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方法文章

利用活体小鼠进行简化的股骨内注射以实现连续骨髓分析

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DOI：

10.3791/65874

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2023年11月10日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Hematology, Cancer Institute, and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了在小鼠异种移植模型中向股骨内注射少量造血干细胞或白血病干细胞（包括基因编辑细胞）的方法，该方法不仅能够实现细胞的快速安全移植，还可进行骨髓的系列分析。

摘要

尽管人类造血细胞移植具有复杂性，研究人员通常在小鼠中进行静脉注射或股骨内注射（IF）。在小鼠模型中，该技术已被改进以提高移植的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的定植效率。本文描述了一种详细的股骨内注射技术操作步骤，以及随后在小鼠中进行的骨髓（BM）穿刺，从而实现对骨髓中细胞的连续性表征。该方法能够移植细胞数量较少的珍贵样本，而这类样本通过静脉注射尤其难以成功植入。此操作有助于建立对病理分析至关重要的异种移植模型。虽然外周血（PB）更容易获取，但其细胞组成并不能反映作为HSPCs生态位的骨髓情况。因此，能够进入骨髓腔室的操作对于研究造血过程至关重要。如本文所述，股骨内注射结合连续骨髓穿刺，可在不处死小鼠的情况下，实现对骨髓中富集细胞（如HSPCs）的前瞻性获取与表征。

引言

血液系统由定位于骨髓（BM）中的造血干细胞（HSCs）终生维持1,2。为了研究骨髓微环境的动态变化，理解正常与恶性造血的生物学特性至关重要3,4。将造血干细胞直接移植至人类骨髓所获得的植入效率高于外周血（PB）输注，但因操作复杂性高且感染风险增加，该方法尚未成为常规临床实践的一部分5。在小鼠中，无需处死动物即可实现骨髓通路的操作方法，为连续监测造血过程提供了资源。本文所述方法旨在建立移植细胞高植入率的小鼠模型，并允许对活体小鼠进行多次骨髓取样。本文将重点介绍利用免疫缺陷小鼠构建人源细胞异种移植模型的方法，此类模型的建立难度高于小鼠间的同种异体移植模型。与通过尾静脉或眶后静脉常规移植造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的方法相比，该技术的优势在于使用较少起始材料即可实现较高的细胞植入率。

尽管向小鼠骨髓（BM）腔内进行股骨内（IF）细胞注射是体内研究人源HSPC的常用方法in vivo6,7,8，但此前尚未发表对该技术进行系统性分步图示或视频记录的正式操作流程。本方案可在移植细胞数量较少的情况下实现高效植入，并支持对骨髓进行连续取样。此外，该方法还可用于分析将药物直接注射至骨髓腔对血液系统疾病治疗效果的影响。本文所述操作步骤有助于在不处死小鼠的前提下获取造血细胞所处的骨髓环境。

本方案与骨髓抽吸技术类似9。关键区别在于，本文及配套视频方案详细描述了一种将细胞注射至骨髓的安全操作流程，而以往的研究通常通过静脉移植细胞，随后进行连续的骨髓抽吸。本方案能够使用少量细胞实现成功的植入，适用于细胞系（图1）、正常脐带血（CB）来源的造血干/祖细胞（HSPCs，CD34+）（图2）和造血干细胞（HSCs，CD34+CD38-CD45RA-CD90+）（图3）、正常骨髓来源的HSPCs（CD34+CD38-）（图4）、患者来源的白血病干细胞（CD34+CD38-）（图5）、经CRISPR/Cas9基因编辑的正常CB来源HSPCs（CD34+）（图6）以及急性髓系白血病（AML）诱导多能干细胞（AML-iPSCs）（图7）。特别是对于正常脐带血来源的HSCs，我们仅用10个细胞即可成功实现植入。该方法在使用稀有或难以获得的细胞群体（如未经修饰或经基因编辑的原代人急性髓系白血病细胞或脐带血细胞）进行实验时尤为有价值。此外，本方案还描述了一种高效的连续分析植入细胞的方法，这些细胞可直接用于后续实验。为避免浪费珍贵样本并确保IF注射的准确性，本文还简要介绍了基于Akaluc的实验操作10，以帮助巩固该技术。

