建立用于癌症研究的生理性人血管化微肿瘤模型

摘要

该协议提出了一种生理学相关的肿瘤芯片模型，用于执行高通量基础和转化人类癌症研究，推进药物筛选、疾病建模和个性化医疗方法，并描述了加载、维持和评估程序。

摘要

缺乏经过验证的癌症模型来概括 体外 实体癌的肿瘤微环境仍然是临床前癌症研究和治疗开发的重大瓶颈。为了克服这个问题，我们开发了血管化微肿瘤（VMT）或肿瘤芯片，这是一种微生理系统，可以真实地模拟复杂的人类肿瘤微环境。VMT通过在动态生理流动条件下共培养多种人类细胞类型，在微流控平台 内从头 形成。这种组织工程微肿瘤结构包含一个活的灌注血管网络，该网络支持不断增长的肿瘤块，就像新形成的血管 在体内一样。重要的是，药物和免疫细胞必须穿过内皮层才能到达肿瘤， 从而 模拟体内治疗递送和疗效的生理障碍。由于VMT平台是光学透明的，因此可以通过直接可视化组织内荧光标记的细胞来实现免疫细胞外渗和转移等动态过程的高分辨率成像。此外，VMT保留了 体内 肿瘤异质性、基因表达特征和药物反应。几乎任何肿瘤类型都可以适应该平台，来自新鲜手术组织的原代细胞在VMT中生长并对药物治疗做出反应，为真正的个性化医疗铺平了道路。本文概述了建立VMT并将其用于肿瘤学研究的方法。这种创新方法为研究肿瘤和药物反应开辟了新的可能性，为研究人员提供了推进癌症研究的有力工具。

引言

癌症仍然是全球主要的健康问题，也是美国的第二大死因。仅在 2023 年，美国国家卫生统计中心就预计美国将有超过 190 万例新发癌症病例和超过 600,000 例癌症死亡¹，这凸显了对有效治疗方法的迫切需要。然而，目前，只有5.1%的进入临床试验的抗癌疗法最终获得了FDA的批准。有希望的候选药物未能成功通过临床试验可部分归因于在临床前药物开发过程中使用了非生理模型系统，例如 2D 和球状培养^{物 2}。这些经典癌症模型缺乏肿瘤微环境的基本组成部分，例如基质生态位、相关免疫细胞和灌注脉管系统，这些都是治疗耐药性和疾病进展的关键决定因素。因此，为了改善临床前发现的临床转化，需要一种更好地模拟人类 体内 肿瘤微环境的新模型系统。

组织工程领域正在迅速发展，为在实验室环境中研究人类疾病提供了改进的方法。一个重要的发展是微生理系统（MPS）的出现，也称为器官芯片或组织芯片，它们是功能性的小型化人体器官，能够复制健康或疾病^条件3,4,5。在此背景下，肿瘤芯片是基于三维微流控的体外人类肿瘤模型，已被开发用于肿瘤学研究

方案

1. 设计与制造

1. 设备设计
   1. 对于微流控器件制造，使用200μm的SU-8旋涂层在Si晶圆上（RCA-1清洁和2%氟化氢（HF）处理）创建SU-8模具，然后进行如前所述的单个掩模光刻步骤^8,9。
   2. 从 SU-8 模具中铸造一个 4 毫米厚的聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 复制品，以生成用于下游制造步骤的耐用聚氨酯模具。可以使用各种设计迭代^{8、9、10、11、12、13、14、15}。
   3. 在当前的迭代中，将微流控装置设计为定制为标准的 96 孔板格式，并由 2 mm 厚的 PDMS 特征层和 12 个微流体装置单元组成，底部由薄（1/16 英寸）透明聚合物膜层包围（

结果

按照此处概述的方案，使用商业购买的 EC、NHLF 以及用于 VMT 的三阴性乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 建立 VMO 和 VMT。已建立的 VMO 也灌注癌细胞以模拟转移。在每个模型中，在共培养的第 5 天，血管网络响应重力驱动的流经组织室而自组装，作为 体内 营养物质、治疗药物、癌症或免疫细胞输送到基质生态位的管道（图 4）。首先通过将 mCherry 标记的 EC 引入组织室来建立 VMO，如 图 4A （培养的第 0 天）所示，细胞分布均匀。在VMO培养的第2天，EC开始伸展和流明化（图4B），到第4天，EC已经与外部微流体通道吻合并形成连续的血管网络（图4C）。在脉管系统形成吻合口并衬里外通道后，用 70 kD FITC-葡聚糖灌注 VMO 组织以确认血管通畅（图 4D）。FITC-葡聚糖被引入具有最高静水.......

