斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

摘要

本文介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以进行单细胞RNA测序分析的方法。

摘要

胃肠道（GI）在维持生命方面执行多种重要功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠神经肌肉系统疾病，这凸显了理解胃肠道发育及其功能障碍相关分子机制的重要性。在本研究中，我们介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以获得活体组织的方法， 可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的活细胞。该方案基于斑马鱼肠道的手动解剖，随后使用木瓜蛋白酶进行酶解离。接着对细胞进行荧光激活细胞分选，收集活细胞用于scRNA-seq。利用此方法，我们成功鉴定了多种肠道细胞类型，包括上皮细胞、基质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞。因此，我们认为该方法是利用斑马鱼研究健康与疾病状态下胃肠道组成的宝贵资源。

引言

胃肠道（GI）是一个复杂的系统，在整体健康和生理功能中起着至关重要的作用。它负责营养物质的消化与吸收，以及代谢废物的排出^1,2。胃肠道由多种细胞类型组成，包括上皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞以及肠神经系统（ENS），这些细胞之间密切相互作用，共同调控并维持肠道的正常功能^3,4,5。胃肠道发育过程中的缺陷可能对营养吸收、微生物群组成、肠-脑轴以及肠神经系统等多个方面产生广泛影响，从而导致多种肠神经肌肉疾病，例如先天性巨结肠症和慢性假性肠梗阻^6,7。这些疾病的主要特征是由于卡哈尔间质细胞、平滑肌细胞以及肠神经系统等关键细胞发生改变，引起严重的肠道运动功能障碍^6,8,9。然而，胃肠道发育及其功能障碍背后的分子机制目前仍知之甚少。

斑马鱼因其快速的胚胎发育、在胚胎期和幼体期具有透明性以....

方案

所有斑马鱼的饲养和实验均按照伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）的机构指南和动物福利法规进行。根据荷兰法规，使用受精后5天的斑马鱼幼鱼属于无需正式伦理审批的实验类别。

1. 获取受精后5天（dpf）的野生型及tg(phox2bb:GFP)幼鱼

1. 设置野生型斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中用HEPES缓冲的E3培养基（以下简称E3）收集50枚卵。将这些鱼用作荧光激活细胞分选（FACs）的阴性对照。
2. 设置tg(phox2bb:GFP)斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中的E3培养基中收集约300枚卵。
3. 将受精卵置于E3培养基中（每皿最多50枚卵），在28.5 °C的培养箱中以14小时光照/10小时黑暗的循环条件下培养。
4. 在受精后1天（1 dpf）时去除未受精卵，让受精卵继续发育至5天（5 dpf）。
5. 在受精后1天（1 dpf）时挑选tg(phox2bb:GFP)转基因幼鱼。

2. 野生型完整幼虫的解离

1. 用0.016%三卡因麻醉5 dpf幼鱼。
2. 在含有1 mL 10x胰蛋白酶-EDTA溶液的培养皿中，用剃刀片将30条斑马鱼切成小块。

结果

通过本方案，我们成功地从5 dpf幼鱼中完整分离并解离了整个肠道。使用木瓜蛋白酶（papain）作为解离酶，显著提高了细胞活力，从而在244个分离的肠道样本中捕获到46,139个单个活细胞事件（占所有细胞的6.4%）（图2A）。以野生型整条幼鱼作为对照，确保分选过程得到优化，实现有效的细胞识别与分选。由于仅对活的单细胞进行分选，因此可使用整条幼鱼作为对照（补充图S1B-E）。所有分选出的肠细胞随后被送入单细胞RNA测序（scRNA-seq）平台。共测序获得9,858个细胞，每个细胞平均读长数为21,106。在scRNA-seq数据分析中，我们采用了Seurat V3¹⁷。总共鉴定出48个聚类，代表12种不同的细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞¹⁸。

讨论

本文介绍了一种利用流式细胞分选（FACS）技术分离和解离5天龄斑马鱼幼鱼肠道的方法。通过该方法，我们成功地从tg(phox2bb:GFP)斑马鱼品系中收集并分析了不同类型的肠细胞，并结合10x Genomics Chromium平台进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图2D）。我们选择该转基因品系，是因为GFP标记可作为肠神经系统（ENS）细胞存活的指示，从而确认这些细胞也能被有效分离。然而需要强调的是，本方法可轻松拓展至其他感兴趣的斑马鱼品系，因为我们仅利用phox2bb信号用于评估神经元的存活状态，而非用于特异性筛选某一细胞亚群。由于本研究采用无偏倚策略以收集5 dpf时期存在的全部肠细胞，分选标准主要依赖于识别存活的单个细胞。这也是我们使用整条幼鱼来建立可靠且一致的门控策略的原因。考虑到分离单个肠道所耗费的人力，若在本实验的时间范围内额外分离大量肠道作为阴性对照，将不具备可行性。因此，尽管我们承认整条幼鱼中的细胞类型与肠道组织中的细胞类型存在差异，且采用了不同的解离方法，但值得注意的是，用于分选肠道细胞的门控策略可首先通过整条幼鱼样本进行初.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 胰蛋白酶 (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
带细胞筛帽的5 mL 圆底管	Falcon	352235
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon 5 mL 圆底管（FACS 管），带扣盖	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	货号#D-9542
解剖显微镜	Olympus SZX16
FACSAria III 分选仪	BD Biosciences	N/A
含 CaCl2 和 MgCl2 的 HBSS	Gibco	14025050
昆虫针	Fine Science Tools	26000-25
L-半胱氨酸	Sigma	C7352
MS-222，三卡因	Supelco	A5040-250G
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart 等 （2019）	N/A
台盼蓝	Sigma	货号#T8154