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方法文章

建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

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DOI：

10.3791/65865

⸱

2023年9月15日

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Biomedical Engineering, University of California, Irvine

本文内容

摘要

本方案介绍了一种具有生理相关性的“器官芯片”肿瘤模型，可用于高效开展基础性和转化性人类癌症研究，推动药物筛选、疾病建模及个体化医学的发展，并详细描述了该模型的加载、维持和评估操作流程。

摘要

缺乏能够模拟实体瘤肿瘤微环境的经验证癌症模型 体外 仍是癌症临床前研究和治疗开发中的一个重大瓶颈。 为解决这一问题，我们开发了带血管化的微肿瘤（VMT），又称肿瘤芯片，这是一种可真实模拟复杂人类肿瘤微环境的微生理系统。该VMT形成 从头合成 在微流控平台上，通过多种人类细胞类型在动态生理流动条件下的共培养，构建出一种组织工程化微肿瘤。该微肿瘤结构包含一个活体灌注的血管网络，可像新形成的血管一样，为生长中的肿瘤团块提供支持。 体内重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤，这需要进行建模 体内 治疗递送与疗效的生理屏障。由于VMT平台具有光学透明性，可通过直接观察组织内荧光标记的细胞，实现对免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎所有类型的肿瘤均可适配于该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞可在VMT中生长并响应药物治疗，为真正实现个体化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这一创新性方法为研究肿瘤及药物反应开辟了新的可能性，为科研人员推进癌症研究提供了强有力的工具。

引言

癌症仍然是全球主要的健康问题之一，也是美国的第二大死因。仅在2023年，美国国家卫生统计中心预计美国将出现超过190万例新发癌症病例和超过60万例癌症死亡病例1，凸显出对有效治疗策略的迫切需求。然而，目前进入临床试验的抗癌药物中，仅有5.1%最终获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。有前景的候选药物在临床试验中失败的部分原因在于临床前药物研发阶段使用了非生理性的模型系统，例如二维（2D）和类球体培养系统2。这些传统癌症模型缺乏肿瘤微环境中的关键组分，如间质生态位、相关免疫细胞以及灌注性血管系统，而这些因素正是决定治疗耐药性和疾病进展的关键。因此，亟需建立一种能够更真实模拟人体in vivo肿瘤微环境的新型模型系统，以提高临床前研究成果向临床应用转化的成功率。

组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了更先进的方法。其中一项重要进展是微生理系统（microphysiological systems, MPS）的出现，这类系统也被称为器官芯片或组织芯片，是能够模拟健康或疾病状态的功能性微型人体器官3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片作为一种基于三维微流控技术的体外（in vitro）人源肿瘤模型，已被开发用于肿瘤学研究2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13。这些先进的模型整合了动态肿瘤微环境中的生化与生物物理信号，使研究人员能够在更接近生理条件的情境下研究肿瘤行为及其对治疗的反应。然而，尽管已有诸多进展，目前仍仅有少数研究团队成功构建出具有活性且功能完整的血管系统，尤其是能够在生理流体剪切力作用下自发形成结构的血管网络3,4,5,6。引入功能性血管网络至关重要，因为它可模拟影响药物或细胞递送的物理屏障，实现不同微环境中细胞的归巢行为，以及肿瘤细胞、基质细胞和免疫细胞的跨内皮迁移过程。通过整合这一特征，肿瘤芯片能够更真实地再现体内（in vivo）肿瘤微环境中所观察到的复杂性。

为解决这一尚未满足的需求，我们开发了一种新型药物筛选平台，可在微流控装置内实现微血管网络的形成8,9,10,11,12,13,14,15,16该基础器官芯片平台被称为血管化微器官（VMO），可适用于几乎任何器官系统，以模拟原始组织的生理特性，用于疾病建模、药物筛选和个性化医疗应用。VMO通过在腔室内共培养内皮集落形成细胞来源的内皮细胞（ECFC-EC）、HUVEC或iPSC-EC（以下统称EC）以及多种间质细胞建立，其中包括可重塑基质的正常人肺成纤维细胞（NHLF）和包裹并稳定血管的周细胞。此外，VMO还可通过将肿瘤细胞与相关间质细胞共培养，构建血管化微肿瘤（VMT），从而建立癌症模型系统。8,9,10,11,12,13，或称肿瘤芯片模型。通过在动态流动环境中共培养多种细胞类型，可形成灌注的微血管网络 从头合成 在装置的组织腔室中，血管发生过程受到间质流速的严格调控14,15培养基通过流体静压差驱动流经装置的微流控通道，仅通过微血管为组织腔周围的细胞提供营养，其通透性系数为1.2 × 10-7 cm/s，与毛细血管中观察到的情况相似 体内8.

