斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

摘要

本文介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以进行单细胞RNA测序分析的方法。

摘要

胃肠道（GI）在维持生命方面执行多种重要功能。影响其发育的先天性缺陷可导致肠神经肌肉系统疾病，这凸显了理解胃肠道发育及其功能障碍相关分子机制的重要性。在本研究中，我们介绍了一种从受精后5天的斑马鱼幼鱼中分离肠道以获得活体组织的方法， 可用于单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的活细胞。该方案基于斑马鱼肠道的手动解剖，随后使用木瓜蛋白酶进行酶解离。接着对细胞进行荧光激活细胞分选，收集活细胞用于scRNA-seq。利用此方法，我们成功鉴定了多种肠道细胞类型，包括上皮细胞、基质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞。因此，我们认为该方法是利用斑马鱼研究健康与疾病状态下胃肠道组成的宝贵资源。

引言

胃肠道（GI）是一个复杂的系统，在整体健康和生理功能中起着至关重要的作用。它负责营养物质的消化与吸收，以及代谢废物的排出^1,2。胃肠道由多种细胞类型组成，包括上皮细胞、平滑肌细胞、免疫细胞以及肠神经系统（ENS），这些细胞之间密切相互作用，共同调控并维持肠道的正常功能^3,4,5。胃肠道发育过程中的缺陷可能对营养吸收、微生物群组成、肠-脑轴以及肠神经系统等多个方面产生广泛影响，从而导致多种肠神经肌肉疾病，例如先天性巨结肠症和慢性假性肠梗阻^6,7。这些疾病的主要特征是由于卡哈尔间质细胞、平滑肌细胞以及肠神经系统等关键细胞发生改变，引起严重的肠道运动功能障碍^6,8,9。然而，胃肠道发育及其功能障碍背后的分子机制目前仍知之甚少。

斑马鱼因其快速的胚胎发育、在胚胎期和幼体期具有透明性以及易于进行遗传操作，成为研究胃肠道发育与功能障碍的宝贵模式生物^{10,11,12,13,14}。目前已开发出多种表达荧光蛋白的转基因斑马鱼品系。其中一种典型品系为tg(phox2bb:GFP)斑马鱼，常用于研究肠神经系统（ENS），因为所有phox2bb+细胞（包括肠神经元）均被标记^15,16。本文中，我们利用tg(phox2bb:GFP)斑马鱼品系，介绍一种针对受精后5天（dpf）幼鱼肠道组织进行分离以开展单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的方法（图1）。

方案

所有斑马鱼的饲养和实验均按照伊拉斯姆斯医学中心（Erasmus MC）的机构指南和动物福利法规进行。根据荷兰法规，使用受精后5天的斑马鱼幼鱼属于无需正式伦理审批的实验类别。

1. 获取受精后5天（dpf）的野生型及tg(phox2bb:GFP)幼鱼

1. 设置野生型斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中用HEPES缓冲的E3培养基（以下简称E3）收集50枚卵。将这些鱼用作荧光激活细胞分选（FACs）的阴性对照。
2. 设置tg(phox2bb:GFP)斑马鱼的繁殖，并在15 cm培养皿中的E3培养基中收集约300枚卵。
3. 将受精卵置于E3培养基中（每皿最多50枚卵），在28.5 °C的培养箱中以14小时光照/10小时黑暗的循环条件下培养。
4. 在受精后1天（1 dpf）时去除未受精卵，让受精卵继续发育至5天（5 dpf）。
5. 在受精后1天（1 dpf）时挑选tg(phox2bb:GFP)转基因幼鱼。

2. 野生型完整幼虫的解离

1. 用0.016%三卡因麻醉5 dpf幼鱼。
2. 在含有1 mL 10x胰蛋白酶-EDTA溶液的培养皿中，用剃刀片将30条斑马鱼切成小块。
3. 将切碎的斑马鱼转移至微量离心管中，加入10x胰蛋白酶-EDTA溶液至总体积为2 mL，冰上放置3小时。每隔1小时用P1000移液器吹打混匀，以促进组织解离。

3. 肠道分离

1. 在解剖显微镜下，将6-10条用0.016%三卡因麻醉的5 dpf幼鱼并排放置于1.8%琼脂糖平板（25 mL E3中含0.45 g琼脂糖）上。
2. 用一根昆虫针固定斑马鱼头部。
3. 用纸巾彻底去除残留的E3溶液。
4. 使用另一根昆虫针分离肠道，注意不要扰动其他器官。确保卵黄已完全去除（补充图S1A）。
5. 肠道分离后，检查并根据需要去除所有非肠道组织（如皮肤、脂肪、肝脏）。
6. 用镊子收集肠道，放入预冷的含磷酸盐缓冲液（PBS）和10%胎牛血清（FCS）的微量离心管中，置于冰上。
   ​注意：应至少分离244个肠道，总解剖时间控制在3小时内。两人并行操作可实现此目标。