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方案

本方案使用6至10周龄的雄性或雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠，但该方法可适用于所有类型的小鼠。是否对小鼠进行照射取决于实验内容和小鼠类型，需根据研究目的决定是否进行照射。此处描述的所有动物实验均遵循《实验动物护理与使用指南》的规定，并经斯坦福大学实验动物护理行政小组（APLAC #22264）批准。所有正常血细胞群体均为新鲜分选获得。人急性髓系白血病（AML）样本来自斯坦福医学中心患者，采集过程均获得知情同意，并依据机构审查委员会（IRB）批准的方案（斯坦福IRB，33818）进行。

1. 细胞系、造血干细胞与祖细胞（HSPCs）或白血病干细胞（LSCs）的骨髓内注射

注意：为了使用成像设备轻松分析注射的细胞，我们构建了Akaluc/tdTomato阳性的K562细胞系，并使用AkaLumine-HCl/Akaluc作为底物10。如果缺乏成像设备，可通过慢病毒或PiggyBac将细胞标记荧光染料，随后采用流式细胞术进行分析。无论细胞制备的具体方法如何，建立一种可靠验证注入骨髓的细胞是否成功归巢至骨髓（BM）的方法，对于优化本技术至关重要（图1）。

  1. 将细胞悬液（最多 3 × 106 个血细胞）用 20 µL 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）+ 2% 胎牛血清（FBS）+ 2 mM EDTA）或解冻培养基（IMDM + 20% FBS + 青霉素/链霉素）在 PCR 管或 1.5 mL 离心管中制备，并在注射前置于冰上保存。
    注意：用针头重悬细胞时应避免产生气泡。注射前应尽可能去除气泡，因为注射气泡可能导致小鼠突然死亡。
  2. 在细胞注射前最多 48 小时，对 6–10 周龄的成年小鼠进行 200 cGy（225 kV，13.3 mA，总剂量 2 Gy [剂量控制模式]）的预处理。
  3. 首先，在诱导室中通过吸入异氟烷对小鼠进行麻醉，并通过鼻罩以 1–2 L/min 的流速持续给予 2% 异氟烷和 100% 氧气，以达到稳定的麻醉状态。通过脚趾夹捏反射和缓慢、平稳的呼吸来检查麻醉深度，并在整个异氟烷操作过程中维持该状态。
    注意：在整个操作过程中每 3–5 分钟监测一次麻醉深度，以确保在手术操作和/或耳、脚趾、尾部夹捏时心率和呼吸频率无变化。黏膜和皮肤的颜色可作为氧合状态的指标，若小鼠状态良好，其颜色应呈粉红色。当使用不透明遮布覆盖小鼠时应格外小心，因为可能无法清楚观察小鼠的状况。
  4. 操作前，皮下注射 10 mg/kg 的卡洛芬以减轻疼痛，并加热 0.5–1.0 mL 的 0.9% 生理盐水用于支持性护理。
  5. 将眼用软膏涂抹于小鼠眼部，以防止角膜干燥。
  6. 将小鼠置于加热垫或其他恒温控制表面上，以防止术中低体温。
    注意：术后使用可调温加热垫。小鼠的正常体温通常为 37–39 °C，加热垫温度应略低于此范围。实践中，温度常设定在 32–36 °C。
  7. 使用三组交替擦拭（交替使用聚维酮碘或氯己定擦拭液与 70% 乙醇浸湿的纱布）对包含待注射股骨的整个腿部进行消毒。
    注意：1）若操作者为左利手，小鼠左侧股骨可能比右侧更容易注射。2）本研究中未去除毛发以避免不必要的皮肤损伤，且无需剪除毛发即可准确定位针头进入点。然而，对于毛色较深的小鼠，可能难以定位穿刺部位，此时可考虑剪除毛发，因其操作快速简便，有助于顺利开始注射。
