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方法文章

用于结构与生化研究的人类溶质载体的高通量表达与纯化

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DOI：

10.3791/65878

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2023年9月29日

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1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

本文内容

摘要

对人源膜转运蛋白进行结构与生化研究需要获得毫克量级的稳定、完整且均一的蛋白质。本文介绍了利用密码子优化基因进行人源溶质载体转运蛋白的筛选、表达和纯化的可扩展方法。

摘要

溶质载体（SLCs）是一类膜转运蛋白，负责介导多种内源性和外源性底物的进出，包括离子、营养物质、代谢物、神经递质以及药物。尽管SLCs已成为颇具吸引力的治疗靶点和疾病标志物，但目前的药物对其靶向作用仍相对有限。由于对这类膜整合蛋白的结构、功能及生理学认知尚不充分，针对这些转运蛋白的药物研发进展受到阻碍，而这一局限的根本原因在于此类蛋白在表达与纯化方面的技术困难。本文展示了利用以下方法获取高纯度、毫克级人源SLC转运蛋白的技术方案 密码子优化的基因序列。结合对表达载体设计的系统性探索和高通量表达，这些方案可确保目标蛋白的结构完整性和生物化学活性得以保留。我们还强调了真核细胞表达、亲和纯化以及尺寸排阻色谱过程中这些蛋白的关键操作步骤。最终，该工作流程可获得高纯度、功能活性稳定的目标蛋白，适用于高分辨率结构解析、转运研究、小分子结合活性检测以及高通量筛选。 体外 筛选

引言

膜蛋白长期以来一直是研究人员和制药工业共同关注的研究靶点。其中，溶质载体（SLC）家族是人类基因组中编码的400多个继发性转运蛋白基因组成的家族1。这些转运蛋白参与多种分子的导入和导出，包括离子2、神经递质3、脂类4,5,6,7、氨基酸8、营养物质9,10,11以及药物12。由于底物范围广泛，这些蛋白还通过毒素的转运13、滥用药物的转运及其抑制作用14,15或有害突变16等方式参与多种病理生理过程。细菌同源蛋白已被用作多个SLC家族基本转运机制的原型17,18,19,20,21,22,23,24,25。与人类蛋白相比，原核生物正源蛋白通常在结构明确的大肠杆菌（Escherichia coli）表达系统中表达效果更好26,27，并且在较小的去垢剂中更稳定，有利于获得有序晶体用于X射线晶体学分析28。然而，序列和功能上的差异使得这些远缘相关蛋白在药物发现中的应用变得复杂29,30。因此，通常需要直接研究人类蛋白，以阐明靶向SLC药物的作用机制31,32,33,34,35。尽管近年来冷冻电子显微镜（Cryo-EM）的进步使得SLC蛋白在更接近天然状态下的结构表征成为可能36,37，但这些蛋白在表达和纯化方面的困难仍然是开发靶向治疗药物和诊断工具的主要挑战。

为缓解这一挑战，RESOLUTE 联盟（re-solute.eu）开发了用于大规模表达和纯化人类 SLC 家族蛋白的资源与方案38。从密码子优化的基因出发，我们建立了SLC构建体的高通量克隆与筛选方法。这些方法被系统地应用于整个SLC家族，将基因克隆至BacMam病毒表达系统中，并在人源细胞系中检测蛋白表达情况39，所用技术基于此前报道的高通量克隆与表达检测方法40。简而言之，SLC 基因从 pDONR221 质粒克隆至 pHTBV1.1 载体中。该构建体随后用于将目的基因转座至杆状病毒载体（bacmid），以转染昆虫细胞，该载体包含巨细胞病毒（cytomegalovirus）启动子及增强子元件，可在哺乳动物细胞中实现表达。所获得的杆状病毒可用于转导哺乳动物细胞，以表达目标 SLC 蛋白。

我们进一步开发了用于大规模表达和稳定纯化选定溶质转运蛋白（SLC）的标准化方法（图1）。该方案包含多个检查点，以促进有效的问题排查并减少实验间的变异性。值得注意的是，通过Strep标签和绿色荧光蛋白（GFP）标签的辅助，实现了对蛋白表达与定位的常规监测，以及针对各个靶标的小规模纯化条件优化41,42。