将自组织微血管整合到VMT模型中代表了一项重大突破，因为它：1）模拟了血管化肿瘤组织的结构与功能 体内；2）可模拟转移的关键步骤，包括肿瘤-内皮细胞及基质细胞间的相互作用；3）构建具有生理选择性的屏障，用于调控营养物质和药物递送，从而提升药物筛选效果；4）可直接评估具有抗血管生成和抗转移能力的药物。通过模拟 体内 在复杂的三维微环境中实现营养物质、药物和免疫细胞的递送，VMO/VMT 平台是一种具有生理相关性的模型，可用于药物筛选以及癌症、血管或器官特异性生物学的研究。重要的是，VMT 支持多种类型肿瘤的生长，包括结肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、胶质母细胞瘤、肺癌、腹膜癌病、卵巢癌和胰腺癌8,9,10,11,12,13除了成本低、易于建立并适用于高通量实验外，该微流控平台还完全兼容光学成像，可用于实时分析肿瘤-间质相互作用及其对刺激或治疗药物的响应。系统中每种细胞类型均标记有不同荧光标记物，从而可在整个实验过程中直接可视化并追踪细胞行为，为动态肿瘤微环境提供了一个观察窗口。我们先前已证明，VMT 能更真实地模拟 体内 肿瘤生长、结构、异质性、基因表达特征以及药物反应，优于标准培养方式10重要的是，VMT 支持患者来源细胞（包括癌细胞）的生长与研究，相较于标准的球状体培养，能更真实地模拟原发肿瘤的病理特征，并进一步推动个体化医疗的发展11本文概述了建立VMT的方法，展示了其在人类癌症研究中的应用价值。

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方案

1. 设计与制备

  1. 装置设计
    1. 用于微流控装置的制备，首先在经RCA-1清洗并用2%氢氟酸（HF）处理的硅片上旋涂一层200 µm厚的SU-8光刻胶，通过单掩模光刻步骤制备SU-8模具，具体方法如前所述8,9。
    2. 利用SU-8模具浇铸一个4 mm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制品，以制备用于后续制备步骤的耐用聚氨酯模具。可采用多种设计迭代方案8,9,10,11,12,13,14,15。
    3. 在当前版本中，将微流控装置设计为可定制适配标准96孔板格式，包含一个2 mm厚的PDMS功能层，底部由一层薄（1/16英寸）透明聚合物膜封闭，内含12个微流控装置单元（图1A）。
    4. 确保每个独立的组织单元由一个组织腔室构成，两侧分别设有凝胶加样入口（L1）和出口（L2）、压力调节器（PR）16，以及去耦合的微流控通道，每侧连接两个培养基入口和出口（M1-M2，M3-M4；图1B）。
    5. 将每个入口和出口置于同一个孔内，该孔作为培养基储液池，以在微流控通道上建立10 mm H2O的静水压力。为允许血管网络与外部通道发生吻合，通过顶部和底部各6个、宽50 µm的连通孔将微流控通道与组织腔室连接。
      注：微流控电阻器在组织腔室两侧形成5 mm H2O的间质压力梯度，当血管网络完全形成后，该梯度将转变为管腔内压力8,10。后续操作从一个完全组装好的高通量板开始。

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图1. 微流控平台设计。 （A）平台组装示意图显示了PDMS结构层，其包含12个器件单元，键合在一个无底的96孔板上，并用一层薄的透明聚合物膜密封。每个器件单元占据板上的一个列孔。红色轮廓标出的单个器件单元在（B）中展示其细节。（B）单个器件单元的示意图显示，一个组织腔室位于96孔板的一个孔内，两个加样口带有进样和出样孔（L1-L2），打孔以便引入细胞-基质混合物。培养基进样和出样口（M1-M2，M3-M4）也经过打孔处理，并位于作为培养基储液池的孔内。不同体积的培养基通过解耦的微流控通道在组织腔室两侧建立静水压梯度。压力调节器（PR）单元作为凝胶破裂阀，以方便加样操作。注意该器件深度为200 µm，组织腔室尺寸为2 mm × 6 mm。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 上样前的准备工作

