本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。
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本文内容
摘要
摘要
尽管人类造血细胞移植具有复杂性，研究人员通常在小鼠中进行静脉注射或股骨内注射（IF）。在小鼠模型中，该技术已被改进以提高移植的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的定植效率。本文描述了一种详细的股骨内注射技术操作步骤，以及随后在小鼠中进行的骨髓（BM）穿刺，从而实现对骨髓中细胞的连续性表征。该方法能够移植细胞数量较少的珍贵样本，而这类样本通过静脉注射尤其难以成功植入。此操作有助于建立对病理分析至关重要的异种移植模型。虽然外周血（PB）更容易获取，但其细胞组成并不能反映作为HSPCs生态位的骨髓情况。因此，能够进入骨髓腔室的操作对于研究造血过程至关重要。如本文所述，股骨内注射结合连续骨髓穿刺，可在不处死小鼠的情况下，实现对骨髓中富集细胞（如HSPCs）的前瞻性获取与表征。
引言
血液系统由定位于骨髓（BM）中的造血干细胞（HSCs）终生维持1,2。为了研究骨髓微环境的动态变化，理解正常与恶性造血的生物学特性至关重要3,4。将造血干细胞直接移植至人类骨髓所获得的植入效率高于外周血（PB）输注，但因操作复杂性高且感染风险增加，该方法尚未成为常规临床实践的一部分5。在小鼠中，无需处死动物即可实现骨髓通路的操作方法，为连续监测造血过程提供了资源。本文所述方法旨在建立移植细胞高植入率的小鼠模型，并允许对活体小鼠进行多次骨髓取样。本文将重点介绍利用免疫缺陷小鼠构建人源细胞异种移植模型的方法，此类模型的建立难度高于小鼠间的同种异体移植模型。与通过尾静脉或眶后静脉常规移植造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的方法相比，该技术的优势在于使用较少起始材料即可实现较高的细胞植入率。
尽管向小鼠骨髓（BM）腔内进行股骨内（IF）细胞注射是体内研究人源HSPC的常用方法in vivo6,7,8，但此....
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方案
本方案使用6至10周龄的雄性或雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠，但该方法可适用于所有类型的小鼠。是否对小鼠进行照射取决于实验内容和小鼠类型，需根据研究目的决定是否进行照射。此处描述的所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》的规定，并经斯坦福大学实验动物护理行政小组（APLAC #22264）批准。所有正常血细胞群体均为新鲜分选获得。人急性髓系白血病（AML）样本来自斯坦福医学中心患者，采集过程均获得知情同意，并依据机构审查委员会（IRB）批准的方案（斯坦福IRB，33818）进行。
1. 细胞系、造血干细胞与祖细胞（HSPCs）或白血病干细胞（LSCs）的骨髓内注射
注意：为了使用成像设备轻松分析注射的细胞，我们构建了Akaluc/tdTomato阳性的K562细胞系，并使用AkaLumine-HCl/Akaluc作为底物10。如果缺乏成像设备，可通过慢病毒或PiggyBac将细胞标记荧光染料，随后采用流式细胞术进行分析。无论细胞制备的具体方法如何，建立一种可靠验证注入骨髓的细胞是否成功归巢至骨髓（BM）的方法，对于优化本技术至关重要（图1）。
- 将细胞悬液（最多 3 × 106 个血....
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结果
根据这些方案1,14,15,16,17,18,19,20，每份样本均进行了移植，并建立了异种移植小鼠模型。本实验的目的是展示在活体小鼠中进行骨髓穿刺/分析的同时，通过IF注射多种类型的人源细胞。本文展示了以下常用人源样本移植的结果：K562细胞系（图1）、脐带血来源的造血干/祖细胞（HSPCs，CD34+，图2）、脐带血来源的造血干细胞（HSCs，CD34+<.......
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讨论
小鼠异种移植模型对于研究正常和病理状态下的人类造血过程具有重要意义。骨髓（BM）是造血的来源3，因此研究血液系统疾病需要将稀有的人类干细胞成功植入小鼠骨髓中。迄今为止，已有报道通过尾静脉、眶后静脉和颅内注射等移植方法，且已知这些方法均可实现移植细胞的植入。其中，颅内注射是一种用于确保极少量人源细胞植入免疫缺陷小鼠的移植方法，与其他方法相比，其植入率非常稳定6,7,8,9,11。此外，直接骨髓内移植在临床实践中应用的价值也已有报道5,19。
在配备麻醉机的任何实验场所均可轻松完成该操作。就操作时间而.......