讨论

身体中几乎每个组织都通过脉管系统获得营养和氧气，使其成为现实疾病建模和 体外药物筛选的关键组成部分。此外，几种恶性肿瘤和疾病状态由血管内皮功能障碍和高通透性^{定义 3}。值得注意的是，在癌症中，肿瘤相关的脉管系统通常灌注不良、破坏和渗漏，从而成为治疗和免疫细胞递送至肿瘤的障碍。此外，脉管系统可作为癌细胞转移以播种远处组织的管道，并促进细胞间通讯，从而抑制免疫反应，同时进一步促进癌细胞的生长和扩散。这些现象凸显了血管生态位在治疗耐药性和癌症进展中发挥的关键作用，以及在临床前研究期间准确模拟肿瘤微环境的必要性。然而，标准的 体外 模型系统未能包括适当的基质和血管成分或纳入动态流动条件。为了解决当前模型系统中的这些缺点，提出了建立表征良好的微生理系统的方法，该系统支持用于生理肿瘤学研究的活体灌注人类微肿瘤 （VMT） 的形成。重要的是，VMT 模拟了异常肿瘤相关血管和肿瘤-基质相互作用的关键特征，使其成为仿生疾病建模和治疗效果测试的理想选择¹⁰。

为了便于使用，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>制造
（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷，95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μ透明底 96 孔聚苯乙烯微孔板	Greiner Bio-One	655096
甲醇 &ge99.8% ACS	VWR 化学品 BDH	BDH1135-1LP
MILTEX 无菌一次性活检穿头，带柱塞，直径 1 毫米，	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS 膜	PAX Industries	HT-6240
等离子清洁器 PDC-001	Harrick 等离子	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion 透明聚碳酸酯柜式真空干燥器	Bel-Art	F42400-4031
带冷凝环的标准盖子，96 孔板	VWR	82050-827
SYLGARD 184 有机硅弹性体套件 （PDMS）	Dow	4019862
细胞培养/加载
BioTek Lionheart FX 自动化显微镜	Agilent
CELLvo 人内皮祖细胞	StemBioSys	N/A
胶原蛋白 I，大鼠尾	Enzo Life Sciences
胶原酶，来自 溶组织梭菌（4 型）	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank's 平衡盐溶液，1X，不含钙和镁	Corning	21-021-CV
Corning 含 L-谷氨酰胺、4.5g/L 葡萄糖和丙酮酸钠的 DMEM	康宁	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS，无钙、无镁	Gibco	14190144
EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
来自牛血浆的纤维蛋白原	Neta Scientific	SIAL-341573
纤连蛋白人血浆	Sigma-Aldrich	F0895
异硫氰酸荧光素–葡聚糖 （70kDa）	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
明胶，来自猪皮	Sigma-Aldrich	G1890
来自羊睾丸的透明质酸酶（4 型）	Sigma-Aldrich	H6254
层粘连蛋白小鼠蛋白	Gibco	23017015
徕卡 TCS SP8	徕卡	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF –正常人肺成纤维细胞	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
多聚甲醛 4% 在 0.1M 磷酸盐缓冲液盐水中，pH 7.4	电子显微镜科学	15735-90-1L
PBMC - 外周血单核细胞	Lonza	CC-2702
PBS，pH 7.4	Gibco	10010049
优质胎牛血清 （FBS），热灭活	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold 抗淬灭封片剂	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep 试剂盒	Zymo研究	R1051
牛血浆凝血	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100（电泳），	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express 酶 （1X），酚红	Gibco	12605028
胰蛋白酶-EDTA （0.05%），酚红	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline 细胞技术	LL-0003