最终，这些化学纯度高且结构均一的蛋白质样品可用于X射线晶体学或冷冻电子显微镜（Cryo-EM）进行结构解析、生化靶点结合实验、作为抗原免疫以生成结合分子，以及通过重组到化学成分明确的脂质体中开展无细胞功能研究。

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方案

注意：所有密码子优化的 RESOLUTE SLC 基因均已存入 AddGene43，相关链接可在 RESOLUTE 公共试剂列表中获取44。这些基因已克隆至 pDONR221 质粒中，可通过重组克隆技术将基因直接克隆至目的载体45。为最大程度实现并行操作，分别以微孔板形式培养细菌、昆虫和哺乳动物细胞，用于杆状病毒基因组（bacmid）制备（第 3 节）、杆状病毒扩增（第 5 节）和表达检测（第 6 节）。在上述步骤中，需使用微型表达摇床 以确保充分混匀和通气。

1. 将SLC基因（高通量）克隆至pHTBV1.1杆状病毒载体

注意：克隆步骤采用重组克隆方案，通过热激法高效克隆并转化至大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）46。该方案适用于多种目标或构建体的高通量并行克隆，但也可轻松调整用于较小规模实验。

  1. 在96孔板中，加入150 ng pDONR221 SLC克隆和100 ng pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW载体。用10 mM Tris（pH 8.0）将反应体系补至8 µL，然后加入2 µL重组酶混合液。
  2. 室温孵育1小时，加入1 µL蛋白酶K，37 °C孵育30分钟。
  3. 使用4 µL反应混合物转化50 µL感受态细胞 E. coli 使用热激法处理MACH-1细胞46 并使用 SOC 培养基进行复苏。涂布于含有 5% 蔗糖的 LB 琼脂平板，或补充有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 SOC 琼脂平板。
  4. 鉴定含有 pHTBV1.1 载体的菌落 SLC 使用适当的引物进行基因插入（参见 表1以及菌落PCR的标准实验方案47.
  5. 使用质粒小提试剂盒从含有目的基因的单菌落中纯化重组质粒。

2. 转座

注意：以下步骤用于将 SLC 基因从 pHTBV1.1 载体转座至杆状病毒 bacmid 中，以在 Sf9 细胞中生成 BacMam 杆状病毒。采用热激法46，将 pHTBV1.1 载体转化至含有亲本 bacmid（带有 lacZ-mini-attTn7 融合序列）的 DH10Bac 感受态 E. coli 细胞中。在辅助质粒提供的转座蛋白存在下，pHTBV1.1 载体与亲本 bacmid 之间发生转座事件48。本方案中所用溶液的组成见表 2。

  1. 取 3 µL 浓度为 100–200 ng/µL 的纯化 pHTBV1.1 载体 DNA，使用热激法在 96 孔 PCR 板中转化 DH10Bac 感受态细胞。将细胞置于恢复培养基中，在 37 °C、700 rpm 条件下于微型表达摇床中振荡培养 4–5 小时，进行复苏。
  2. 取 50 µL 转化后的细胞涂布于 DH10Bac 筛选平板上。用锡箔纸包裹平板后，在 37 °C 培养 48 小时。
  3. 挑取单个白色菌落（含重组 DNA），划线稀释培养。在 37 °C 过夜培养。

