用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

摘要

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。

摘要

溶质载体（SLCs）是一类膜转运蛋白，负责介导多种内源性和外源性底物的进出，包括离子、营养物质、代谢物、神经递质以及药物。尽管SLCs已成为颇具吸引力的治疗靶点和疾病标志物，但目前的药物对其靶向作用仍相对有限。由于对这类膜整合蛋白的结构、功能及生理学认知尚不充分，针对这些转运蛋白的药物研发进展受到阻碍，而这一局限的根本原因在于此类蛋白在表达与纯化方面的技术困难。本文展示了利用以下方法获取高纯度、毫克级人源SLC转运蛋白的技术方案 密码子优化的基因序列。结合对表达载体设计的系统性探索和高通量表达，这些方案可确保目标蛋白的结构完整性和生物化学活性得以保留。我们还强调了真核细胞表达、亲和纯化以及尺寸排阻色谱过程中这些蛋白的关键操作步骤。最终，该工作流程可获得高纯度、功能活性稳定的目标蛋白，适用于高分辨率结构解析、转运研究、小分子结合活性检测以及高通量筛选。 体外 筛选

引言

膜蛋白长期以来一直是研究人员和制药工业共同关注的研究靶点。其中，溶质载体（SLC）家族是人类基因组中编码的400多个继发性转运蛋白基因组成的家族¹。这些转运蛋白参与多种分子的导入和导出，包括离子²、神经递质³、脂类^4,5,6,7、氨基酸⁸、营养物质^9,10,11以及药物¹²。由于底物范围广泛，这些蛋白还通过毒素的转运¹³、滥用药物的转运及其抑制作用^14,15或有害突变¹⁶等方式参与多种病理生理过程。细菌同源蛋白已被用作多个SLC家族基本转运机制的原....

方案

注意：所有密码子优化的 RESOLUTE SLC 基因均已存入 AddGene⁴³，相关链接可在 RESOLUTE 公共试剂列表中获取⁴⁴。这些基因已克隆至 pDONR221 质粒中，可通过重组克隆技术将基因直接克隆至目的载体⁴⁵。为最大程度实现并行操作，分别以微孔板形式培养细菌、昆虫和哺乳动物细胞，用于杆状病毒基因组（bacmid）制备（第 3 节）、杆状病毒扩增（第 5 节）和表达检测（第 6 节）。在上述步骤中，需使用微型表达摇床 以确保充分混匀和通气。

1. 将SLC基因（高通量）克隆至pHTBV1.1杆状病毒载体

注意：克隆步骤采用重组克隆方案，通过热激法高效克隆并转化至大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）⁴⁶。该方案适用于多种目标或构建体的高通量并行克隆，但也可轻松调整用于较小规模实验。

1. 在96孔板中，加入150 ng pDONR221 SLC克隆和100 ng pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW载体。用10 mM Tris（pH 8.0）将反应体系补至8 µL，然后加入2....

结果

SLC 基因可从 RESOLUTE pDONR 质粒克隆至 BacMam 载体，用于哺乳动物表达
所述克隆、表达和纯化方案已在多种蛋白折叠类型的多种 SLC 转运蛋白中成功应用。然而，该流程包含多个用于监测进展的关键节点，以便根据表达水平、蛋白折叠情况、脂质和去垢剂依赖性稳定性以及对缓冲液条件的敏感性差异进行优化。

SLC克隆与小规模表达过程中的检测点
在克隆步骤中，应使用琼脂糖凝胶电泳以确认PCR产物和酶切产物的正确大小。类似地，可通过菌落PCR反应验证Gateway反应和转座反应的结果。图 2A，B）。如有需要，可使用标准技术监测杆状病毒的产生^{49,50,51,.......}

讨论

由于缺乏对转运蛋白功能的系统性表征，靶向溶质载体（SLC）的治疗策略开发一直受到阻碍。尽管SLC在正常生理及病理生理过程中具有多种重要作用，但针对这一蛋白家族的药物数量却远少于G蛋白偶联受体（GPCR）和离子通道⁶³。RESOLUTE是一个国际性合作项目，旨在开发前沿的研究技术与工具，以加速并提升当前SLC研究的水平。作为RESOLUTE项目的一部分，我们建立了这些用于高效克隆、质粒筛选以及大规模表达与纯化人源SLC蛋白的实验方案。