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披露
R.M. 担任 Kodikaz Therapeutic Solutions、Orbital Therapeutics 和 858 Therapeutics 的顾问委员会成员，并拥有多项与 CD47 癌症免疫疗法相关的专利发明权，这些专利已授权给 Gilead Sciences。R.M. 还是 Pheast Therapeutics、MyeloGene 和 Orbital Therapeutics 的联合创始人及股权持有者。
致谢
我们感谢多年来Majeti实验室所有成员的帮助、支持、鼓励和启发。感谢斯坦福干细胞研究所的流式细胞术核心实验室、Binns脐带血研究项目以及提供样本的患者。对于人源样本，正常供体的人骨髓和外周血细胞均新鲜取自AllCells公司或斯坦福血液中心。我们感谢斯坦福大学Nakauchi实验室捐赠pBac-AkaLuc-tdTomato质粒。尤其要感谢斯坦福大学兽医服务中心的兽医及动物管理人员对实验小鼠的悉心照料。特别是动物中心主管Mike Alvares，在小鼠管理工作中极为细致周到，毫不夸张地说，如果没有他，我们的研究将无法开展。
本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01HL142637和1R01CA251331、斯坦福大学路德维希癌症干细胞研究中心与医学中心，以及白血病与淋巴瘤学会血液癌症发现资助计划的支持。 & 淋巴瘤协会、马克癌症研究基金会以及保罗·G·艾伦前沿小组，以上资助均授予R.M。R.M. 是白血病与淋巴瘤协会学者奖获得者。Y.N. 受中谷基金会人类科学基金和斯坦福大学医学院院长博士后奖学金资助。A.E. 受美国国家癌症研究所资助号F32CA250304、斯坦福大学高级住院医师培训项目以及美国血液学会学者奖资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1/2 mL 注射器，27 G | BD | 305620 | https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620 |
| ACK裂解缓冲液 | Qualoty Biological | 118-156-101CS | https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/ |
| 生物辐照仪 | Kimtron | IC-250 | https://www.kimtron.com/ic-250 |
| 氯己定 | Nolvasan | NDC 54771-8701-1 | https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser |
| 乙醇，190 proof | Gold Shield | https://goldsd.com/line-card/ | |
| FACSCanto II | （Becton Dickinson and Company (BD)，美国新泽西州富兰克林湖 | ||
| 胎牛血清（FBS） | Omega Scientific | FB-01 | https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/ |
| 流式细胞仪，AriaII | 贝克顿-迪金森（BD） | 细胞分选 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053 |
| 异氟烷，USP | Dechra | NDC 17033-094-25 | https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠 | 杰克逊实验室，美国缅因州巴港 | 品系编号：005557 | 6至10周龄的雄性或雌性 |
| 眼用软膏，USP | Bausch Lomb | NDC 24208-780-55 | https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/新霉素和多粘菌素B硫酸盐-杆菌肽眼用溶液.pdf |
| OstiFen 注射液（卡洛芬） | VetOne | NDC 13985-748-20 | http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b |
| PBS，pH 7.4 | 自制 | ||
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| 聚维酮碘 | 贝塔碘 | NDC 67618-155-16 | https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/ |
| TokeOni（在美国） | Sigma-Aldrich | 808350-5MG | AkaLumine-HCl/Akaluc；https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350 |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020 |
| 移植抗体组合（体内，小鼠骨髓） | |||
| 抗原 | 稀释 | ||
| 抗原抗人 CD45 荧光团V450 克隆HI30 | BD Biosciences | 560367 | 1:25 |
| 抗原抗小鼠 CD45.1 荧光团PE-Cy7 克隆A20 | eBioscience | 25-0453-81 | 1:50 |
| 抗原抗小鼠 TER-119 荧光团PE-Cy5 克隆TER-119 | eBioscience | 15-5921-83 | 1:100 |
| 抗原抗人CD3 荧光团APC-Cy7 克隆SK7 | BD Biosciences | 341090 | 1:12.5 |
| 抗原抗人 CD19 荧光团APC 克隆HIB19 | BD Biosciences | 555415 | 1:25 |
| 抗原抗人 CD33 荧光团PE 克隆WM53 | BD Biosciences | 555450 | 1:25 |
| 活细胞/死细胞染色 | 浓度 | ||
| PI | Invitrogen | 1 μg/mL | |
| 补偿微珠 | |||
| 阴性对照 | BD Biosciences | 请参阅说明以获取详细信息 | |
| 抗小鼠Ig， κ | BD Biosciences | 请参阅说明以获取详细信息 |
参考文献
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L. Identification of a hierarchy of multipotent hematopoietic progenitors in human cord blood. Cell Stem Cell. 1 (6), 635-645 (2007).
- Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewa....
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重印与许可