3. 高通量杆状病毒质粒制备

注意：该方案描述了使用96孔板bacmid纯化试剂盒提取bacmid的步骤。

  1. 将单个白色菌落（从划线稀释平板上分离）接种至含有1 mL 2x LB培养基（表2）的96深孔板各孔中。
  2. 用透气封膜覆盖，于37 °C、700 rpm条件下在微型表达摇床中过夜培养。
  3. 通过将120 µL培养物与30 µL 60%甘油在微孔板中混合制备细胞甘油菌种，并于-80 °C保存。
  4. 将深孔板在2,600 × g条件下离心30分钟。将上清液倾倒至合适的去污容器中。将深孔板倒置并在纸巾上轻轻敲击。使用多通道移液器向深孔板的每个孔中加入250 µL溶液1。
  5. 重悬沉淀；如有必要，使用多通道移液器操作。
  6. 向每个孔中加入250 µL溶液2，并用硅胶垫密封。轻柔翻转5次，室温孵育10分钟。短暂离心。
  7. 加入300 µL溶液3，并用硅胶垫密封。通过翻转5次轻轻但彻底地混匀。
  8. 将样品置于冰上20分钟，然后在4 °C、2,600 × g条件下离心30分钟。
  9. 将澄清的上清液转移至新的96深孔板中。再次在4 °C、2,600 × g条件下离心30分钟。
  10. 在新的96深孔板中，每孔加入0.8 mL 100%异丙醇。再向每孔加入对应孔的0.8 mL上清液。
  11. 使用移液器轻轻吹打混匀，然后在冰上孵育30分钟或4 °C过夜，以获得更多的杆状病毒基因组DNA（bacmid）。
  12. 在4 °C、2,600 × g条件下离心30分钟。
  13. 在生物安全柜内，用70%乙醇喷洒深孔板外表面，打开深孔板，弃去上清液。
  14. 向每个孔中加入500 µL 70%乙醇（v/v），并轻轻敲击深孔板以洗涤沉淀。用粘性塑料封膜密封后，在4 °C、2,600 × g条件下离心30分钟。
  15. 在生物安全柜内打开深孔板，弃去上清液。将深孔板非常轻柔地在纸巾上轻敲以去除乙醇。将深孔板在通风橱内干燥1–2小时，或置于50 °C烘箱中干燥。
  16. 加入50 µL无菌TE缓冲液以重悬bacmid DNA，并 使用粘性塑料封膜密封。将内容物转移至V型底微孔板中。bacmid DNA可在4 °C保存至测试纯化完成，之后应转移至-20 °C保存。
    注：虽然通常不进行定量检测，但一般可获得500至2,000 ng/µL的bacmid DNA产量。
  17. 采用标准菌落PCR方法47，并使用以下载体引物筛选成功插入目标基因的bacmid：
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    ​注：扩增产物长度将比目标基因长约700 bp。

4. 转染

注意：这些步骤用于将产生的杆状病毒质粒转染入Sf9昆虫细胞，从而使昆虫细胞生成杆状病毒颗粒（P0）。

  1. 在无血清昆虫细胞培养基中培养Sf9细胞，使其密度达到2.0–2.4 × 10⁶ 个/mL6 细胞/mL。将细胞稀释至 2 × 105 细胞/mL 的无血清昆虫细胞培养基中，并将1 mL稀释后的细胞悬液加入24孔组织培养板的每个孔中。需设置一个 仅转染试剂 以及一个 仅细胞 对照。将培养板置于湿润的培养箱中，在27 °C下孵育1小时，以促进细胞贴壁。
  2. 每孔加入38 µL无血清昆虫细胞培养基与2 µL转染试剂，混匀。将40 µL混合液加入96孔无菌平底微孔板中。每孔加入0.5–2.0 µg/µL的重组杆状病毒DNA 2 µL，盖好培养板，在生物安全柜中孵育15分钟。
  3. 向含有DNA-转染试剂混合物的微孔板各孔中加入160 µL无血清昆虫细胞培养基。
  4. 吸弃第4.1步中细胞的培养基。轻柔地将200 µL杆状病毒基因组转染试剂-培养基混合物加入细胞中，盖好培养板，在27 °C、湿润的培养箱中孵育4小时。
  5. 每孔加入 400 µL 添加了 2% FBS 的无血清昆虫培养基。为减少蒸发，将培养板放入干净的塑料袋中，但不要密封。在湿润的培养箱中 27 °C 培养 72 小时。
  6. 3 天后，将培养基从培养板转移至无菌 96 深孔板中，在 1,500 × g 室温孵育20分钟。将含有P0杆状病毒的澄清上清转移至无菌96深孔板中，避光保存于4 °C。

5. 杆状病毒-哺乳动物（BacMam）杆状病毒的扩增

注意：以下步骤用于将初始的 P0 杆状病毒扩增至更高滴度的病毒储备液，即 P1、P2 和 P3。最终的 P3 病毒滴度适用于转导和蛋白表达。为了提高效率并实现并行操作，本方案采用固定的体积比进行病毒扩增，该比例已通过实验优化。然而，如果后续转导的细胞在显微镜下未显示 GFP 荧光和细胞直径增大，或蛋白表达失败（见第 6 和第 8 节），则应在定量测定杆状病毒滴度后，针对每一步感染复数（MOI）较低的条件重新优化杆状病毒扩增方案，并通过 GFP 荧光显微镜观察细胞直径增大情况来监测感染效果49,50,51,52，以及通过 GFP 荧光显微镜监测感染过程53.