  8. 用拇指和食指轻轻夹住股骨以固定腿部。用无名指或小指推动胫骨，使其与股骨保持弯曲状态。正确的体位对成功注射至关重要（补充图 S1–S5）。
    注意：可使用镊子夹持骨骼以防止手指受伤；但可能难以感知股骨干，且会延长操作时间。
  9. 将连接注射器的无菌空 27 G 针头（1/2 英寸）插入髌腱下方，使针头牢固地位于股骨髁之间。利用针头边缘轻敲股骨上方的髌腱数次，以确定最佳进针位置（补充图 S1–S5）。
    注意：在执行此操作前必须熟悉小鼠膝部解剖结构。初学者应在尝试活体小鼠操作前，花时间学习该区域的解剖结构，并在已安乐死的小鼠上练习操作。
  10. 将针头向外并向上旋转，确保其与股骨干平行。
    注意：此操作可提供通往骨髓腔的可靠路径，便于从股骨干获取骨髓内容物，并最大限度减少动物在操作过程中的不适。
  11. 在缓慢推进针头进入股骨骨髓腔的同时，旋转针头。当阻力明显降低时，即表示针头已到位。通过轻轻横向移动注射器确认针头位置是否正确。若能用手指触碰到骨外针头边缘，则需返回步骤 1.9，选择另一角度和位置重新穿刺。
    1. 确保针头进入角度垂直于骨端面。
      注意：理论上，针头必须平行于股骨插入，且与骨端成 90° 角。若感受到来自骨内表面的阻力，则表明针头已正确进入股骨腔。为确认针头与骨骼平行，可在骨侧放置光源，观察骨影是否与针头轴平行。进入骨髓腔时阻力的降低程度取决于小鼠年龄：小鼠越年轻，越容易察觉阻力的下降。
  12. 在骨髓（BM）腔内来回移动针头的同时，轻轻回拉针筒活塞以产生负压。若针头位于骨髓腔内，注射器中将可见血液/骨髓回流。
    1. 若未见血液/骨髓回流，更换新针头并尝试沿相同路径穿刺。
      注意：更换针头的原因是，一旦骨屑堵塞针头，将难以检测血液/骨髓的回流。尽量减少进入骨髓腔的穿刺路径数量至关重要，因为注入骨髓的细胞可能通过先前的穿刺点泄漏出股骨。若必须使用多个穿刺路径，可通过缓慢注射而非快速推注来降低泄漏风险。
  13. 缓慢拔出针头，并将含有细胞的注射器沿相同路径插入。尝试将针头插入至其自然停止处（骨髓腔边缘），然后稍向后退 1–2 mm，以便于注射细胞。在按压活塞释放细胞前，应轻微回抽并检查是否有血液/骨髓回流，以确认针头位置正确。先确认血液/骨髓回流，再缓慢推动注射器注入细胞。
    ​注意：更换针头时，务必记住第一次注射的路径和角度。若无法找到相同路径，应使用最初建立路径的针头再次尝试。此时也可使用新针头，但若使用原针头，应先将其堵塞的骨屑推出后再使用。切勿使用含细胞的针头寻找新的注射路径，否则针头内卡住的骨碎片可能阻碍细胞分散。尽管骨髓腔非常小，考虑到死腔体积，注射量应小于 30 µL。
    1. 确保注射速度缓慢，以防止注射器中的空气进入骨髓，或细胞从穿刺点泄漏。若推注时感到阻力，可上下移动针头以寻找骨髓腔内阻力较小的区域。
  14. 成功将细胞注入股骨后，在保持注射器压力的同时，将针头和注射器从小鼠体内取出。
    注意：若注射未能完成，可尝试另一侧股骨。即使在麻醉状态下，该操作对小鼠仍具有较大应激性。应始终监测小鼠的生命体征（心率和呼吸频率），并尽可能快速完成操作。
  15. 将小鼠从鼻罩中取出，放置于干净的纸巾上，以防吸入垫料。恢复期间，将小鼠置于加热垫或其他恒温控制表面上。在将小鼠放回鼠架前，需监测所有小鼠，确认其已从麻醉中恢复。
    注意：若操作得当，穿刺后不应出现并发症或痛苦表现。当麻醉小鼠恢复自主活动能力并能触及食物和饮水时，表示操作完成。
  16. 术后 24 小时内观察小鼠是否有痛苦或感染迹象。痛苦或感染的迹象包括持续出血、贫血和嗜睡。若术后出现上述任何症状，应根据动物操作规程通过 CO2 吸入或颈椎脱位法对动物实施安乐死。

