脑出血后脑切片中脑周细胞活力成像

摘要

初步研究证实，蛛网膜下腔出血（SAH）可导致脑周细胞死亡。评估SAH后周细胞的收缩功能需区分存活与非存活的脑周细胞。因此，已建立一种可在脑组织切片中同时标记存活与非存活脑周细胞的方法，便于利用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。

摘要

周细胞是位于脑微循环中的重要壁细胞，通过调节收缩性在主动调控脑血流中发挥关键作用。传统上，通过观察特定条件下周细胞的形态变化及其邻近毛细血管直径的改变来评估其收缩性。然而，在组织固定后，所成像脑周细胞的活性以及由此反映的周细胞收缩性评估会受到限制。同样，通过基因标记脑周细胞的方法难以区分存活与非存活的周细胞，尤其是在蛛网膜下腔出血（SAH）等神经系统疾病中，我们的初步研究已证实脑周细胞会发生死亡。为此，已开发出一种可靠的实验方案，可克服上述局限，实现在脑切片中同时对功能性与非功能性脑周细胞进行荧光标记。该标记方法可在高分辨率共聚焦显微镜下实现可视化，并可同时标记脑片中的微血管结构。这一创新性方案为评估脑周细胞的收缩性、其对毛细血管直径的影响以及周细胞自身结构提供了有效手段。在SAH背景下研究脑周细胞的收缩性，有助于深入理解其对脑微循环的影响。

引言

脑周细胞以其细长的突起和突出的胞体为特征，环绕在微循环周围^1,2。虽然脑血流量的增加主要由毛细血管扩张驱动，但较小的动脉扩张速度较慢³。周细胞的收缩性可影响毛细血管直径及周细胞自身形态，从而调控血管动力学⁴。脑周细胞收缩会导致毛细血管变窄，在病理情况下，过度收缩可能阻碍红细胞流动⁵。多种因素可诱导脑毛细血管内周细胞收缩，例如由蓝斑释放的去甲肾上腺素⁶。周细胞在脑血流调节中发挥重要作用，并能够合成20-HETE，在高氧状态下充当氧感受器⁷。氧化-亚硝化应激引发的脑周细胞收缩对毛细血管产生不利影响⁵。尽管已有针对脑周细胞收缩的体内（in vivo）和离体（ex vivo）研究⁸，但关于脑切片中存活与非存活脑周细胞成像的研究仍十分有限。

关键的是，组织固定后的脑周细胞成像会损害其活力，从而影响后续收缩功能的评估。此外，在某些病理情况下（例如神经系统疾病，如蛛网膜下腔出血 - SAH），转基因标记脑周细....

方案

实验方案经昆明医科大学动物伦理与使用委员会批准（编号：kmmu20220945）。本研究采用 Sprague-Dawley（SD）大鼠，雌雄均有，体重为 300–350 g。

1. 诱导蛛网膜下腔出血模型

1. 使用2%异氟烷和100%氧气对大鼠进行麻醉。通过持续吸入1%–3%异氟烷维持麻醉状态。使用立体定位仪（见材料表）固定大鼠头部。
2. 按照以下步骤建立蛛网膜下腔出血（SAH）模型。
   1. 将微量注射针插入鞍上池，然后使用注射泵（见材料表）将来自大鼠尾动脉的自体血液（不含抗凝剂）注入鞍上池。
   2. 根据以下坐标将微量注射针植入右侧侧脑室：前囟后方−0.8 mm，侧向1.4 mm，深度4 mm⁹。对于SAH组，注入0.2 mL大鼠尾动脉血液；对于假手术组，注入等体积的等渗盐水（图1A）。

2. 脑切片制备与稳定

1. 使用2%异氟烷吸入法对大鼠进行深度麻醉。断头后取出全脑，并将其浸入冰冻的人工脑脊液（ACSF）中。
   注意：使用新鲜配制的AC....

结果

在正常的生理条件下，脑周细胞通常不会发生细胞死亡。图6展示了这一现象，其中黄色表示存活的脑周细胞的存在；脑周细胞未被碘化丙啶（PI）染色，表明其具有活性。为了进一步研究周细胞在细胞死亡后是否仍附着于微血管，研究人员在蛛网膜下腔出血（SAH）大鼠模型中采用了相关方法，并进行了后续成像分析。

已开发出在蛛网膜下腔出血（SAH）后对脑切片中存活和非存活脑周细胞进行成像的方法。如图7所示，存活的脑周细胞（蓝色箭头）位于微血管系统内，而非存活的脑周细胞由白色箭头标示。这种同步可视化方法可实现在脑切片中同时识别存活与非存活的脑周细胞。此外，观察到PI标记的非存活脑周细胞仍附着于整个微血管系统。

讨论

已开发出高分辨率共聚焦成像技术，用于在脑切片中可视化活体脑周细胞、非活体脑周细胞以及微血管系统。在急性大鼠脑切片中，该过程首先使用TO-PRO-3¹¹标记周细胞，随后用IB4¹²标记微血管内皮细胞；接着使用PI鉴定已死亡的周细胞。该方案操作简便、可重复性强，适用于功能学研究。

为了特异性示踪神经系统中的脑周细胞，使用远红荧光染料TO-PRO-3。虽然TO-PRO-3主要对固定组织的细胞核进行染色¹³，但在生理盐水中体外应用时，可选择性地进入活的周细胞¹⁴。先前的研究已证实，使用TO-PRO-3可明确鉴定小鼠脑周细胞¹⁵。该荧光染料能有效标记活体脑周细胞¹¹。相比之下，PI是一种常用于实时细胞活力评估的带电荧光染料¹²，在固定前应用时（即固定前PI染色）.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	ABC biochemistry	ABC703006	RT
Adobe Photoshop	Adobe	Adobe Illustrator CS6 16.0.0	RT
铝箔	MIAOJIE	225 mm x 273 mm	RT
CaCl2·2H2O	Sigma-Aldrich	C3881	RT
共聚焦成像软件	Nikon	NIS-Elements 4.10.00	RT
共聚焦激光扫描显微镜	Nikon	N-SIM/C2si	RT
气体钢瓶（5% CO2, 95% O2）	PENGYIDA	40L	RT
玻璃底共聚焦培养皿	Beyotime	FCFC020-10pcs	RT
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G5767	RT
胶水	EVOBOND	KH-502	RT
制冰机	XUEKE	IMS-20	RT
图像分析软件	美国国立卫生研究院	Image J	RT
吸入式麻醉系统	SCIENCE	QAF700	RT
凝集素B4-FITC	SIGMA	L2895–2MG	分装后于–20 °C保存
KCl	Sigma-Aldrich	7447–40–7	RT
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	RT
MgSO4	Sigma-Aldrich	M7506	RT
NaCl	Sigma-Aldrich	7647–14–5	RT
NaH2PO4·H2O	Sigma-Aldrich	10049–21–5	RT
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S5761	RT
巴斯德吸管	NEST Biotechnology	318314	RT
蠕动泵	Scientific Industries Inc	Model 203	RT
碘化丙啶	Med Chem Express	HY-D0815/CS-7538	分装后于–20 °C保存
立体定位仪	SCIENCE	QA	RT
注射泵	Harvard PUMP	PUMP 11 ELITE Nanomite	RT
恒温水浴箱	OLABO	HH-2	RT
振动切片机	Leica	VT1200	RT