  1. 通过将Sf9细胞在无血清昆虫培养基中培养至密度为2 × 106 个细胞/mL，加入2% FBS，并将细胞接种至24孔深孔板中，每孔终体积为3 mL。向细胞中加入120 µL P0病毒原液。
  2. 将深孔板置于27 °C、450 rpm的微型表达摇床中孵育66–72小时。在室温下以1,500 × g 离心20分钟，收集上清液至96孔深孔板中。将上清液作为P1病毒原液，避光保存于4 °C。
  3. 在补充2% FBS的无血清昆虫培养基中培养50 mL Sf9细胞（细胞密度为2 × 106 个细胞/mL），加入250 µL P1病毒原液以制备P2病毒原液。将细胞在27 °C、110 rpm振荡条件下孵育。
  4. 感染66–72小时后，以1,500 × g 离心20分钟收集P2病毒原液，避光保存于4 °C。
  5. 使用1:200（v/v）的P2病毒原液感染所需体积的Sf9细胞（细胞密度为2 × 106 个细胞/mL），以制备P3病毒原液。将细胞在27 °C、110 rpm振荡条件下孵育。
  6. 感染66–72小时后，以1,500 × g 离心20分钟，通过收集上清液获得P3病毒原液，并避光保存于4 °C。

6. 表达检测的转导

注意：以下部分描述了小规模表达测试，可使用深孔板对多个构建体进行平行测试。

  1. 通过将200 g PEG 10,000和12 g NaCl溶解于600 mL双蒸水中，配制20%（w/v）聚乙二醇溶液2搅拌并定容至 1,000 mL。对溶液进行高压灭菌。
  2. 向24孔深孔板的各孔中加入300 µL收获的P1病毒液 向每个孔中加入75 µL PEG溶液。将板置于微型表达摇床中，在18 °C、300 rpm条件下振荡孵育5分钟，随后将板在4 °C过夜保存。
  3. 再次在18 °C、300 rpm条件下振荡孵育30分钟，然后在3,000 × g 孵育45分钟。在微生物安全柜中用移液器弃去上清液。
  4. 在HEK293培养基中制备悬浮适应的HEK293细胞，调整细胞密度至2 × 106 细胞/mL，向每孔含病毒沉淀的孔中接种3 mL，并补充 含 5 mM 丁酸钠。
  5. 在30 °C、8% CO条件下孵育该组织块2 在200-250 rpm条件下振荡培养72小时。
    注意：供应商推荐的 CO2 悬浮适应型和亲本HEK293细胞系在细胞培养过程中的浓度分别为8%和5%。
  6. 通过离心（900 × g）收集细胞 g 20 分钟 每孔加入 1 mL PBS 洗涤。
    注意：吸取10 µL重悬的细胞，在荧光显微镜下使用与GFP兼容的滤光立方观察细胞，以评估蛋白表达与定位情况。另吸取10–15 µL重悬的细胞，进行全细胞SDS-PAGE凝胶电泳，用于凝胶内GFP检测 荧光检测54.
  7. 再次以 900 × g 20分钟。将沉淀在-80 °C冷冻。

7. 高通量小规模测试纯化

注意：以下步骤描述了在24孔板中进行快速测试纯化的流程，用于筛选单个SLC的表达水平。本方案所用溶液的组成见表2。

  1. 向收获的细胞每孔加入1 mL HT裂解缓冲液，使用24头探头在24孔板中冰上超声处理，总时长为4 min（工作循环：开3 s，停15 s）。
  2. 将内容转移至96深孔板，加入125 µL去垢剂储备液，用硅胶密封垫密封，在4 °C下轻轻旋转孵育1小时。或者，将十二烷基麦芽糖苷（DDM）和胆固醇半琥珀酸酯（CHS）直接加入24孔板中，置于4 °C摇床中孵育。
  3. 以 2600 × g 离心组织块 g 在 4 °C 下离心 20 分钟，将上清液转移至新的 96 深孔板中。
  4. 用裂解缓冲液预平衡高容量 Strep-Tactin 树脂，制备成 50% 的储存液。
  5. 向每个孔中加入 100 µL 重悬的树脂储备液。
  6. 用硅胶垫密封方块，4 °C旋转孵育2小时，然后 短暂离心（最高200 × g) 以去除附着在盖玻片上的液体。
  7. 将96孔滤板置于空板块上方，转移树脂/上清液混合物至滤板中。冲洗 将800 µL HT洗涤缓冲液加入深孔块的各孔中，并转移至滤膜块以收集最大量的树脂。
  8. 让缓冲液自然滴下，或在200 × g下短暂离心。 g 并收集穿流液。将滤板置于新的洗涤块上方，加入800 µL HT洗涤缓冲液洗涤树脂，使缓冲液自然滴落（或短暂离心）。重复此洗涤步骤两次。 并以 500 × g 离心该沉淀块 g 3分钟，以去除残留的HT洗涤缓冲液。
  9. 将滤板置于96孔微孔板上方，加入50 µL HT洗脱缓冲液，室温下振荡孵育10分钟。通过在500 × g 3 分钟。
  10. 将15 µL洗脱样品上样至考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，检测蛋白表达情况。将剩余洗脱液样品上样至尺寸排阻色谱（SEC）或荧光检测尺寸排阻色谱（FSEC）系统，以评估蛋白在DDM/CHS中的单分散性。