2. 从股骨抽吸骨髓细胞用于FACS分析

注意：从小鼠中抽吸骨髓细胞的步骤与第1节中描述的方法非常相似，可参考一些先前的文献9,11,12。以下是骨髓注射与抽吸操作方案之间一些差异的概述。

  1. 每份样本准备 500 µL 含 10 mM EDTA 的 PBS（细胞悬浮液培养基：CSM），用于悬浮骨髓抽吸物。
  2. 在抽吸骨髓前，用 CSM 润湿一支 0.5 mL 的 27 G 注射器。向注射器中吸入 200–500 µL CSM，立即排出。重复此操作 2–3 次。
  3. 通过缓慢回抽注射器活塞，轻柔地抽吸出 20–50 µL 小鼠骨髓。随后，将针头完全从股骨中取出，并将抽吸物悬浮于 500 µL CSM 中（置于 1.5 mL 离心管内），用于后续染色步骤。将小鼠从鼻罩中取出，放置在干净的纸巾上，以防止恢复期间吸入垫料。在将小鼠放回鼠架前，需密切观察所有小鼠，确认其已从麻醉状态中恢复。
    注意：骨髓抽吸/取样可重复进行，但同一天的重复操作必须在对侧股骨上进行，以避免同一肢体反复受到创伤。尽管关于骨髓抽吸频率的文献资料较少，但根据我们的经验，股骨骨髓抽吸通常每 4 周重复一次，总共可进行至少 3–4 次而无明显问题（如感染）。然而，需要注意的是，移植骨髓对侧的骨髓通常细胞植入率较低。
  4. 将骨髓抽吸物在 300 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
  5. 吸除上清液，向每管中加入 0.5–1 mL ACK 裂解缓冲液（150 mM NH4Cl，10 mM KHCO3，0.1 mM EDTA），涡旋重悬细胞，冰上孵育 5–10 分钟。
  6. 将每管样品通过尼龙滤网过滤至新离心管中。
  7. 用 1 mL FACS 缓冲液冲洗原管，并将冲洗液同样通过尼龙滤网加入新管中。
  8. 在 300 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟，沉淀细胞。
  9. 吸除上清液，加入含有目标抗体的染色液13，冰上孵育 20 分钟。
  10. 根据实验设计洗涤并分析细胞。
    1. 用 FACS 缓冲液（PBS，2% FBS，2 mM EDTA）洗涤细胞，并在冰上以总体积 50 µL 染色 30 分钟。在分析或分选前立即用碘化丙啶（PI）染色，终浓度为 1 µg/mL。分选后进行分析以验证分选细胞群体的纯度。
      注意：流式细胞术所用全部抗体详见材料表。
    2. 使用以下 FACS 设门策略（图 2–图 7）分析来自小鼠骨髓的植入细胞。
      1. 根据前向散射（细胞大小）和侧向散射（细胞颗粒度）特性区分细胞群体。
      2. 通过绘制 FSC-H 与 FSC-W 的散点图进行双联体排除，随后对 SSC-H 与 SSC-W 进行相同操作。
      3. 排除死细胞。
      4. 根据人源 CD45 和鼠源 CD45 区分细胞群体。这些抗体染色组合还可用于在人源 CD45 亚群中检测人源 CD3、CD19 和 CD33。
        注意：在染色样本前，务必使用鼠源和人源 Fc 封闭抗体，以防止非特异性抗体结合。我们通常在冰上用 Fc 封闭抗体（鼠源 + 人源）孵育 10 分钟，随后不洗涤直接加入其他抗体。请参考各公司提供的说明书了解 Fc 封闭抗体的具体使用方法。

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结果

根据这些方案1,14,15,16,17,18,19,20，每份样本均进行了移植，并建立了异种移植小鼠模型。本实验的目的是展示在活体小鼠中进行骨髓穿刺/分析的同时，通过IF注射多种类型的人源细胞。本文展示了以下常用人源样本移植的结果：K562细胞系（图1）、脐带血来源的造血干/祖细胞（HSPCs，CD34+，图2）、脐带血来源的造血干细胞（HSCs，CD34+<...

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讨论

小鼠异种移植模型对于研究正常和病理状态下的人类造血过程具有重要意义。骨髓（BM）是造血的来源3，因此研究血液系统疾病需要将稀有的人类干细胞成功植入小鼠骨髓中。迄今为止，已有报道通过尾静脉、眶后静脉和颅内注射等移植方法，且已知这些方法均可实现移植细胞的植入。其中，颅内注射是一种用于确保极少量人源细胞植入免疫缺陷小鼠的移植方法，与其他方法相比，其植入率非常稳定6,7,8,9,11。此外，直接骨髓内移植在临床实践中应用的价值也已有报道5,19。

在配备麻醉机的任何实验场所均可轻松完成该操作。就操作时间而...

