧光染色的为死细胞。比例尺 = 100 µm。（C）在两步消化法后测定了细胞活性、总细胞数、活细胞数和平均细胞直径。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：单细胞RNA测序（scRNA-seq）的标准质控（QC）指标及颈动脉的细胞图谱。（A）小提琴图显示每个细胞检测到的基因数（nFeature RNA）的分布情况；（B）每个细胞的UMI数（nCount_RNA）；（C）每个细胞的线粒体读段比例（percent mt），以上均为scRNA-seq数据结果。（D）均匀流形近似与投影（UMAP）图，展示颈动脉中鉴定出的四种细胞类型。（E）点图显示定义图D中各细胞簇的标志基因。每个圆点的大小表示表达相应转录本的细胞在该群体中的比例。蓝色圆点表示高表达基因，灰色圆点表示低表达基因。（F）堆叠条形图显示通过野生型小鼠（WT）scRNA-seq检测到的四种细胞类型的相对丰度。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
本文提供了一种从野生型小鼠颈动脉制备高质量单细胞悬液的详细方案，该方案建立了整合胶原酶/DNase与胰蛋白酶消化步骤的两步消化法。在对单细胞悬液进行质量检测后发现，细胞活力超过85%，细胞浓度高，满足单细胞测序的要求。此外，经过单细胞数据处理后，成功检测到颈动脉中的多种细胞类型，包括血管平滑肌细胞（VSMCs）、成纤维细胞、内皮细胞（ECs）以及巨噬细胞/树突状细胞（Mφ/DCs）。
目前制备颈动脉单细胞悬液的方法仍然较少。Depuydt 等人通过在 37 °C 下联合使用胶原酶、DNase、人血清白蛋白 V 级、Flavopiridol 处理 30 分钟，从人颈动脉斑块中获得了单细胞悬液15。经过荧光激活细胞分选后，他们鉴定出 14 种不同的细胞群，包括内皮细胞、平滑肌细胞、肥大细胞、B 细胞、髓系细胞和 T 细胞15。此外，研究人员使用 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和 0.1% 胶原酶在 37 °C 下消化大鼠颈总动脉，并成功进行了单细胞 RNA 测序16。在正常和实验性颈动脉中均鉴定出五种细胞类型，包括 VSMCs、成纤维细胞、ECs、过渡态细胞和巨噬细胞16。另外，已有研究建立了获取颈动脉内皮细胞富集的单细胞制备物的方案17。完成管腔内酶消化后，通过冲洗颈动脉可获得足量的单细胞沉淀，用于 scRNAseq 和 scATACseq 分析17。为了灵活控制消化时间，我们开发了一种两步消化法用于小鼠颈动脉，将组织解离与单细胞悬液制备步骤分开。该过程首先使用 125 CDU/mL 胶原酶 II 和 60 U/mL DNase I 消化 1 小时，随后用无 EDTA 的胰蛋白酶处理 5 分钟。值得注意的是，我们可以根据血管组织的特性，对该方法的任一步骤进行适当调整，以适用于其他血管组织的消化。
所述方法存在一些局限性。首先，我们尚不清楚该方法是否可用于原代细胞培养 体外由于颈动脉管壁较薄且细胞数量较少，如何进行培养和扩增 体外 具有挑战性。其次，与其他消化方法不同，本方案在消化过程中需要轻柔吹打以解离细胞；也可使用摇动水浴获得高质量的单细胞悬液。第三，由于本方法适用于正常颈动脉组织，其是否适用于颈动脉斑块的消化仍有待研究。
综上所述，我们设计了一种两步消化法，以从野生型小鼠的颈动脉中获得高质量的单细胞悬液。该方案经过少量修改后也可用于制备其他血管的单细胞悬液，因此在心血管研究中具有重要应用价值。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82070450，资助对象：C.T.；项目编号：82170466，资助对象：L.Z.）以及中国博士后科学基金博士后资助项目（项目编号：7121102223，资助对象：F.L.）的支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 无EDTA胰蛋白酶 | Beyotime | C0205 | 将1 mL 0.25% 无EDTA胰蛋白酶用1 mL 1× PBS稀释。 |
| 0.9% NaCl生理盐水溶液 | Beyotime | ST341 | 将肝素钠溶液稀释至终浓度为10 mg/mL |
| 1 mL注射器 | SKJYLEAN | sk-r009 | 用于心脏灌注 |
| 1.5 mL离心管 | KIRGEN | KG2211W | 用于离心组织块和细胞悬液 |
| 20 mL注射器 | SKJYLEAN | sk-r013 | 用于心脏灌注 |
| 40 µm细胞筛 | JETBIOFIL | css010040 | 用于过滤未消化的组织碎片 |
| AO/PI试剂盒 | 恒瑞生物 | RE010212 | 用于鉴定细胞是否存活 |
| 自动细胞计数仪 | Countstar | Mira FL | 用于分析消化后的颈动脉血管细胞的形态及细胞活力 |
| Cell Ranger软件 | 10× Genomics | 3.0.2 | 用于处理Chromium单细胞RNA测序数据，并进行聚类和基因表达分析 |
| Chromium单细胞3'试剂盒v3 | 10× Genomics | 1000075 | 用于制备单细胞悬液的单细胞RNA测序文库 |
| 胶原酶II | Sigma-Aldrich | C6885 | 用HBSS稀释至终浓度为125 CDU/mL |
| 脱氧核糖核酸酶I | Worthington | LS002140 | 用HBSS稀释至终浓度为60 U/mL |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30088.03 | 用于终止消化反应 |
| Hank's平衡盐溶液 | Gibco | 14175095 | 室温保存 |
| 肝素钠盐 | Solarbio Life Science | H8060 | 用0.9% NaCl稀释至终浓度为10 mg/mL |
| 微量离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75002560 | 用于沉淀组织和细胞 |
| NovaSeq 6000 | Illumina | N/A | 测序仪 |
| 磷酸盐缓冲液 | Solarbio Life Science | P1000 | 用于心脏灌注和细胞重悬 |
| Seurat软件包-R | Satija实验室 | 3.1.2 | 用于进行单细胞RNA测序数据的降维、可视化及分析 |
| 六孔细胞培养板 | NEST | 703002 | 用于放置血管组织 |
| 水浴锅 | 精宏 | DK-S22 | 维持消化温度在37 °C |
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