4. 肠道解离

1. 在取出所有肠道组织后，立即将微量离心管以最高速度（13,800 × g）离心30秒。
2. 吸除PBS/10% FCS，但保留少量液体（约100 µL），以防止肠道组织干燥。加入500 µL含有CaCl₂和MgCl₂的HBSS溶液，其中含2.17 mg/mL木瓜蛋白酶，用于细胞解离。
3. 加入2.5 µL半胱氨酸（1 M）以激活木瓜蛋白酶。
4. 将肠道组织置于37 °C水浴中孵育10分钟。在孵育5分钟时，用移液器轻轻吹打混匀一次，以促进酶解消化组织。
5. 使用预先用0.5 mL PBS/10% FCS润湿的35 µm细胞筛，将细胞转移至FACS管中。
6. 分次每次0.5 mL，共加入2 mL PBS/10% FCS洗涤细胞筛。
7. 在4 °C下以700 × g离心5分钟。
8. 弃去上清液，将沉淀重悬于300 µL PBS/10% FCS中。
9. 加入终浓度为1 µg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1,000稀释），标记死细胞，并孵育5分钟，以便在流式细胞分选（FACS）过程中排除死细胞。

5. FACS 富集

1. 使用野生型样本在流式细胞仪上记录3,000 个细胞，以设定待分选细胞群的门控参数（补充图 S1B-E）。
2. 使用100 µm 喷嘴，将分选精度设置为纯度模式，并将含有 200 µL PBS/5% FCS 的收集管放入 FACS 仪器中。
3. 加载肠道细胞悬液，并通过排除双联体（图 2B）和死细胞（图 2C），将活的（DAPI 阴性）单细胞分选至收集管中（图 2C）。
   注意：对于 tg(phox2bb) 斑马鱼，GFP⁺ 细胞的比例仅作参考，所有活的单细胞均会被分选。
4. 细胞分选后，立即将收集管置于冰上保存。
5. 使用血细胞计数板对细胞悬液进行计数，并用台盼蓝进行活力检测。若细胞活力至少达到 80%，则继续下一步操作。
6. 此时细胞已准备好用于单细胞 RNA 测序（scRNAseq）（例如 10x Genomics Chromium 平台）。每样本使用约 20,000 个细胞。

结果

通过本方案，我们成功地从5 dpf幼鱼中分离并解离出完整的肠道。使用木瓜蛋白酶作为解离酶，显著提高了细胞活力，使得在244个分离的肠道中，共捕获到46,139个单个活细胞事件（占所有细胞的6.4%）（图2A）。以野生型整条幼鱼作为对照，确保分选过程得到优化，从而实现有效的细胞识别与分选。由于仅对活的单细胞进行分选，因此可直接使用整条幼鱼进行实验（补充图S1B-E）。所有分选出的肠细胞随后均提交至单细胞RNA测序平台。总共对9,858个细胞进行了测序，每个细胞的平均测序读长为21,106。在单细胞RNA测序分析中，我们采用了Seurat V3¹⁷。共鉴定出48个聚类，代表12种不同的细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞以及肠神经元和胶质细胞¹⁸。

讨论

本文介绍了一种利用流式细胞分选（FACS）技术分离和解离5天龄斑马鱼幼鱼肠道的方法。通过该方法，我们成功地从tg(phox2bb:GFP)斑马鱼品系中收集并分析了不同类型的肠细胞，并结合10x Genomics Chromium平台进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析（图2D）。我们选择该转基因品系，是因为GFP标记可作为肠神经系统（ENS）细胞存活的指示，从而确认这些细胞也能被有效分离。然而需要强调的是，本方法可轻松拓展至其他感兴趣的斑马鱼品系，因为我们仅利用phox2bb信号用于评估神经元的存活状态，而非用于特异性筛选某一细胞亚群。由于本研究采用无偏倚策略以收集5 dpf时期存在的全部肠细胞，分选标准主要依赖于识别存活的单个细胞。这也是我们使用整条幼鱼来建立可靠且一致的门控策略的原因。考虑到分离单个肠道所耗费的人力，若在本实验的时间范围内额外分离大量肠道作为阴性对照，将不具备可行性。因此，尽管我们承认整条幼鱼中的细胞类型与肠道组织中的细胞类型存在差异，且采用了不同的解离方法，但值得注意的是，用于分选肠道细胞的门控策略可首先通过整条幼鱼样本进行初...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x 胰蛋白酶 (0.5%)-EDTA (0.2%)	Sigma	59418C
带细胞筛帽的5 mL 圆底管	Falcon	352235
琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9539
BD Falcon 5 mL 圆底管（FACS 管），带扣盖	BD Biosciences	352054
Cell Ranger v3.0.2	10X Genomics	N/A
DAPI	Sigma-Aldrich	货号#D-9542
解剖显微镜	Olympus SZX16
FACSAria III 分选仪	BD Biosciences	N/A
含 CaCl2 和 MgCl2 的 HBSS	Gibco	14025050
昆虫针	Fine Science Tools	26000-25
L-半胱氨酸	Sigma	C7352
MS-222，三卡因	Supelco	A5040-250G
木瓜蛋白酶	Sigma	P4762
Seurat v3	Stuart 等 （2019）	N/A
台盼蓝	Sigma	货号#T8154