8. 大规模表达的转导

注意：以下步骤是 SLC 表达的标准 RESOLUTE 方案。针对不同靶标，还需进一步优化表达时间、孵育温度以及丁酸钠的浓度。此外，我们通常通过小规模实验测试不同体积比的 P3 病毒感染悬浮培养的 HEK293 细胞，以常规优化病毒感染复数（MOI）。该方法节省时间，利用现有技术和设备，并可直接评估预期的实验结果。然而，这种经验性方法在每次 P3 病毒扩增后均需重新优化，也可采用其他方法对杆状病毒颗粒进行定量49,50,51,52。

  1. 在HEK293培养基中扩大培养所需体积的悬浮适应型HEK293细胞。
  2. 将悬浮适应型HEK293细胞稀释至1 × 106 个细胞/mL，并在37 °C下培养24小时（2 L滚瓶转速为170 rpm，3 L滚瓶转速为105 rpm）。
  3. 每升细胞培养物中加入30 mL P3病毒，并添加5 mM丁酸钠。将细胞在37 °C孵育48小时，或在30 °C孵育72小时。
  4. 在孵育期间及孵育结束后，一个关键步骤是使用明场显微镜检查细胞，以确认是否存在微生物污染并评估细胞活力。使用与GFP兼容的滤光片组通过荧光显微镜评估蛋白表达与定位情况。
  5. 以900 × g 离心20分钟收集细胞。
  6. 用每升细胞培养物10–15 mL的PBS重悬细胞沉淀，再次以900 × g 离心20分钟洗涤细胞沉淀。
  7. 将细胞沉淀在液氮中速冻，并于-80 °C保存。

9. 蛋白质纯化

注意：以下是用于 5 L 细胞培养物的 SLC 纯化的标准 RESOLUTE 方法。针对每个 SLC 靶标，必须通过实验经验确定最适去垢剂。请预先配制基础缓冲液、去垢剂储备液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液以及 SEC 缓冲液（表 2）。有关已测试的标准去垢剂列表，请参见 表 3。洗涤缓冲液中的 ATP 和 MgCl2 可减少热休克蛋白的污染。