  1. 细胞培养
    1. 根据制造商的建议，在37 °C、5% CO2的加湿培养箱中培养细胞。
    2. 在接种前3-4天，将转导过的EC、NHLF或其他成纤维细胞/基质细胞以及目标癌细胞以制造商和用户方案推荐的密度接种于T75培养瓶中。本方案中，每种细胞类型每瓶接种1 × 106个细胞。EC使用完全内皮细胞生长培养基2（EGM2），NHLF使用含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），癌细胞则根据细胞类型使用相应的培养基进行培养。
    3. 每2-3天更换相应培养基进行传代培养，并通过荧光显微镜观察细胞以重新确认转导或标记效率。接种当天，确保EC融合度达到80%-100%，而NHLF融合度为70%-80%，处于亚融合状态。
  2. 纤维蛋白原的制备
    1. 根据纤维蛋白原的凝固百分比，将其配制成所需浓度（通常5-8 mg/mL的浓度可支持稳定的血管网络形成）。使用以下公式计算所需纤维蛋白原的量：
      纤维蛋白原（mg）= [体积（mL）× 浓度（mg/mL）] /（凝固百分比）
    2. 将纤维蛋白原溶于适量预热至37 °C的内皮细胞基础培养基2（EBM2）中，通过轻轻弹击离心管使其溶解（切勿涡旋震荡）。将纤维蛋白原置于37 °C水浴中孵育，使其完全溶解。重要提示：请勿使用完全培养基。
    3. 使用0.22 µm滤器对纤维蛋白原溶液进行无菌过滤，并分装为所需体积，通常每管400 µL。
      ​注意：其他基质蛋白（如胶原蛋白、纤连蛋白或层粘连蛋白）可添加至纤维蛋白原混合液中。

3. 上样

注意：加载过程对时间敏感，应从开始（细胞剥离）到结束（向装置中加入培养基）在约1.5–1.75小时内完成，以确保最佳结果。每个步骤均标注了建议的计时器，以帮助用户保持操作进度。