本文描述了可扩展的SLC克隆与表达方法，这些方法已成功用于系统性研究人类SLC转运蛋白，包括假定的和孤儿SLC转运蛋白。值得注意的是，通过该方法纯化的SLC蛋白已在后续研究中成功应用于转运蛋白的结构、生物化学、功能、结合分子的生成以及小分子结合等研究。我们常规使用该方法纯化出毫克量级的多种SLC蛋白，在最佳条件下，整个实验流程（包括克隆和组织培养步骤）可在4至5周内完成。

我们的方法在经济性和并行性方面进行了优化，可系统地评估多个靶点。然而，通过使用.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3C 蛋白酶	本实验室制备
50 或 100 kDa 截留分子量离心浓缩管	Sartorius	VS0242
5-环己基-1-戊基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	C325	CYMAL-5
96 孔杆状病毒基因组纯化试剂盒	Millipore	LSKP09604	Montage 质粒小提试剂盒
96 孔板（2 mL）	Greiner Bio-One	780271
粘性塑料封膜	Qiagen	19570	Tape Pads
琼脂糖凝胶过滤色谱柱	Cytiva	29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL
苯并核酸酶（Benzonase DNA酶）	本实验室制备
BisTris	Sigma Aldrich	B9754
胆固醇半琥珀酸三羟甲基氨基甲烷盐	Anatrace	CH210	CHS
钴金属亲和树脂	Takara Bio	635653	TALON 金属亲和树脂
D-(+)-生物素	Sigma Aldrich	851209
葡聚糖-琼脂糖凝胶过滤色谱柱	Cytiva	28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
皂苷	Apollo Scientific	BID3301
杜恩斯组织研磨器（40 mL）	DWK Life Sciences	357546
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	4693132001	cOmplete，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物
胎牛血清	Thermo Fisher	10500064
十二烷基胆碱磷酸酯（Fos-Choline-12）	Anatrace	F308S	FS-12
甘油	Sigma Aldrich	G5516
糖基双氢麦角甾醇	Anatrace	GDN101	GDN
重力流层析柱	Cole-Parmer	WZ-06479-25
HEK293 培养基	Thermo Fisher	12338018	FreeStyle 293 培养基
HEPES	Apollo Scientific	BI8181
亲水性中性硅胶超高效液相色谱柱	Sepax	231300-4615	Unix-C SEC-300 4.6 x 150
咪唑	Sigma Aldrich	56750
昆虫细胞转染试剂	Sigma Aldrich	71259	Reagent
月桂基麦芽糖新戊二醇	Anatrace	NG310	LMNG
六水合氯化镁	Sigma Aldrich	M2670
微型表达摇床	Glas-Col	107A DPMINC24CE
NaCl	Sigma Aldrich	S9888
n-癸基-β-D-麦芽糖苷	Anatrace	D322	DM
n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷	Anatrace	D310	DDM
n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物	Anatrace	D360	LDAO
n-壬基-β-D-葡萄吡喃糖苷	Anatrace	N324S	NG
n-辛基-d17-β-D-葡萄吡喃糖苷	Anatrace	O311D	OGNG
八乙二醇单十二醚	Anatrace	O330	C12E8
辛基葡萄糖新戊二醇	Anatrace	NG311	OGNG
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	D8537	DPBS
聚氧乙烯(10)十二醚	Anatrace	AP1210	C12E10
聚氧乙烯(9)十二醚	Anatrace	APO129	C12E9
组织培养板用多孔透气封膜	VWR	60941-084	生物培养用棉绒膜
蛋白酶 K	New England Biolabs	P8107S
重组酶混合物	Thermo Fisher	11791020	Gateway LR Clonase II
无血清昆虫细胞培养基	Gibco	10902088	Sf-900 II 无血清培养基
丁酸钠	Sigma Aldrich	303410
24 头探头超声破碎仪	Sonics	630-0579
超声破碎仪主机	Sonics	VCX 750
Strep-Tactin 树脂	IBA Life Sciences	2-5030-025	Strep-TactinXT 4Flow 高容量树脂
蔗糖	Sigma Aldrich	S7903
单十二烷酸蔗糖酯	Anatrace	S350	DDS
悬浮培养适应型 HEK293 细胞	Thermo Fisher	A14527	Expi293F
转染试剂	Sigma Aldrich	70967	GeneJuice 转染试剂