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披露

R.M. 担任 Kodikaz Therapeutic Solutions、Orbital Therapeutics 和 858 Therapeutics 的顾问委员会成员，并拥有多项与 CD47 癌症免疫疗法相关的专利发明权，这些专利已授权给 Gilead Sciences。R.M. 还是 Pheast Therapeutics、MyeloGene 和 Orbital Therapeutics 的联合创始人及股权持有者。

致谢

我们感谢多年来Majeti实验室所有成员的帮助、支持、鼓励和启发。感谢斯坦福干细胞研究所的流式细胞术核心实验室、Binns脐带血研究项目以及提供样本的患者。对于人源样本，正常供体的人骨髓和外周血细胞均新鲜取自AllCells公司或斯坦福血液中心。我们感谢斯坦福大学Nakauchi实验室捐赠pBac-AkaLuc-tdTomato质粒。尤其要感谢斯坦福大学兽医服务中心的兽医及动物管理人员对实验小鼠的悉心照料。特别是动物中心主管Mike Alvares，在小鼠管理工作中极为细致周到，毫不夸张地说，如果没有他，我们的研究将无法开展。

本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目1R01HL142637和1R01CA251331、斯坦福大学路德维希癌症干细胞研究中心与医学中心，以及白血病与淋巴瘤学会血液癌症发现资助计划的支持。 & 淋巴瘤协会、马克癌症研究基金会以及保罗·G·艾伦前沿小组，以上资助均授予R.M。R.M. 是白血病与淋巴瘤协会学者奖获得者。Y.N. 受中谷基金会人类科学基金和斯坦福大学医学院院长博士后奖学金资助。A.E. 受美国国家癌症研究所资助号F32CA250304、斯坦福大学高级住院医师培训项目以及美国血液学会学者奖资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1/2 mL 注射器，27 GBD305620https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
ACK裂解缓冲液Qualoty Biological118-156-101CShttps://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
生物辐照仪KimtronIC-250https://www.kimtron.com/ic-250
氯己定NolvasanNDC 54771-8701-1https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
乙醇，190 proofGold Shieldhttps://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II （Becton Dickinson and Company (BD)，美国新泽西州富兰克林湖
胎牛血清（FBS）Omega ScientificFB-01https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
流式细胞仪，AriaII贝克顿-迪金森（BD）细胞分选
IMDMGibco12440053https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
异氟烷，USPDechraNDC 17033-094-25https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠 杰克逊实验室，美国缅因州巴港
品系编号：005557		6至10周龄的雄性或雌性 
眼用软膏，USPBausch LombNDC 24208-780-55https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a
7a202cc5a0673c977/新霉素和多粘菌素B硫酸盐-杆菌肽眼用溶液.pdf
OstiFen 注射液（卡洛芬）VetOneNDC 13985-748-20http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS，pH 7.4自制
青霉素-链霉素Gibco15140122https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
聚维酮碘贝塔碘NDC 67618-155-16https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni（在美国）Sigma-Aldrich808350-5MGAkaLumine-HCl/Akaluc；https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0Invitrogen15575020https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020
移植抗体组合（体内，小鼠骨髓）
抗原稀释
抗原抗人 CD45
荧光团V450
克隆HI30		BD Biosciences5603671:25
抗原抗小鼠 CD45.1
荧光团PE-Cy7
克隆A20		eBioscience25-0453-811:50
抗原抗小鼠 TER-119
荧光团PE-Cy5
克隆TER-119		eBioscience15-5921-831:100
抗原抗人CD3
荧光团APC-Cy7
克隆SK7		BD Biosciences3410901:12.5
抗原抗人 CD19
荧光团APC
克隆HIB19		BD Biosciences5554151:25
抗原抗人 CD33
荧光团PE
克隆WM53		BD Biosciences5554501:25
活细胞/死细胞染色浓度
PIInvitrogen1 μg/mL
补偿微珠
阴性对照BD Biosciences请参阅说明以获取详细信息
抗小鼠Ig， κBD Biosciences请参阅说明以获取详细信息

参考文献

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骨内注射骨髓穿刺造血干细胞小鼠异种移植模型连续骨髓分析细胞植入造血祖细胞骨髓移植FACS缓冲液生物发光成像
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