  1. 材料准备（上样当天）
    1. 将以下试剂置于 37 °C 水浴中 10–15 分钟：用于洗涤细胞的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）或磷酸盐缓冲液（PBS）、细胞解离试剂、培养基（例如 EGM2、DMEM）
    2. 将以下试剂在使用前保存于 4 °C 冰箱中：凝血酶、层粘连蛋白（于 4 °C 过夜解冻）
    3. 在室温下解冻纤维蛋白原分装液。将凝血酶按每设备单元 1.5 µL 分装至 500 µL 微离心管中，确保凝血酶分装液位于每根管底，以便于上样
    4. 将经紫外灭菌的高通量板在上样前至少放入干燥器中 30 分钟，以去除微流控芯片中滞留的空气
  2. 细胞准备（计时开始 = 0 分钟）
    1. 在显微镜下以 4 倍物镜检查细胞，确认汇合度和转导效率
    2. 用 5 mL HBSS 洗涤每个 T75 培养瓶中的细胞两次，并完全吸除。每瓶加入 1 mL 解离试剂，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1–2 分钟
    3. 用手掌轻拍培养瓶，检查所有细胞是否均已脱落
    4. 用 9 mL 适当培养基将细胞从培养瓶中冲洗下来，并收集至 15 mL 锥形管中。立即取少量样品用于细胞计数
    5. 在 4 °C 下以 300 × g 离心 3–5 分钟。离心期间进行细胞计数。一个汇合的 EC 或 NHLF T75 培养瓶应至少获得 2 × 106 个细胞
    6. 离心后吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于适当培养基中，浓度为 1 × 106 个细胞/mL。将细胞置于冰上保存
  3. 细胞与纤维蛋白原混合液的制备（计时 = 20 分钟）
    1. 确定需上样的设备数量，额外增加 1–2 个以补偿移液损失，再乘以每个设备所需的细胞/纤维蛋白原混合液体积。具体体积取决于设备构型，但本文所述设备设计中每个设备需 6 µL
    2. 每种细胞类型的浓度应通过实验确定。作为起始参考，内皮细胞（EC）浓度约为 7 × 106 个细胞/mL，正常人肺成纤维细胞（NHLF）浓度为 3.5 × 106 个细胞/mL。癌细胞浓度因其生长速率差异较大，通常在 0.5–2 × 106 个细胞/mL 范围内。使用以下公式计算所需细胞数量：
      所需细胞数 = （纤维蛋白体积（µL））/1000 µL × （细胞浓度）
    3. 将细胞重悬至 1 × 106 个细胞/mL 的浓度，并使用以下公式计算所需细胞体积：
      所需细胞体积（µL）= 所需细胞数 / 1000
    4. 在锥形管中混合相应体积的 EC、NHLF 和癌细胞（仅用于 VMT），并在 4 °C 下以 300 × g 离心 3–5 分钟
    5. 离心后，小心吸除上清液，并用移液器去除沉淀附近残留的液体。轻柔但充分地将沉淀重悬于计算体积的纤维蛋白原中，特别注意避免引入气泡。将混合液置于冰上保存
    6. 将灭菌的培养板和凝血酶分装液移入组织培养超净台
  4. 设备上样（计时 = 30–35 分钟）
    1. 使用 P20 移液器吸取 6 µL 细胞/纤维蛋白混合液。务必上下吹打至少 5 次，确保细胞均匀悬浮。将混合液置于冰上以减缓凝固
    2. 将移液器吸头直接插入管底的凝血酶分装液中，轻柔混合细胞/纤维蛋白混合液。立即上下吹打至少 2 次，注意避免引入气泡。纤维蛋白一旦与凝血酶混合即开始凝固，因此需迅速而有条不紊地完成步骤 3.4.3 和 3.4.4，以免纤维蛋白在移液器吸头内凝胶化（约 3 秒）
    3. 将高通量板倾斜，迅速将移液器吸头插入设备的上样口之一（L1 或 L2）。示意图见 图 2A
    4. 平稳流畅地将移液器推杆压至第一停点，将细胞/纤维蛋白混合液注入组织腔室。观察凝胶是否完全穿过腔室。
      注意：此步骤中施加过大压力可能导致凝胶破裂并进入组织腔室上方和/或下方的微流控通道
    5. 在不拔出移液器吸头、不释放推杆或扰动移液器的情况下，轻柔地将培养板放回水平位置。用手扭转并拔出 P20 的吸头，将其留在上样口孔中。切勿使用弹射按钮移除吸头，以免产生过大压力
    6. 对剩余设备重复执行步骤 3.4.1–3.4.5
    7. 上样完成后，将培养板在组织培养超净台中静置 2 分钟，避免扰动
    8. 通过轻柔扭转并拉出的方式移除移液器吸头。盖上培养板盖
    9. 将整个培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 15–20 分钟，使凝胶充分聚合
    10. 孵育后，在显微镜下检查每个设备单元。确认细胞在腔室内均匀分布且无气泡，同时组织腔室与微流控通道之间存在清晰可见的凝胶界面，如 图 2B-C 所示
  5. 微流控通道的层粘连蛋白包被（计时 = 45–50 分钟）
    1. 待凝胶完全固化后，向微流控通道中引入层粘连蛋白，以促进血管吻合
    2. 使用 P20 移液器，向设备的每个微流控通道（上、下）加入 4 µL 层粘连蛋白。将吸头插入 M1 或 M3，缓慢排出层粘连蛋白，确保其完全覆盖上通道；然后对 M2 或 M4 重复操作，以包被整个下通道
    3. 通过从压力调节器相反一侧进行移液来确定方向，以提供足够压力推动液体通过。若层粘连蛋白难以从一侧通过，可从该侧移出吸头，改从另一侧推动。可能需要将移液器推至第二停点（即完全压下推杆）以产生足够压力，使层粘连蛋白完全通过通道
    4. 轻柔地从培养基进/出口移出吸头。切勿使用 P20 的弹射按钮
    5. 对每个设备重复步骤 3.5.1–3.5.4，并将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 10 分钟
  6. 培养基添加（计时 = 约 1 小时 10 分钟）
    1. 向 A 和 B 行或 G 和 H 行中未连接的培养基储液池加入 275 µL 完全 EGM2 培养基。此侧为高体积侧，方向应设定为使压力调节器对侧的孔为高体积起始端。培养基将通过重力从高体积侧推动流动
    2. 使用 P200 移液器，向含有 275 µL EGM2 的孔的培养基进/出口加入 75 µL 培养基。将吸头插入培养基进样孔，缓慢排出培养基，观察其是否通过通道并在另一侧冒出气泡
    3. 移出移液器吸头，并将吸头中剩余培养基推入储液池，使高体积侧总体积达到 350 µL
    4. 对每个设备单元的上、下通道重复步骤 3.6.1–3.6.3
    5. 向低体积侧（A 和 B 行或 G 和 H 行，具体取决于上述方向）加入 50 µL 培养基，完全覆盖该侧。确保培养基在孔底部形成均匀覆盖层。参见 图 2D 中关于储液池内培养基体积的示意图
  7. 去除气泡（上样后）
    注意：去除气泡是确保每个设备正常流动的关键步骤。到第 2 天，内皮细胞和成纤维细胞将在流动刺激下开始伸展（图 2E）
    1. 所有培养基添加完毕后，将培养板在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1–2 小时，然后检查通道或培养基进/出口是否存在气泡
    2. 在显微镜下观察培养基通道中的气泡，并通过向通道中重新加入 75 µL 培养基将气泡推出
    3. 肉眼观察培养基进/出口处的气泡。使用 P200 移液器去除滞留在培养基进/出口的气泡：压下推杆，将吸头插入孔中，然后提起推杆施加负压，将气泡吸出