  1. 第1天
    1. 将冷冻的细胞沉淀在室温水浴中解冻。
    2. 用135 mL基础缓冲液和三片蛋白酶抑制剂混合片剂配制溶解缓冲液。待片剂完全溶解。
    3. 用溶解缓冲液重悬解冻后的细胞沉淀。每10–15 g细胞沉淀使用27 mL溶解缓冲液，加入DNase，并转移至预冷的Dounce匀浆器中。将匀浆器置于冰上，上下移动杵棒约20次，使溶液充分匀浆。
      注意：重悬体积需根据目标蛋白和细胞沉淀质量进行优化，因收获时细胞密度不同而有所差异。可按照生产商说明书添加商用DNase。也可根据已建立的方案在实验室内部表达并纯化DNase55。
    4. 加入去垢剂储备液至终浓度为1%。
      注意：优化蛋白纯化的一个关键步骤是确定适用于SLC溶解和纯化的最佳去垢剂，需通过实验经验确定。我们常规使用多种去垢剂，可单独使用或与琥珀酸胆固醇酯（cholesteryl hemisuccinate, CHS）联合使用，保持去垢剂与CHS的质量比为10:1。
    5. 将溶解混合液转移至50 mL锥形管中，4 °C下缓慢旋转孵育1小时。
    6. 在4 °C下以50,000 × g离心30分钟，收集上清液。
    7. 用基础缓冲液平衡4–6 mL Strep-Tactin树脂（柱床体积）。
    8. 将平衡后的树脂加入溶解后的上清液中，4 °C下旋转孵育2小时。
    9. 将溶液倒入重力流柱中，让溶液自然流过。
    10. 用Strep洗涤缓冲液以柱床体积30倍的总量分三次等体积洗涤树脂。
    11. 加入3–5 mL洗脱缓冲液，孵育15分钟，收集洗脱液。重复此步骤四次，每次单独收集洗脱组分。
      注意：从Strep-Tactin树脂上洗脱蛋白是一个关键步骤，每次加入洗脱缓冲液后需孵育15分钟。通常，由于残留洗涤缓冲液的稀释作用，第一次洗脱组分中蛋白浓度较低。因此，若需要更高的最终蛋白浓度，可弃去第一次洗脱组分。或者，也可通过SDS-PAGE分析所有连续洗脱组分中的蛋白浓度，以优化实验方案。
    12. 通过紫外吸收光谱法测定蛋白浓度，合并所需的洗脱组分，并按1:5（w/w）至1:10（w/w）的比例加入3C蛋白酶。
    13. 4 °C下缓慢旋转过夜。
      注意：步骤9.1.12和9.1.13 仅在需要去除GFP标签时才进行。若无需去除标签，可直接进入步骤9.2.4。此外，也可将蛋白在4 °C保存过夜，次日继续操作。对于稳定性较差的SLC蛋白，可能需要优化蛋白酶浓度、孵育时间和温度。3C蛋白酶在较宽的温度范围内均有活性，可根据不同SLC蛋白的特性进行优化。
  2. 第2天
    1. 用SEC缓冲液平衡2–4 mL钴金属亲和树脂（柱床体积）。
    2. 将平衡后的钴金属亲和树脂加入前一晚的3C酶切反应混合液中，4 °C下旋转孵育1小时。
    3. 将溶液倒入重力流柱中，收集穿流液（flowthrough）。
    4. 使用100 kDa截留分子量的离心过滤器，在4 °C下以3,000 × g离心浓缩穿流液，每5分钟轻轻混匀样品一次，直至达到所需的SEC上样体积。
    5. 使用SEC缓冲液平衡基于葡聚糖-琼脂糖的凝胶过滤层析柱。SEC操作应在4 °C（冷却室或冷房）中进行。
      注意：关键步骤：根据SLC的寡聚状态，可选用不同类型的层析柱（如基于琼脂糖的凝胶过滤柱）进行SEC。
    6. 将样品注入进样环，运行SEC程序，控制流速使柱压低于厂家规定的限值。使用自动组分收集器，在整个SEC运行过程中自动收集每0.3 mL的组分。
    7. 合并主峰组分，测定紫外吸收值，并使用100 kDa截留分子量的离心浓缩器在4 °C下以3,000 × g离心浓缩至所需体积或浓度。

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结果

SLC 基因可从 RESOLUTE pDONR 质粒克隆至 BacMam 载体，用于哺乳动物表达
所述克隆、表达和纯化方案已在多种蛋白折叠类型的多种 SLC 转运蛋白中成功应用。然而，该流程包含多个用于监测进展的关键节点，以便根据表达水平、蛋白折叠情况、脂质和去垢剂依赖性稳定性以及对缓冲液条件的敏感性差异进行优化。

SLC克隆与小规模表达过程中的检测点
在克隆步骤中，应使用琼脂糖凝胶电泳以确认PCR产物和酶切产物的正确大小。类似地，可通过菌落PCR反应验证Gateway反应和转座反应的结果。图 2A，B）。如有需要，可使用标准技术监测杆状病毒的产生49,50,51,...

