建立一种用于癌症研究的生理性人源血管化微肿瘤模型

摘要

本方案介绍了一种具有生理相关性的“器官芯片”肿瘤模型，可用于高效开展基础性和转化性人类癌症研究，推动药物筛选、疾病建模及个体化医学的发展，并详细描述了该模型的加载、维持和评估操作流程。

摘要

缺乏能够模拟实体瘤肿瘤微环境的经验证癌症模型 体外 仍是癌症临床前研究和治疗开发中的一个重大瓶颈。 为解决这一问题，我们开发了带血管化的微肿瘤（VMT），又称肿瘤芯片，这是一种可真实模拟复杂人类肿瘤微环境的微生理系统。该VMT形成 从头合成 在微流控平台上，通过多种人类细胞类型在动态生理流动条件下的共培养，构建出一种组织工程化微肿瘤。该微肿瘤结构包含一个活体灌注的血管网络，可像新形成的血管一样，为生长中的肿瘤团块提供支持。 体内重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤，这需要进行建模 体内 治疗递送与疗效的生理屏障。由于VMT平台具有光学透明性，可通过直接观察组织内荧光标记的细胞，实现对免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎所有类型的肿瘤均可适配于该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞可在VMT中生长并响应药物治疗，为真正实现个体化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这一创新性方法为研究肿瘤及药物反应开辟了新的可能性，为科研人员推进癌症研究提供了强有力的工具。

引言

癌症仍然是全球主要的健康问题之一，也是美国的第二大死因。仅在2023年，美国国家卫生统计中心预计美国将出现超过190万例新发癌症病例和超过60万例癌症死亡病例¹，凸显出对有效治疗策略的迫切需求。然而，目前进入临床试验的抗癌药物中，仅有5.1%最终获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。有前景的候选药物在临床试验中失败的部分原因在于临床前药物研发阶段使用了非生理性的模型系统，例如二维（2D）和类球体培养系统²。这些传统癌症模型缺乏肿瘤微环境中的关键组分，如间质生态位、相关免疫细胞以及灌注性血管系统，而这些因素正是决定治疗耐药性和疾病进展的关键。因此，亟需建立一种能够更真实模拟人体in vivo肿瘤微环境的新型模型系统，以提高临床前研究成果向临床应用转化的成功率。

组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了更先进的方法。其中一项重要进展是微生理系统（microphysiological systems, MPS）的出现，这类系统也被称为器官芯片或组织芯片，是能够模拟健康或疾病状态的功能性微型人体器官^3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片作为一种基于三维微流控技术的体外（....

方案

1. 设计与制备

1. 装置设计
   1. 用于微流控装置的制备，首先在经RCA-1清洗并用2%氢氟酸（HF）处理的硅片上旋涂一层200 µm厚的SU-8光刻胶，通过单掩模光刻步骤制备SU-8模具，具体方法如前所述^8,9。
   2. 利用SU-8模具浇铸一个4 mm厚的聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制品，以制备用于后续制备步骤的耐用聚氨酯模具。可采用多种设计迭代方案^{8,9,10,11,12,13,14,15}。
   3. 在当前版本中，将微流控装置设计为可定制适配标准96孔板格式，包含一个2 mm厚的PDMS功能层，底部由一层薄（1/16英寸）透明聚合物膜封闭，内含12个微流控装置单元（

结果

按照本文所述方案，使用购自商业渠道的内皮细胞（EC）、正常人肺成纤维细胞（NHLF）以及用于血管化肿瘤模型（VMT）的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 建立了血管化组织器官模型（VMO）和血管化肿瘤模型（VMT）。已建立的 VMO 还通过灌注癌细胞以模拟转移过程。在每种模型中，共培养第 5 天时，组织腔内因重力驱动的流动而自发形成血管网络，作为物质输送的通道 在体 如向基质微环境递送营养物质、治疗药物、癌细胞或免疫细胞图4）。VMOs 首先通过将标记 mCherry 的 EC 引入组织腔室建立，如图所示 图 4A （培养第0天），细胞分布均匀。在血管微器官（VMO）培养的第2天，内皮细胞开始伸展并形成管腔（图4B），到第4天，EC已与外部微流控通道吻合并形成连续的血管网络（图4C）在血管形成吻合并排列于外侧通道后，用70 kD的FITC-葡聚糖灌注VMO组织以确认血管通畅性（.......

讨论

人体几乎每一种组织都通过血管系统获取营养物质和氧气，因此血管系统在构建真实的疾病模型和药物筛选中具有关键作用 体外此外，多种恶性肿瘤和疾病状态均以血管内皮功能障碍和通透性增高为特征³值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关血管通常灌注不良、结构紊乱且具有通透性，从而成为治疗药物和免疫细胞向肿瘤递送的屏障。此外，血管系统还为癌细胞转移至远端组织提供了通道，并促进细胞间通讯，抑制免疫应答的同时进一步推动癌细胞的生长与扩散。这些现象凸显了血管微环境在治疗耐药性和癌症进展中的关键作用，也表明在临床前研究中准确模拟肿瘤微环境的必要性。然而，传统的 体外 现有的模型系统往往缺乏适当的间质和血管成分，或未能引入动态流动条件。为解决当前模型系统的这些不足，本文介绍了一种构建特征明确的微生理系统的方法，该系统可支持活体灌注人源微肿瘤（VMT）的形成，用于生理学肿瘤学研究。重要的是，VMT模型能够模拟肿瘤相关异常血管及肿瘤-间质相互作用的关键特征，因此非常适合用于仿生疾病建模和治疗效果评估¹⁰.

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>制备
(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷，95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μ透明底96孔聚苯乙烯微孔板	Greiner Bio-One	655096
甲醇 ≥99.8% ACS	VWR 化学品 BDH	BDH1135-1LP
MILTEX 无菌一次性活检穿孔器（带推杆），直径 1 mm	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS 膜	PAX Industries	HT-6240
等离子清洗机 PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art 实验室伴侣透明聚碳酸酯柜式真空干燥器	Bel-Art	F42400-4031
带冷凝环的标准盖，96孔板	VWR	82050-827
SYLGARD 184 硅弹性体试剂盒（PDMS）	道	4019862
<强>细胞培养/加样
BioTek Lionheart FX 全自动显微镜	安捷伦	CYT5MFAW
CELLvo 人内皮祖细胞	StemBioSys	N/A
I型胶原，大鼠尾部	Enzo Life Sciences
胶原酶来自 Clostridium histolyticum （4型）	Sigma-Aldrich	C5138
康宁·汉克’不含钙和镁的1倍平衡盐溶液	康宁	21-021-CV
康宁 含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基	康宁	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
不含钙、镁的DPBS	Gibco	14190144
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
牛血浆纤维蛋白原	Neta Scientific	SIAL-341573
人血浆纤维连接蛋白	Sigma-Aldrich	F0895
异硫氰酸荧光素–葡聚糖（70kDa）	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
猪皮明胶	Sigma-Aldrich	G1890
来自绵羊睾丸的透明质酸酶（4型）	Sigma-Aldrich	H6254
小鼠层粘连蛋白	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – 正常人肺成纤维细胞	Lonza	CC-2512
尼康 Eclipse Ti	Nikon	N/A
0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）中含 4% 多聚甲醛	电子显微镜科学公司	15735-90-1L
外周血单个核细胞（PBMCs）	Lonza	CC-2702
PBS，pH 7.4	Gibco	10010049
优质级胎牛血清（FBS），经热灭活	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
牛血浆凝血酶	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100（电泳级），	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express 酶（1X），酚红	Gibco	12605028
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003