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图 2．装置加样示意图。（A）使用 P20 移液枪，通过其中一个加样口将细胞/纤维蛋白混合物加入每个装置单元的组织腔中。（B）明场显微图像显示已加载内皮细胞（EC）、成纤维细胞和癌细胞以形成血管化肿瘤模型（VMT）的微流控装置。比例尺 = 500 µm。（C）B 图装置的荧光显微图像，显示内皮细胞为红色，肿瘤为青色，成纤维细胞为蓝色。（D）示意图显示向储液池中加入培养基，高侧加入 350 µL，低侧加入 50 µL，以形成静水压差。（E）VMT 培养第 2 天，可见成纤维细胞和内皮细胞开始伸展，形成血管网络。比例尺 = 200 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 设备维护与实验应用

  1. 维持与药物处理
    注意：为保持系统内的流体流动，必须每天通过移液将低压侧的培养基体积重新移回高压侧，或反向操作，以确保高压侧的总体积保持在 350 µL。在血管微组织（VMO）或血管微通道（VMT）建立后的第 2 天起，每天切换一次流动方向。以下提供进一步的维护与处理细节。
    1. 每隔一天更换一次 EGM2 完全培养基，直至血管结构完全建立（第 5–6 天）。完全吸除旧培养基，并分别向高压侧孔（350 µL）和低压侧孔（50 µL）补充新鲜培养基。
      注意：针对其他细胞类型，可实验优化培养基配方，通常涉及使用 50:50 混合比例或向 EGM2 中添加特定组分。
    2. 当血管网络形成且组织完全发育后（第 4–7 天），在将装置用于实验前进行葡聚糖灌注测试（步骤 4.2.1）。仅使用那些组织腔内灌注充分的装置。
    3. 对于使用治疗药物的实验，在开始治疗当天，对每个装置在所有荧光通道中拍摄图像，作为基线数据。
    4. 通过将培养基替换为含有稀释至目标浓度药物的新鲜培养基，对装置进行药物处理。确保根据制造商建议使用适当的溶剂稀释药物，但培养基中 DMSO 浓度不得超过 0.01%。
    5. 使装置暴露于药物中指定时间（通常为 48 小时，也可依据药代动力学确定）。
    6. 在指定时间间隔对每个装置的所有通道成像，以监测治疗反应。实验期间按照步骤 4.1.1 所述维持培养板。
    7. 实验结束后，将培养板漂白并置于生物危害容器中，或使用 4% 多聚甲醛（PFA）固定以进行免疫荧光染色（步骤 4.3），或收获样本用于活细胞或 RNA 提取（步骤 4.4）。
  2. 灌注实验
    1. 葡聚糖灌注
      注意：可通过向血管网络灌注不同分子量（40 kD、70 kD 或 150 kD）的荧光标记葡聚糖来评估血管通透性/通畅性。根据内皮细胞（EC）的荧光标记选择 FITC-葡聚糖或罗丹明-葡聚糖。
      1. 灌注前，通过在空装置的流体通道或腔室中加入几 µL 葡聚糖，确定 FITC 或罗丹明通道的合适曝光参数。利用显微镜软件显示像素强度直方图，将曝光时间设置在接近但低于饱和水平，确保动态范围内像素均匀分布，无明显高强度值聚集。
      2. 对所有装置在目标通道中拍摄显微图像，包括在荧光葡聚糖通道中拍摄所有装置的背景图像，用于背景校正。使用上述确定的相同曝光参数，并将组织腔室置于图像帧中央，以确保定量分析时图像一致性。
      3. 用 1× DPBS 配制浓度为 5 mg/mL 的 FITC-葡聚糖或罗丹明-葡聚糖主溶液。该溶液可保存于 4 °C。
      4. 配制工作液时，将 5 mg/mL 储备液用 EGM2 稀释至终浓度 50 µg/mL。
      5. 将稀释后的葡聚糖溶液以半最大体积（175 µL）加入组织腔室顶部或底部通道的一侧高压孔中，替换储液池中的培养基。另一侧高压孔加入 175 µL 不含葡聚糖的新鲜 EGM2，低压侧各孔仅保留 50 µL。
        注意：葡聚糖仅应加入微流控通道的一侧（顶部或底部），以便观察染料从高压侧流入血管床，再从低压侧流出的过程。
      6. 在显微镜下观察荧光葡聚糖流经血管网络的情况。通常在向储液池加入染料后约 2 分钟内即可观察到。
      7. 开始对荧光葡聚糖通道（及其他所需通道）进行成像，记为 T = 0 时间点。随后在多个时间点（通常每 10 分钟）或单个终点时间点继续成像。
    2. 细胞灌注
      注意：根据研究设计，可将多种细胞类型灌注通过血管系统，例如癌症免疫学研究中的淋巴细胞或巨噬细胞，以及转移研究中的癌细胞。细胞必须进行荧光标记，以便随时间追踪。
      1. 在进行细胞灌注前至少 2 小时，按上述方法对所有装置进行葡聚糖灌注。此步骤对于在加细胞前确认血管通畅性至关重要。
      2. 确定待灌注细胞的合适相机曝光参数。取少量细胞样本在显微镜下观察，并为该荧光标记设置曝光时间，使其略低于饱和水平。
      3. 对所有装置在目标通道中拍摄显微图像，包括在荧光葡聚糖通道中拍摄所有装置的背景图像，用于背景校正。使用步骤 4.2.2.1 中确定的相同曝光参数。
      4. 在收获用于灌注的细胞前，确认葡聚糖已完全从组织腔室中扩散出去。收获并计数目标细胞。
      5. 将细胞以适当密度重悬于 EGM2 中。例如，T 细胞通常以约 1 × 106 个细胞/mL 的浓度添加，以模拟血液中的浓度。
        注意：内皮细胞对培养基成分敏感，但可耐受与其他大多数培养基最多 50% 的混合。建议预先测试。
      6. 向每个装置的高压侧一个孔中加入 175 µL 细胞悬液，向另一孔中加入 175 µL 完全 EGM2。在低压侧，两个孔均加入 50 µL 完全 EGM2 培养基。
      7. 在显微镜下观察荧光细胞流经血管网络的情况。通常在向储液池加入细胞后约 2 分钟内即可观察到。
      8. 一旦细胞流动建立，开始对荧光细胞通道（及其他所需通道）进行成像，记为 T = 0 时间点。根据研究设计，在多个时间点或单个终点时间点继续成像。例如，每 10 分钟成像可获得高分辨率时间序列，而每 6–12 小时成像可用于追踪周期性细胞运动。
  3. 免疫荧光（IF）染色