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讨论

由于缺乏对转运蛋白功能的系统性表征，靶向溶质载体（SLC）的治疗策略开发一直受到阻碍。尽管SLC在正常生理及病理生理过程中具有多种重要作用，但针对这一蛋白家族的药物数量却远少于G蛋白偶联受体（GPCR）和离子通道63。RESOLUTE是一个国际性合作项目，旨在开发前沿的研究技术与工具，以加速并提升当前SLC研究的水平。作为RESOLUTE项目的一部分，我们建立了这些用于高效克隆、质粒筛选以及大规模表达与纯化人源SLC蛋白的实验方案。

本文描述了可扩展的SLC克隆与表达方法，这些方法已成功用于系统性研究人类SLC转运蛋白，包括假定的和孤儿SLC转运蛋白。值得注意的是，通过该方法纯化的SLC蛋白已在后续研究中成功应用于转运蛋白的结构、生物化学、功能、结合分子的生成以及小分子结合等研究。我们常规使用该方法纯化出毫克量级的多种SLC蛋白，在最佳条件下，整个实验流程（包括克隆和组织培养步骤）可在4至5周内完成。

我们的方法在经济性和并行性方面进行了优化，可系统地评估多个靶点。然而，通过使用...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

本工作在 RESOLUTE 项目内完成。RESOLUTE 项目获得了创新药物计划 2 联盟（IMI 2 Joint Undertaking）根据资助协议编号 777372 提供的资金支持。该联盟获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）的支持。本文仅反映作者的观点，IMI、欧盟或 EFPIA 均不对其中所含信息的任何使用承担责任。pHTBV 质粒由 Frederick Boyce 教授（哈佛大学）惠赠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3C 蛋白酶本实验室制备
50 或 100 kDa 截留分子量离心浓缩管SartoriusVS0242
5-环己基-1-戊基-β-D-麦芽糖苷AnatraceC325CYMAL-5
96 孔杆状病毒基因组纯化试剂盒MilliporeLSKP09604Montage 质粒小提试剂盒
96 孔板（2 mL）Greiner Bio-One780271
粘性塑料封膜Qiagen19570Tape Pads
琼脂糖凝胶过滤色谱柱Cytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
苯并核酸酶（Benzonase DNA酶）本实验室制备
BisTrisSigma AldrichB9754
胆固醇半琥珀酸三羟甲基氨基甲烷盐AnatraceCH210CHS
钴金属亲和树脂Takara Bio635653TALON 金属亲和树脂
D-(+)-生物素Sigma Aldrich851209
葡聚糖-琼脂糖凝胶过滤色谱柱Cytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
皂苷Apollo ScientificBID3301
杜恩斯组织研磨器（40 mL）DWK Life Sciences357546
无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich4693132001cOmplete，无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物
胎牛血清Thermo Fisher10500064
十二烷基胆碱磷酸酯（Fos-Choline-12）AnatraceF308SFS-12
甘油Sigma AldrichG5516
糖基双氢麦角甾醇AnatraceGDN101GDN
重力流层析柱Cole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 培养基Thermo Fisher12338018FreeStyle 293 培养基
HEPESApollo ScientificBI8181
亲水性中性硅胶超高效液相色谱柱Sepax231300-4615Unix-C SEC-300 4.6 x 150
咪唑Sigma Aldrich56750
昆虫细胞转染试剂Sigma Aldrich71259Reagent
月桂基麦芽糖新戊二醇AnatraceNG310LMNG
六水合氯化镁Sigma AldrichM2670
微型表达摇床Glas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-癸基-β-D-麦芽糖苷AnatraceD322DM
n-十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷AnatraceD310DDM
n-十二烷基-N,N-二甲基胺-N-氧化物AnatraceD360LDAO
n-壬基-β-D-葡萄吡喃糖苷AnatraceN324SNG
n-辛基-d17-β-D-葡萄吡喃糖苷AnatraceO311DOGNG
八乙二醇单十二醚
AnatraceO330C12E8
辛基葡萄糖新戊二醇AnatraceNG311OGNG
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichD8537DPBS
聚氧乙烯(10)十二醚AnatraceAP1210C12E10
聚氧乙烯(9)十二醚AnatraceAPO129C12E9
组织培养板用多孔透气封膜VWR60941-084生物培养用棉绒膜
蛋白酶 KNew England BiolabsP8107S
重组酶混合物Thermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
无血清昆虫细胞培养基Gibco10902088Sf-900 II 无血清培养基
丁酸钠Sigma Aldrich303410
24 头探头超声破碎仪Sonics630-0579
超声破碎仪主机SonicsVCX 750
Strep-Tactin 树脂IBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow 高容量树脂
蔗糖Sigma AldrichS7903
单十二烷酸蔗糖酯AnatraceS350DDS
悬浮培养适应型 HEK293 细胞Thermo FisherA14527Expi293F
转染试剂Sigma Aldrich70967GeneJuice 转染试剂

参考文献

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