    1. 吸除各孔中的培养基。向每个装置单元高压侧的两个孔各加入 200 µL 4% PFA，低压侧加入 50 µL。室温下作用 15 分钟，或 4 °C 下作用 30 分钟，使 PFA 流经腔室。
    2. 孵育期间，准备一个 24 孔板，每孔加入 500 µL 1× PBS。计算染色所需孔数。
    3. 完全吸除 PFA。将培养板倒置，小心移除膜上的塑料背衬。
      注意：也可在不移除膜和装置的情况下原位（in situ）进行免疫荧光染色。为此，通过 VMO/VMT 灌注试剂完成染色步骤，并将每个孵育步骤的持续时间延长约 6 倍。
    4. 轻轻且小心地抓住膜两端角，缓慢平稳向下拉动，将底部膜层从装置的功能层上剥离，以暴露组织腔室。大部分组织应保留在组织腔室内。请参见 图 3A。
    5. 使用刀片或手术刀施加足够力量，完全切穿功能层，并在每个独立装置单元周围切割出一个小矩形，如 图 3B 所示。
    6. 将刮刀插入功能层与培养板之间，轻轻施压于功能层下方，小心地将包含组织腔室的整个功能层从培养板上取下。
    7. 将每个含有组织面的矩形 PDMS 功能层倒置放入含 PBS 的单个孔中。
    8. 所有单元放入孔中后，将培养板置于轻柔摇床上，用 PBS 洗涤 5 分钟，吸除 PBS 并替换为 500 µL 新鲜 PBS。共洗涤 3 次。
    9. 吸除各孔中的 PBS，加入 500 µL 含 0.5% Triton-X 的 PBS，轻柔摇动下通透 2 次，每次 10 分钟。移除通透液。
    10. 每装置加入 500 µL 含 10% 血清的 0.1% Triton-X 溶液，室温轻柔摇动封闭 1 小时。
    11. 将一抗用含 3% 血清的 0.1% Triton-X 溶液稀释至所需浓度和体积。吸除封闭液，加入足量一抗溶液，完全覆盖各孔底部并允许装置组织自由移动（约 200 µL）。用透明封膜覆盖培养板。
    12. 4 °C 轻柔摇动孵育过夜。次日将含装置组织的培养板恢复至室温（约 15 分钟）。
    13. 吸除一抗溶液，用 500 µL PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，轻柔摇动。
    14. 每孔加入 200 µL 用含 3% 血清的 0.1% Triton-X 稀释的二抗溶液至所需浓度。避光、室温轻柔摇动孵育 1 小时。
    15. 吸除二抗溶液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，轻柔摇动。避光、轻柔摇动下加入含 1× DAPI 的 0.1% Triton-X 溶液，作用 10 分钟。
    16. 用镊子将含染色组织的矩形装置切片从培养板中取出，组织面向上放置于纸巾上。
    17. 直接在每个腔室和盖玻片上滴加几 µL（约 10 µL）抗荧光淬灭剂，注意避免产生气泡。将抗荧光淬灭剂在室温避光条件下静置过夜固化，然后进行成像。
  4. 用于分子检测的组织与细胞分离
    注意：每个高通量培养板将含有约 1–2 × 105 个细胞，具体数量取决于收获时间点。应根据总细胞数及收获过程中的潜在损失调整实验重复数量。
    1. 单细胞分析
      1. 吸除各孔中的培养基，将高通量培养板倒置，使装置层朝上。
      2. 移除膜上的塑料背衬。轻轻且小心地抓住两端角，缓慢平稳向下拉动，将 PDMS 底部膜从装置功能层上剥离，以暴露组织腔室。
      3. 即使粘合良好，膜也可被移除。移除膜后，大部分组织应保留在组织腔室内；若部分组织粘附于膜上，则在膜本身上执行以下步骤。
      4. 用 500 µL HBSS 或 PBS 洗涤每个装置单元。向每个装置单元加入 100 µL 解离试剂，使其以液滴形式停留在装置顶部。将培养板放回 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
      5. 消化后，使用 P200 移液器在组织腔室中反复吹打，收集组织至解离试剂中。在每个装置间来回移动移液器吸头，确保组织完全去除，并收集至含 500 µL EGM2 的 15 mL 锥形管中以中和解离试剂。
      6. 为完全去除组织腔室中残留的细胞，向每个装置单元加入 500 µL EGM2，并用 P200 移液器冲洗。
      7. 将含有解离组织的消化液在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟，沉淀单细胞和完整组织。
      8. 小心吸除上清液，向组织中加入 500 µL 含 1 mg/mL（200 U/mL）IV 型胶原酶、0.1 mg/mL V 型透明质酸酶和 200 U/mL IV 型 DNA 酶的 HBSS 溶液。
      9. 轻柔重悬后，室温静置 2 分钟，再次轻柔吹打以解离凝胶。
      10. 用 10 mL EGM2 洗涤消化混合物，在 4 °C 下以 300 × g 离心 5 分钟。将细胞重悬于含 1% BSA 或 HSA 的 1× DPBS 中，并通过预润湿的 70 µm 滤膜过滤，以 200 × g 离心 1 分钟。
      11. 计数细胞并调整体积，使最终浓度为每 µL 1000 个细胞。细胞悬液可进一步用于流式细胞分选（FACS）、流式细胞术或单细胞 RNA 测序。
    2. 从完整组织中提取 RNA
      1. 执行上述步骤 4.4.1.1 和 4.4.1.2。
      2. 向每个暴露的组织腔室中加入约 10 µL RNA 裂解缓冲液，确保液体直接覆盖在组织上。总 RNA 裂解缓冲液用量不得超过 100 µL。
      3. 室温孵育 3 分钟。使用 P20 移液器在每个装置单元上反复吹打，并在必要时用吸头刮取组织腔室中残留物质。
      4. 尽可能多地将裂解缓冲液转移至 1.5 mL 微离心管中。对剩余装置重复步骤 4.4.2.2–4.4.2.3，并将样本汇集至同一 1.5 mL 管中。
      5. 根据所用试剂盒或试剂，按照制造商说明进行 RNA 提取。

figure-protocol-3
图3．免疫染色用装置平台的准备。（A）完全组装好的装置平台示意图，顶部为膜层。去除膜时，应以稳定而轻柔的动作，依次向下拉扯外层的每个角落。（B）膜层完全移除后，使用刀片、解剖刀或刀具，在每个装置单元的组织腔周围切割出矩形区域，注意避免切割到组织本身。随后可将刮勺插入每个矩形下方，将其从板上分离，并将每个单元转移至含 PBS 的 24 孔板的单个孔中，用于染色。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

按照本文所述方案，使用购自商业渠道的内皮细胞（EC）、正常人肺成纤维细胞（NHLF）以及用于血管化肿瘤模型（VMT）的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 建立了血管化组织器官模型（VMO）和血管化肿瘤模型（VMT）。已建立的 VMO 还通过灌注癌细胞以模拟转移过程。在每种模型中，共培养第 5 天时，组织腔内因重力驱动的流动而自发形成血管网络，作为物质输送的通道 在体 如向基质微环境递送营养物质、治疗药物、癌细胞或免疫细胞图4）。VMOs 首先通过将标记 mCherry 的 EC 引入组织腔室建立，如图所示 图 4A （培养第0天），细胞分布均匀。在血管微器官（VMO）培养的第2天，内皮细胞开始伸展并形成管腔（图4B），到第4天，EC已与外部微流控通道吻合并形成连续的血管网络（图4C）在血管形成吻合并排列于外侧通道后，用70 kD的FITC-葡聚糖灌注VMO组织以确认血管通畅性（...

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讨论

人体几乎每一种组织都通过血管系统获取营养物质和氧气，因此血管系统在构建真实的疾病模型和药物筛选中具有关键作用 体外此外，多种恶性肿瘤和疾病状态均以血管内皮功能障碍和通透性增高为特征3值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关血管通常灌注不良、结构紊乱且具有通透性，从而成为治疗药物和免疫细胞向肿瘤递送的屏障。此外，血管系统还为癌细胞转移至远端组织提供了通道，并促进细胞间通讯，抑制免疫应答的同时进一步推动癌细胞的生长与扩散。这些现象凸显了血管微环境在治疗耐药性和癌症进展中的关键作用，也表明在临床前研究中准确模拟肿瘤微环境的必要性。然而，传统的 体外 现有的模型系统往往缺乏适当的间质和血管成分，或未能引入动态流动条件。为解决当前模型系统的这些不足，本文介绍了一种构建特征明确的微生理系统的方法，该系统可支持活体灌注人源微肿瘤（VMT）的形成，用于生理学肿瘤学研究。重要的是，VMT模型能够模拟肿瘤相关异常血管及肿瘤-间质相互作用的关键特征，因此非常适合用于仿生疾病建模和治疗效果评估10.

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披露

CCWH 对 Aracari Biosciences, Inc. 持有股权利益，该公司正在将本文所述技术的某一版本商业化。该安排的条款已由加利福尼亚大学尔湾分校根据其利益冲突政策进行审查并批准。不存在其他利益冲突。

致谢

我们感谢 Christopher Hughes 博士实验室成员对本文所述实验步骤提供的宝贵意见，同时感谢 Abraham Lee 博士实验室的合作者们在平台设计与制造方面给予的支持。本研究工作获得了以下资助项目的支持：UG3/UH3 TR002137、R61/R33 HL154307、1R01CA244571、1R01 HL149748、U54 CA217378（CCWH）和 TL1 TR001415 以及 W81XWH2110393（SJH）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>制备
(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，95% Sigma-Aldrich175617-100G
Greiner Bio-One μ透明底96孔聚苯乙烯微孔板Greiner Bio-One655096
甲醇 ≥99.8% ACSVWR 化学品 BDHBDH1135-1LP
MILTEX 无菌一次性活检穿孔器（带推杆），直径 1 mmIntegra Miltex33-31AA-P/25
PDMS 膜PAX IndustriesHT-6240
等离子清洗机 PDC-001Harrick PlasmaN/A
Smooth-Cast 385Smooth-OnN/A
SP Bel-Art 实验室伴侣透明聚碳酸酯柜式真空干燥器Bel-ArtF42400-4031
带冷凝环的标准盖，96孔板VWR82050-827
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）道4019862
<强>细胞培养/加样
BioTek Lionheart FX 全自动显微镜安捷伦 CYT5MFAW
CELLvo 人内皮祖细胞StemBioSysN/A
I型胶原，大鼠尾部Enzo Life Sciences
胶原酶来自 Clostridium histolyticum （4型）Sigma-AldrichC5138
康宁·汉克’不含钙和镁的1倍平衡盐溶液康宁21-021-CV
康宁 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基康宁10013CV
DAPISigma-AldrichD9542
不含钙、镁的DPBSGibco14190144
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKitLonzaCC-3162
牛血浆纤维蛋白原Neta ScientificSIAL-341573
人血浆纤维连接蛋白Sigma-AldrichF0895
异硫氰酸荧光素–葡聚糖（70kDa）Sigma-AldrichFD70S-1G
猪皮明胶Sigma-AldrichG1890
来自绵羊睾丸的透明质酸酶（4型）Sigma-AldrichH6254
小鼠层粘连蛋白Gibco23017015
Leica TCS SP8LeicaN/A
MDA-MB-231ATCCHTB-26
NHLF – 正常人肺成纤维细胞LonzaCC-2512
尼康 Eclipse TiNikonN/A
0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中含 4% 多聚甲醛电子显微镜科学公司 15735-90-1L
外周血单个核细胞（PBMCs）LonzaCC-2702
PBS，pH 7.4Gibco10010049
优质级胎牛血清（FBS），经热灭活Avantor Seradigm97068-091
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂InvitrogenP10144
Quick-RNA Microprep KitZymo ResearchR1051
牛血浆凝血酶Sigma-AldrichT4648
Triton X-100（电泳级），Fisher BioReagentsBP151-100
TrypLE Express 酶（1X），酚红Gibco12605028
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红Gibco25300062
VasculifeLifeline Cell TechnologyLL-0003

参考文献

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